一种平安树的组织培养及繁殖方法与流程

(一)技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其涉及一种平安树的组织培养和快速繁苗方法。通过这种方法，可以进行优良种苗规模生产。

(二)

背景技术：

平安树(cinnamomumkotoensekanehiraetsasaki)是樟科樟属常绿小乔木植物。平安树别名兰屿肉桂，主要分布在我国台湾、广东、江苏、安徽、浙江、江西、湖南、湖北、广西等地。植株叶、枝及树皮干具有芳香气,既是优美的盆栽观叶植物，又是非常漂亮的园林观景树。

平安树的繁殖主要采用播种繁殖和扦插繁殖，但是种子繁殖周期长，容易受季节和地区限制，繁殖系数低，无法满足生产和市场需求。而且平安树在种子繁殖过程中容易引起变异，种植过程中易感染病毒，致使其品种退化严重,并且病毒世代相传，逐年加重，许多平安树的优良品种资源得不到利用，直接影响了其质量，使平安树的经济效益受到一定影响。

生物技术的快速发展，特别是植物组织和细胞培养技术，为平安树的快速繁殖育种研究提供了重要基础。因此，发明一种快速高效的平安树繁殖方法是非常必要的。

目前国内外对平安树组织培养鲜有报道,本发明是以平安树腋芽做为外植体，以繁芽的方式直接诱导分化不定芽。通过这种途径获得的不定芽能有效避免继代增殖过程中出现的变异，更好地保持母株原有的优良性状。

(三)

技术实现要素：

本发明目的是提供一种平安树的组织培养和离体快速繁殖的方法，使得在短期内可以获得大量的优质平安树种苗，满足市场的需要。

本发明采用的技术方案是：

一种平安树组织培养及繁殖方法，所述方法按如下步骤进行：

(1)无菌材料的获得及诱导培养：切取长势良好、无病虫害的平安树幼嫩的腋芽，用自来水冲洗30～60min，然后在体积浓度为1％洗洁精的水溶液中振摇2～5min，用无菌水冲净；在超净工作台上用体积浓度70～75％乙醇水溶液浸泡30～60s，然后用混合消毒液浸泡10～20min，再用无菌水冲洗3～5遍；在灭菌的滤纸上吸干水分，用解剖刀剥取0.3～0.6cm的腋芽，然后将腋芽接种到装丛生芽诱导培养基的培养瓶中，盖上瓶盖并用封口膜封住瓶口，置于培养箱中，在24～26℃，光照1500～2500lx条件下培养15～25天；所述混合消毒液为体积比1：200的吐温20和84消毒液的混合液；所述丛生芽诱导培养基为添加6-ba(即6-苄氨基嘌呤)0.5～2.0mg/l、naa(即萘乙酸)0.1～1.0mg/l和谷氨酰胺50～100mg/l的ms基本培养基；

(2)芽的增殖：观察步骤(1)所述24～26℃，光照1500～2500lx条件下培养15～25天后出现绿色突起，20～40天后出现丛生芽，再培养10～20天，当丛生芽长到2～4cm时，将不定芽切下转接到芽增殖培养基中，在24～26℃，光照1500～2500lx条件下进行增殖培养，获得丛生苗；所述芽增殖培养基为添加6-ba0.5～1.5mg/l、naa0.1～0.5mg/l、谷氨酰胺50～100mg/l和酵母浸出物200mg/l～800mg/l的ms基本培养基；

(3)生根培养：将分化的丛生苗从基部切下，插入生根培养基中培养至芽生根，所述的生根培养基为改良的1/2ms培养基中加入0.05mg/l～0.5mg/l的naa,50mg/l～100mg/l的谷氨酰胺；

(4)生根苗的移栽：待小苗叶片舒展，叶色浓绿，苗高3-5cm左右打开瓶盖炼苗2-4d即可进行移栽。移栽前将植株上的琼脂和杂物洗净，移栽与经0.1％高锰酸钾消毒过的育苗基质上，浇透定根水，盖上薄膜，保持湿度80％以上，置通风阴凉处，在24～26℃、光照1500～2500lx条件下培养，并定期进行喷药预防病虫害的发生。所述移栽基质为细沙、腐殖土与谷糠灰按照质量比5：2：2的比例配置而成，所述移栽基质的消毒方法为：采用体积浓度0.5％福尔马林水溶液均匀喷洒基质，塑料薄膜覆盖3～5天后揭开薄膜再曝晒基质1～3天，完成对移栽基质的消毒，或者采用体积浓度0.5％福尔马林水溶液均匀喷洒基质，塑料薄膜覆盖3～5天后揭开薄膜再在60℃下干燥2天，完成对移栽基质的消毒。

进一步，步骤(1)所述丛生芽诱导培养基为添加6-ba1.0mg/l、naa0.5mg/l和谷氨酰胺80mg/l的ms基本培养基。

进一步，步骤(2)所述的芽增殖培养基为添加6-ba1.0mg/l、naa0.3mg/l、谷氨酰胺80mg/l和酵母浸出物500mg/l的ms基本培养基。

进一步，步骤(3)所述的生根培养基为改良的1/2ms培养基中加入0.2mg/l的naa和80mg/l的谷氨酰胺。

进一步，所述的ms基本培养基终浓度组成为：nh4no31.65克/升、kno31.9克/升、cacl2·2h2o0.44克/升、mgso4·7h2o0.37克/升、kh2po40.17克/升、ki0.83毫克/升、h3bo36.2毫克/升、mnso4·4h2o22.3毫克/升、znso4·7h2o8.6毫克/升、na2moo4·2h2o0.25毫克/升、cuso4·5h2o0.025毫克/升、cocl2·6h2o0.025毫克/升、na2edta37.3毫克/升、feso4·7h2o27.8毫克/升、肌醇100毫克/升、甘氨酸2毫克/升、盐酸硫胺素0.1毫克/升、盐酸吡哆醇0.5毫克/升、烟酸0.5毫克/升、蔗糖20～40克/升、琼脂粉7～11克/升，溶剂为水，ph为5.6～6.0。

更进一步，本发明所述一种平安树组织培养及繁殖方法推荐按照以下步骤进行：

(1)无菌材料的获得及诱导培养：切取长势良好、无病虫害的平安树幼嫩的腋芽，用自来水冲洗45min，然后在体积浓度为1％洗洁精的水溶液中振摇3min，用无菌水冲净；在超净工作台上用体积浓度70％乙醇水溶液浸泡45s，然后用混合消毒液浸泡15min，再用无菌水冲洗4遍；在灭菌的滤纸上吸干水分，用解剖刀剥取0.5cm的腋芽，然后将腋芽接种到装丛生芽诱导培养基的培养瓶中，盖上瓶盖并用封口膜封住瓶口，置于培养箱中，在25℃，光照2000lx条件下培养20天；所述混合消毒液为体积比1：200的吐温20和84消毒液的混合液；所述丛生芽诱导培养基为添加6-ba1.0mg/l、naa0.5mg/l和谷氨酰胺80mg/l的ms基本培养基；ms基本培养基中蔗糖30g/l、琼脂粉9g/l、溶剂为水，ph5.8。

(2)芽的增殖：观察步骤(1)所述25℃，光照2000lx条件下培养20天后，切口部位出现绿色突起，30天后出现丛生芽，再培养15天，当丛生芽长到3cm时，将丛生芽切下转接到芽增殖培养基中，在25℃，光照2000lx条件下进行增殖培养，获得丛生苗，所述芽增殖培养基为添加6-ba1.0mg/l、naa0.3mg/l、谷氨酰胺80mg/l和酵母浸出物500mg/l的ms基本培养基。

(3)生根培养：将分化的丛生苗从基部切下，插入生根培养基中培养至芽生根；所述的生根培养基为改良的1/2ms培养基中加入0.2mg/l的naa和80mg/l的谷氨酰胺。

(4)生根苗的移栽：待小苗叶片舒展，叶色浓绿，苗高4cm左右打开瓶盖炼苗3d即可进行移栽。移栽前将植株上的琼脂和杂物洗净，移栽与经0.1％高锰酸钾消毒过的育苗基质上，浇透定根水，盖上薄膜，保持湿度80％以上，置通风阴凉处，在25℃、光照2000lx条件下培养，并定期进行喷药预防病虫害的发生。所述移栽基质为细沙、腐殖土与谷糠灰按照质量比5：2：2的比例配置而成，所述移栽基质的消毒方法为：采用体积浓度0.5％福尔马林水溶液均匀喷洒基质，塑料薄膜覆盖4天后揭开薄膜再曝晒基质2天，完成对移栽基质的消毒，或者采用体积浓度0.5％福尔马林水溶液均匀喷洒基质，塑料薄膜覆盖4天后揭开薄膜再在60℃下干燥2天，完成对移栽基质的消毒。

本发明所述平安树幼嫩腋芽选自浙江杭州花圃的长势良好、无病虫害的平安树。

本发明所述ms基本培养基包含大量元素、微量元素、铁盐、有机物、蔗糖和琼脂粉。所述大量元素组成是在配置1升(1000毫升)培养基时，加硝酸铵nh4no31.65克、硝酸钾(kno3)1.9克、氯化钙(cacl2·2h2o)0.44克、硫酸镁(mgso4·7h2o)0.37克、磷酸二氢钾(kh2po4)0.17克。所述微量元素组成是在配置1升(1000毫升)培养基时，加碘化钾(ki)0.83毫克、硼酸(h3bo3)6.2毫克、硫酸锰(mnso4·4h2o)22.3毫克、硫酸锌(znso4·7h2o)8.6毫克、钼酸钠(na2moo4·2h2o)0.25毫克、硫酸铜(cuso4·5h2o)0.025毫克、氯化钴(cocl2·6h2o)0.025毫克。所述铁盐元素组成是在配置1升(1000毫升)培养基时，加乙二胺四乙酸二钠(na2edta)37.3毫克，硫酸亚铁(feso4·7h2o)27.8毫克。所述有机物组成是在配置1升(1000毫升)培养基时，加肌醇100毫克、甘氨酸2毫克、盐酸硫胺素(vb1)0.1毫克，盐酸吡哆醇(vb6)0.5毫克，烟酸(vb5)0.5毫克。蔗糖浓度是20～40克/升，琼脂粉浓度是7～11克/升,溶剂为水，ph为5.6～6.0。

本发明所述改良的1/2ms培养基是指将传统1/2ms基本培养基进行改良，传统1/2ms是仅仅将大量元素减半，微量元素、有机物和铁盐的含量均不变，而本发明中改良的1/2ms不但其中大量元素减半，而且微量元素和铁盐的含量均降低为1/2的含量，不添加有机物，取消的有机物包含有肌醇、甘氨酸、盐酸硫胺素(vb1)、盐酸吡哆醇(vb6)、烟酸(vb5)等。即终浓度组成为：硝酸铵nh4no30.83克、硝酸钾(kno3)0.95克、氯化钙(cacl2·2h2o)0.22克、硫酸镁(mgso4·7h2o)0.19克、磷酸二氢钾(kh2po4)0.09克、碘化钾(ki)0.42毫克、硼酸(h3bo3)3.1毫克、硫酸锰(mnso4·4h2o)11.2毫克、硫酸锌(znso4·7h2o)4.3毫克、钼酸钠(na2moo4·2h2o)0.13毫克、硫酸铜(cuso4·5h2o)0.013毫克、氯化钴(cocl2·6h2o)0.013毫克、乙二胺四乙酸二钠(na2edta)18.7毫克、硫酸亚铁(feso4·7h2o)13.9毫克、蔗糖20～40克/升、琼脂粉7～11克/升，溶剂为水，ph为5.6～6.0。

本发明所述洗洁精为浙江传化洗洁精，作为清洗剂使用时通常以体积比1：100添加水；本发明所述封口膜购自山东青岛普朗特生物有限公司；本发明所述酵母浸出物购自天津市百世化工有限公司。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：

(1)以腋芽为外植体，应用组织培养的方法进行快速繁殖，克服了平安树常规扦插和种子繁殖周期长、繁殖系数低、易感染和传播病毒等缺点；用该方法生产出来的组培苗具有病毒少、遗传性稳定等优点。

(2)改进外植体消毒方法：用毒性小并且易降解的84消毒液代替传统的不可降解的氯化汞消毒剂，氯化汞属于重金属有相当大的腐蚀性，并含有剧毒；长期接触更可能引起皮肤过敏或肾病综合症，进入环境对人类食物链也有相当大的破坏性，采用84消毒液对生态环境更安全环保；质量浓度0.1％氯化汞消毒对芽的诱导有影响，诱导率仅85％，而且外植体有发褐现象，芽的生长也比较慢，而混合消毒液虽然污染率与0.1％hgcl2污染率均为10％，但是芽诱导率却达到98％，对细胞毒害最小，生长也快。

(3)对培养基进行了改良，添加了谷胺酰胺和酵母浸出物，酵母浸出物中的活性因子大大提高了平安树的芽分化和增殖率。当同时添加谷氨酰胺和酵母浸出物时，不但改善了叶片褐化的状态，而且促进平安树芽的增殖，增殖率可以达到230％，苗较大，叶绿色健壮而且增殖多。

(4)对生根的传统1/2ms进行了改良，传统1/2ms是仅仅将大量元素减半，微量元素和铁盐的含量均不变，而本发明中改良的1/2ms不但其中大量元素减半，而且微量元素和铁盐的含量均降低为1/2的含量，取消了传统1/2ms中的有机物，取消的有机物包括肌醇、甘氨酸、盐酸硫胺素(vb1)、盐酸吡哆醇(vb6)、烟酸(vb5)等。而在生根培养基中添加谷胺酰胺后，不但抑制了褐化，而且促进了生根，生根率100％，根系粗壮，大大节省了工厂化大量繁殖生根的成本。

(5)改进了组培程序，本方法获得的平安树不定芽分化和诱导过程，不经愈伤组织脱分化，直接以腋芽繁殖诱导无菌芽，比通过叶片和茎段为外植体先获得愈伤组织，再从愈伤组织获得的无菌芽材料更快，更容易，而且能有效避免继代增殖过程中造成的种苗变异，提高了其性状的稳定性，保证了种苗的品质和质量，有利于种质资源保存和生产利用，可有效解决平安树的优质种苗的供应问题。

(四)附图说明

图1平安树在增殖培养基中进行增殖培养生长情况；

图2平安树在生根培养基中进行生根培养生长情况。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明所述ms基本培养基包含大量元素、微量元素、铁盐、有机物、蔗糖和琼脂粉。所述大量元素组成是在配置1升(1000毫升)培养基时，加硝酸铵nh4no31.65克、硝酸钾(kno3)1.9克、氯化钙(cacl2·2h2o)0.44克、硫酸镁(mgso4·7h2o)0.37克、磷酸二氢钾(kh2po4)0.17克。所述微量元素组成是在配置1升(1000毫升)培养基时，加碘化钾(ki)0.83毫克、硼酸(h3bo3)6.2毫克、硫酸锰(mnso4·4h2o)22.3毫克、硫酸锌(znso4·7h2o)8.6毫克、钼酸钠(na2moo4·2h2o)0.25毫克、硫酸铜(cuso4·5h2o)0.025毫克、氯化钴(cocl2·6h2o)0.025毫克。所述铁盐元素组成是在配置1升(1000毫升)培养基时，加乙二胺四乙酸二钠(na2edta)37.3毫克，硫酸亚铁(feso4·7h2o)27.8毫克。所述有机物组成是在配置1升(1000毫升)培养基时，加肌醇100毫克、甘氨酸2毫克、盐酸硫胺素(vb1)0.1毫克，盐酸吡哆醇(vb6)0.5毫克，烟酸(vb5)0.5毫克。蔗糖20～40克/升、琼脂粉7～11克/升，溶剂为水，ph为5.6～6.0。

本发明所述改良的1/2ms培养基是指将传统1/2ms培养基进行改良，传统1/2ms是仅仅将大量元素减半，微量元素、有机物和铁盐的含量均不变，而本发明中改良的1/2ms不但其中大量元素减半，而且微量元素和铁盐的含量均降低为1/2的含量，不添加有机物，取消的有机物包含肌醇、甘氨酸、盐酸硫胺素(vb1)、盐酸吡哆醇(vb6)、烟酸(vb5)等。即终浓度组成为：硝酸铵nh4no30.83克、硝酸钾(kno3)0.95克、氯化钙(cacl2·2h2o)0.22克、硫酸镁(mgso4·7h2o)0.19克、磷酸二氢钾(kh2po4)0.09克、碘化钾(ki)0.42毫克、硼酸(h3bo3)3.1毫克、硫酸锰(mnso4·4h2o)11.2毫克、硫酸锌(znso4·7h2o)4.3毫克、钼酸钠(na2moo4·2h2o)0.13毫克、硫酸铜(cuso4·5h2o)0.013毫克、氯化钴(cocl2·6h2o)0.013毫克、乙二胺四乙酸二钠(na2edta)18.7毫克、硫酸亚铁(feso4·7h2o)13.9毫克、蔗糖20～40克/升、琼脂粉7～11克/升，溶剂为水，ph为5.6～6.0。

本发明所述洗洁精为浙江传化洗洁精；所述封口膜购自山东青岛普朗特生物有限公司；所述酵母浸出物购自天津市百世化工有限公司。

实施例1

(1)无菌材料的获得及诱导培养：切取长势良好、无病虫害的平安树幼嫩的腋芽，用自来水冲洗30min，然后在体积浓度为1％洗洁精的水溶液中振摇2min，用无菌水冲净；在超净工作台上用体积浓度70％乙醇水溶液浸泡30s，然后用混合消毒液浸泡10min，再用无菌水冲洗3遍；在灭菌的滤纸上吸干水分，用解剖刀剥取0.3cm的腋芽，然后将腋芽接种到装丛生芽诱导培养基的培养瓶中，盖上瓶盖并用封口膜封住瓶口，置于培养箱中，在24℃，光照1500lx条件下培养15天；所述混合消毒液为体积比1：200的吐温20和84消毒液的混合液；所述丛生芽诱导培养基为添加6-ba0.5mg/l、naa0.1mg/l和谷氨酰胺50mg/l的ms基本培养基；ms基本培养基中蔗糖20g/l、琼脂粉7g/l、溶剂为水，ph5.6。

(2)芽的增殖：观察步骤(1)所述24℃，光照1500lx条件下培养15天后出现绿色突起，20天后出现丛生芽，再培养10天，当丛生芽长到2cm时，将不定芽切下转接到芽增殖培养基中，在24℃，光照1500lx条件下进行增殖培养，获得丛生苗；所述芽增殖培养基为添加6-ba0.5mg/l、naa0.1mg/l、谷氨酰胺50mg/l和酵母浸出物200mg/l的ms基本培养基；

(3)生根培养：将分化的丛生苗从基部切下，插入生根培养基中培养至芽生根；所述的生根培养基为改良的1/2ms培养基中加入0.05mg/l的naa和50mg/l的谷氨酰胺；

(4)生根苗的移栽：待小苗叶片舒展，叶色浓绿，苗高3cm左右打开瓶盖炼苗2d即可进行移栽。移栽前将植株上的琼脂和杂物洗净，移栽与经0.1％高锰酸钾消毒过的育苗基质上，浇透定根水，盖上薄膜，保持湿度80％以上，置通风阴凉处，在24℃、光照1500lx条件下培养，并定期进行喷药预防病虫害的发生。所述移栽基质为细沙、腐殖土与谷糠灰按照质量比5：2：2的比例配置而成，所述移栽基质的消毒方法为：采用体积浓度0.5％福尔马林水溶液均匀喷洒基质，塑料薄膜覆盖3天后揭开薄膜再曝晒基质1天，完成对移栽基质的消毒，或者采用体积浓度0.5％福尔马林水溶液均匀喷洒基质，塑料薄膜覆盖3天后揭开薄膜再在60℃下干燥2天，完成对移栽基质的消毒。

实施例2不同的消毒剂对平安树外植体生长的影响

分别用质量浓度10％的过氧化氢(h2o2)水溶液、质量浓度0.1％的氯化汞(hgcl2)水溶液和实施例1中的混合消毒液对平安树的外植体材料(即腋芽)进行消毒，其它操作同实施例1。分别将腋芽接种到装有丛生芽诱导培养基的培养瓶中，封口膜封住瓶口后，置于培养箱中。在24℃，光照1500lx条件下进行培养15天后，观察统计不同消毒剂对平安树芽诱导和生长的影响，结果见表1所示。结果表明，混合消毒液和质量浓度0.1％hgcl2的消毒效果基本相同，质量浓度10％的过氧化氢消毒效果稍差，污染率达到20％，生长缓慢。但是质量浓度0.1％hgcl2消毒对芽的诱导有影响，诱导率仅85％，而且外植体有发褐现象，芽的生长也比较慢，可能是hgcl2毒害细胞对芽的诱导有一定的影响，而混合消毒液虽然污染率与0.1％hgcl2污染率均为10％，但是芽诱导率却达到98％，对细胞毒害最小，生长也快。

表1不同的消毒剂对平安树外植体生长的影响

实施例3不同激素组合对平安树芽的诱导影响

将平安树腋芽分别接种在添加了不同浓度6-ba和naa的ms基本培养基(即丛生芽诱导培养基)中，其它操作同实施例1，平安树不定芽生长结果见表2所示。结果表明，不同激素组合的培养基均可以不同程度地诱导芽的形成。其中以培养基ms+6-ba1.0mg/l+naa0.5mg/l+80mg/l谷氨酰胺为最佳，诱导出的再生芽最多，生长快，平均芽长2.05cm，芽诱导率达100％，苗大而健壮，无玻璃化苗现象,而不添加谷氨酰胺的培养基切口部位均呈现不同程度的褐化。

芽诱导率＝芽诱导数/外植体数×100％

表2不同激素浓度对平安树的芽诱导影响

实施例4谷氨酰胺和酵母浸出物对平安树芽增殖的影响

将平安树的丛生芽分别接种到添加了不同浓度谷氨酰胺和酵母浸出物的芽增殖培养基中，其它操作同实施例1，谷氨酰胺和酵母浸出物对平安树芽增殖的影响结果如表3所示。结果发现，未添加谷氨酰胺和酵母浸出物时，平安树不定芽虽然也有增殖，但是褐化严重。单独添加谷氨酰胺50～100mg/l，能改善叶片褐化的状态，而单独添加酵母浸出物200～800mg/l均能促进芽生长分化。当同时添加谷氨酰胺和酵母浸出物时，不但改善了叶片褐化的状态，而且促进平安树芽的增殖，其中在优化的芽增殖培养基ms+6-ba1.0mg/l+naa0.3mg/l中添加80mg/l的谷氨酰胺和500mg/l酵母浸出物，增殖率可以达到230％，苗较大，叶绿色，健壮而且增殖多(见图1)。

其中增殖率＝(总芽数-接种芽数)/接种芽数×100％

表3谷氨酰胺和酵母浸出物对平安树芽增殖的影响

实施例5谷氨酰胺对平安树生根的影响

将平安树的丛生芽分别接种到添加了不同浓度谷氨酰胺的生根培养基中，其它操作同实施例1，谷氨酰胺对平安树芽生根的影响结果如表4所示。结果发现，平安树不定芽在未添加谷氨酰胺的生根培养基中，生根少，有褐化现象，在添加谷氨酰胺的生根培养基中，促进生根，无褐化现象，而且根系粗壮。其中谷氨酰胺的添加浓度为80mg/l，对抑制褐化和生根效果较好，生根率可以达到100％,在第4天就启动生根，平均生根数达到10个(见图2)。

生根率＝生根苗数/接种数×100％

表4谷氨酰胺对平安树芽生根的影响

实施例6

(1)无菌材料的获得及诱导培养：切取长势良好、无病虫害的平安树幼嫩的腋芽，用自来水冲洗45min，然后在体积浓度为1％洗洁精的水溶液中振摇3min，用无菌水冲净；在超净工作台上用体积浓度70％乙醇水溶液浸泡45s，然后用混合消毒液浸泡15min，再用无菌水冲洗4遍；在灭菌的滤纸上吸干水分，用解剖刀剥取0.5cm的腋芽，然后将腋芽接种到装丛生芽诱导培养基的培养瓶中，盖上瓶盖并用封口膜封住瓶口，置于培养箱中，在25℃，光照2000lx条件下培养20天；所述混合消毒液为体积比1：200的吐温20和84消毒液的混合液；所述丛生芽诱导培养基为添加6-ba1.0mg/l、naa0.5mg/l和谷氨酰胺80mg/l的ms基本培养基；ms基本培养基中蔗糖30g/l、琼脂粉9g/l、溶剂为水，ph5.8。

(2)芽的增殖：观察步骤(1)所述25℃，光照2000lx条件下培养20天后，切口部位出现绿色突起，30天后出现丛生芽，再培养15天，当丛生芽长到3cm时，将丛生芽切下转接到芽增殖培养基中，在25℃，光照2000lx条件下进行增殖培养，获得丛生苗，所述芽增殖培养基为添加6-ba1.0mg/l、naa0.3mg/l、谷氨酰胺80mg/l和酵母浸出物500mg/l的ms基本培养基；

(3)生根培养：将分化的丛生苗从基部切下，插入生根培养基中培养至芽生根；所述的生根培养基为改良的1/2ms培养基中加入0.2mg/l的naa,80mg/l的谷氨酰胺；

(4)生根苗的移栽：待小苗叶片舒展，叶色浓绿，苗高4cm左右打开瓶盖炼苗3d即可进行移栽。移栽前将植株上的琼脂和杂物洗净，移栽与经0.1％高锰酸钾消毒过的育苗基质上，浇透定根水，盖上薄膜，保持湿度80％以上，置通风阴凉处，在25℃、光照2000lx条件下培养，并定期进行喷药预防病虫害的发生。所述移栽基质为细沙、腐殖土与谷糠灰按照质量比5：2：2的比例配置而成，所述移栽基质的消毒方法为：采用体积浓度0.5％福尔马林水溶液均匀喷洒基质，塑料薄膜覆盖4天后揭开薄膜再曝晒基质2天，完成对移栽基质的消毒，或者采用体积浓度0.5％福尔马林水溶液均匀喷洒基质，塑料薄膜覆盖4天后揭开薄膜再在60℃下干燥2天，完成对移栽基质的消毒。

实施例7

(1)无菌材料的获得及诱导培养：切取长势良好、无病虫害的平安树幼嫩的腋芽，用自来水冲洗60min，然后在体积浓度为1％洗洁精的水溶液中振摇5min，用无菌水冲净；在超净工作台上用体积浓度70％乙醇水溶液浸泡60s，然后用混合消毒液浸泡20min，再用无菌水冲洗5遍；在灭菌的滤纸上吸干水分，用解剖刀剥取0.6cm的腋芽，然后将腋芽接种到装丛生芽诱导培养基的培养瓶中，盖上瓶盖并用封口膜封住瓶口，置于培养箱中，在26℃，光照2500lx条件下培养25天；所述混合消毒液为体积比1：200的吐温20和84消毒液的混合液；所述丛生芽诱导培养基为添加6-ba2.0mg/l、naa1.0mg/l和谷氨酰胺100mg/l的ms基本培养基；ms基本培养基中蔗糖40g/l、琼脂粉11g/l、溶剂为水，ph6.0。

(2)芽的增殖：观察步骤(1)所述26℃，光照2500lx条件下培养25天后，切口部位出现绿色突起，40天后出现丛生芽，再培养20天，当丛生芽长到4cm时，将丛生芽切下转接到芽增殖培养基中，在26℃，光照2500lx条件下进行增殖培养，获得丛生苗，所述芽增殖培养基为添加6-ba1.5mg/l、naa0.5mg/l、谷氨酰胺100mg/l和酵母浸出物800mg/l的ms基本培养基；

(3)生根培养：将分化的丛生苗从基部切下，插入生根培养基中培养至芽生根；所述的生根培养基为改良的1/2ms培养基中加入0.5mg/l的naa,100mg/l的谷氨酰胺；

(4)生根苗的移栽：待小苗叶片舒展，叶色浓绿，苗高5cm左右打开瓶盖炼苗4d即可进行移栽。移栽前将植株上的琼脂和杂物洗净，移栽与经0.1％高锰酸钾消毒过的育苗基质上，浇透定根水，盖上薄膜，保持湿度80％以上，置通风阴凉处，在26℃、光照2500lx条件下培养，并定期进行喷药预防病虫害的发生。所述移栽基质为细沙、腐殖土与谷糠灰按照质量比5：2：2的比例配置而成，所述移栽基质的消毒方法为：采用体积浓度0.5％福尔马林水溶液均匀喷洒基质，塑料薄膜覆盖5天后揭开薄膜再曝晒基质3天，完成对移栽基质的消毒，或者采用体积浓度0.5％福尔马林水溶液均匀喷洒基质，塑料薄膜覆盖5天后揭开薄膜再在60℃下干燥2天，完成对移栽基质的消毒。