本发明涉及鱼类繁殖技术领域，特别涉及一种三倍体虹鳟鱼制种技术方法。
背景技术：
虹鳟鱼，是鲑科太平洋鲑属的一种冷水性塘养鱼类。虹鳟是世界上广泛养殖的重要冷水性鱼。因成熟个体沿侧线有一棕红色纵纹，似彩虹，故名。原产于北美洲北部和太平洋西岸，主要生活在低温淡水中，对养殖水域的水质要求较高。虹鳟是一种食用鱼，被移入多个国家，但在一些地区成为了入侵物种。
三倍体虹鳟鱼是四倍体虹鳟鱼和普通二倍体虹鳟鱼杂交产生的全雌性虹鳟鱼。具有生长周期短，成本低，肉质好的特点。虹鳟鱼养殖采用的是一种高密度流水养鱼方式，科技含量高，从目前虹鳟鱼养殖技术水平上看，需要三年以上的时间才能完成一个商品鱼生产周期，生产周期较长，投入较高，要取得较好的经济效益，就必须改良品种，提高虹鳟鱼生长速度，缩短生产周期，尽而降低成本。根据国内外养殖虹鳟鱼最新动态，如果采用全雌三倍体技术则可有效地解决这个问题。采用该项技术，具有以下突出优点：其一，采用全雌三倍体虹鳟鱼进行养殖，可提高虹鳟鱼成活率10%，可提高生长速度10～20%。其二，采用该技术可避开因性腺发育而对饲料的过多消耗，降低养殖成本5%以上，可提高经济效益15%～20%。
在水产生物遗传育种中，受精卵孵化是一个很常见但又很重要的过程。鱼类三倍体不育性，可以避免性腺发育延长上市时间，生长迅速也能减少养殖周期，受到养殖户和科研者的亲睐。当前培育三倍体苗种有物理、化学、生物等不同方法，其中以物理方法最为直接，而且简单有效。但是目前在三倍体虹鳟鱼的培育上，常用的温度休克方法，诱导率低，而且死亡率较高。
因此，基于上述的问题，本发明提供一种三倍体虹鳟鱼制种技术方法，通过热休克和电休克的双重作用，以及休克前的处理，降低受精卵的死亡率，且提高诱导率。
技术实现要素：
针对现有技术存在的不足，本发明提供一种三倍体虹鳟鱼制种技术方法，通过热休克和电休克的双重作用，以及休克前的处理，降低受精卵的死亡率，且提高诱导率。
为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：
本发明提供一种三倍体虹鳟鱼制种技术方法，其特征在于，所述制种技术方法为在注射催产剂24小时后进行人工授精，收集受精卵进行热休克和电休克结合处理；受精卵在9-10℃冷流水下静置10-20分钟；在温度为18-20℃下处理10-12分钟，再在20-25℃和5-8v交流电休克处理15-20分钟，得到三倍体虹鳟鱼受精卵；受精卵放入孵化桶中，用受精卵脱膜前流速为0.4m/s、脱膜后流速为0.2m/s的流动水进行孵化，育成三倍体虹鳟鱼苗种。
温度休克，包括热休克和冷休克，一般用略高于或略低于致死温度来诱导三倍体，其作用机制是温度变化引起细胞内酶结构的改变，不利于酶促反应的进行，导致细胞分裂时形成纺锤体所需的atp的供应途径受阻，使已完成染色体加倍的细胞不能分裂。温度休克的关键是开始处理时间、处理的持续时间以及温度的高低。但目前虹鳟鱼热休克处理，由于突然温度升高的热刺激引起卵死亡，导致诱导率低，且死亡率较高。经过我们研究发现适当降低热休克处理的温度，可降低死亡率，但形成三倍体的诱导率很低。因此，本发明研究出分为两步进行休克，第一步热休克：在18-20℃下处理10-12分钟，第二步热休克+电休克：在20-25℃和5-8v交流电休克处理15-20分钟。使用本发明的处理方法，在降低由于突然增温引起的死亡率之外，还保障了其诱导率。
具体的，所述制种技术方法包括以下步骤：
（1）鱼池建造管理：建设水深在60-90厘米、池壁高90-120厘米的流水式鱼池，池底进水处至排水处有一定的坡度，鱼池建有排污系统，定期排污，控制水质；
（2）亲鱼的选择：选择体质健壮、无病害、性腺发育良好的虹鳟鱼公鱼亲鱼和虹鳟鱼四倍体雌鱼亲鱼进行人工催产；
（3）注射催产剂：虹鳟鱼四倍体雌鱼亲鱼胸腔注射催产剂，催产剂选用促黄体素释放激素类似物、地欧酮及0.7％的鱼用生理盐水；药物分2次注射，水温19℃时，两针间距10小时；第一针雌鱼剂量为1μg促黄体素释放激素类似物+0.2ml0.7％生理盐水/kg鱼体重，雄鱼不注射；第二针雌鱼剂量为6μg促黄体素释放激素类似物+3mg地欧酮+0.2ml0.7％生理盐水/kg鱼体重，雄鱼剂量为雌鱼剂量的一半；
（4）产卵前亲鱼管理：注射催产药物的亲鱼放入催产池中，催产池水温控制在9-15℃，保持催产池安静避光；
（5）人工授精：亲鱼催产剂注射后24小时进行人工授精；受精卵采用脱粘或用人工鱼巢收集受精卵；
（6）热休克+电休克处理：采用热休克与电休克相结合的方法，受精卵在9-10℃冷流水下静置10-20分钟；在温度为18-20℃下处理10-12分钟，再在20-25℃和5~8v交流电休克处理15-20分钟；
（7）孵化：受精卵选用孵化桶孵化，孵化桶的放卵密度为400-500粒/l水体，孵化桶内水体流速应适时调控，受精卵脱膜前流速为0.4m/s，脱膜后流速为0.2m/s，控制孵化水质与催产池水质一致；脱膜后在孵化桶中经过4天的发育，再进行苗种培育。
根据虹鳟鱼的生长特性，在鱼塘建设时，模拟其最佳的生长环境，给予较低的水温和流动的水体，水质较为清澈，含氧量充足。注射催产剂后，放入的催产池的环境选择安静避光的地方，适宜其所处的生长阶段所需的环境需求。亲鱼催产剂注射后24小时后，雌鱼腹部膨大而柔软、轮廓明显、有弹性，当提起鱼的尾部，头部朝下时，卵巢下垂轮廓明显，轻压腹部有卵粒流出，生殖孔红肿外凸，成熟度好。公鱼腹部较柔软，轻压会有精液流出。之后再进行休克处理，经过在18-20℃下处理10-12分钟，在20-25℃和5-8v交流电休克处理15-20分钟。该热处理温度相对现有技术中的温度更低，且在第二阶段还结合了电休克结合，因此，采用本发明方法可以降低由于突然增温引起的死亡率，同时保障其诱导率。采用本发明中的方法，虹鳟鱼受精卵存活率达到92%以上，受精卵的三倍体诱导率达80％以上。
具体的，所述鱼池建造管理中水流速度为12-18米/分钟，ph值为6.5-8.5。
具体的，所述产卵前亲鱼管理中水中溶氧保持在9-15mg/ml，每天投喂鱼体重1%的饲料。
具体的，所述孵化桶中水温控制在9-13℃。
具体的，所述人工授精为采集亲鱼精液，取雌鱼的卵粒挤入容器，与精液搅拌，向所述容器内倒入适量的可将精液和卵粒侵没的4-8%的生理盐水，搅拌并静置2-3分钟进行授精。
本发明实施例提供的技术方案的有益效果：
本发明研究出分为两步进行休克的制种技术方法，第一步热休克：在18-20℃下处理10-12分钟，第二步热休克+电休克：在20-25℃和5-8v交流电休克处理15-20分钟。该热处理温度相对现有技术中的温度更低，且在第二阶段还结合了电休克结合，采用本发明方法可以降低由于突然增温引起的死亡率，同时还保障其诱导率。虹鳟鱼受精卵存活率达到92%以上，受精卵的三倍体诱导率达80％以上。
具体实施方式
为使本发明的技术方案和要点更加清楚，下面对本发明实施方式作进一步地详细描述。
以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
实施例1三倍体虹鳟鱼制种技术方法
所述制种技术方法包括以下步骤：
（1）鱼池建造管理：建设水深在60厘米、池壁高90厘米的流水式鱼池，池底进水处至排水处有一定的坡度，鱼池建有排污系统，定期排污，控制水质；鱼池的水流速度为12-18米/分钟，鱼池中水的ph值为6.5-6.8。
（2）亲鱼的选择：选择体质健壮、无病害、性腺发育良好的虹鳟鱼公鱼亲鱼和虹鳟鱼四倍体雌鱼亲鱼进行人工催产；
（3）注射催产剂：虹鳟鱼四倍体雌鱼亲鱼胸腔注射催产剂，催产剂选用促黄体素释放激素类似物、地欧酮及0.7％的鱼用生理盐水；药物分2次注射，水温19℃时，两针间距10小时；第一针雌鱼剂量为1μg促黄体素释放激素类似物+0.2ml0.7％生理盐水/kg鱼体重，雄鱼不注射；第二针雌鱼剂量为6μg促黄体素释放激素类似物+3mg地欧酮+0.2ml0.7％生理盐水/kg鱼体重，雄鱼剂量为雌鱼剂量的一半；
（4）产卵前亲鱼管理：注射催产药物的亲鱼放入催产池中，催产池水温控制在9-15℃，保持催产池安静避光；催产池水中溶氧保持在9-15mg/ml，每天投喂鱼体重1%的饲料；
（5）人工授精：亲鱼催产剂注射后24小时后采集亲鱼精液，取雌鱼的卵粒挤入容器，与精液搅拌，向所述容器内倒入适量的可将精液和卵粒侵没的8%的生理盐水，搅拌并静置3分钟进行授精，采用脱粘或用人工鱼巢收集受精卵；
（6）热休克+电休克处理：采用热休克与电休克相结合的方法，受精卵在9-10℃冷流水下静置20分钟；在温度为18-20℃下处理12分钟，再在20-25℃和5-8v交流电休克处理15分钟；
（7）孵化：受精卵选用孵化桶孵化，孵化桶的放卵密度为400-500粒/l水体，孵化桶中水温控制在9-13℃；孵化桶内水体流速应适时调控，受精卵脱膜前流速为0.4m/s，脱膜后流速为0.2m/s，控制孵化水质与催产池水质一致；脱膜后在孵化桶中经过4天的发育，再进行苗种培育。
实施例2三倍体虹鳟鱼制种技术方法
所述制种技术方法包括以下步骤：
（1）鱼池建造管理：建设水深在60厘米、池壁高90厘米的流水式鱼池，池底进水处至排水处有一定的坡度，鱼池建有排污系统，定期排污，控制水质；鱼池的水流速度为12-18米/分钟，鱼池中水的ph值为6.5-6.8。
（2）亲鱼的选择：选择体质健壮、无病害、性腺发育良好的虹鳟鱼公鱼亲鱼和虹鳟鱼四倍体雌鱼亲鱼进行人工催产；
（3）注射催产剂：虹鳟鱼四倍体雌鱼亲鱼胸腔注射催产剂，催产剂选用促黄体素释放激素类似物、地欧酮及0.7％的鱼用生理盐水；药物分2次注射，水温19℃时，两针间距10小时；第一针雌鱼剂量为1μg促黄体素释放激素类似物+0.2ml0.7％生理盐水/kg鱼体重，雄鱼不注射；第二针雌鱼剂量为6μg促黄体素释放激素类似物+3mg地欧酮+0.2ml0.7％生理盐水/kg鱼体重，雄鱼剂量为雌鱼剂量的一半；
（4）产卵前亲鱼管理：注射催产药物的亲鱼放入催产池中，催产池水温控制在9-15℃，保持催产池安静避光；催产池水中溶氧保持在9-15mg/ml，每天投喂鱼体重1%的饲料；
（5）人工授精：亲鱼催产剂注射后24小时后采集亲鱼精液，取雌鱼的卵粒挤入容器，与精液搅拌，向所述容器内倒入适量的可将精液和卵粒侵没的8%的生理盐水，搅拌并静置3分钟进行授精，采用脱粘或用人工鱼巢收集受精卵；
（6）热休克：采用热休克处理方法，受精卵在9-10℃冷流水下静置20分钟；在温度为26-31℃下处理15分钟；
（7）孵化：受精卵选用孵化桶孵化，孵化桶的放卵密度为400-500粒/l水体，孵化桶中水温控制在9-13℃；孵化桶内水体流速应适时调控，受精卵脱膜前流速为0.4m/s，脱膜后流速为0.2m/s，控制孵化水质与催产池水质一致；脱膜后在孵化桶中经过4天的发育，再进行苗种培育。
实施例3三倍体虹鳟鱼制种技术方法
所述制种技术方法包括以下步骤：
（1）鱼池建造管理：建设水深在60厘米、池壁高90厘米的流水式鱼池，池底进水处至排水处有一定的坡度，鱼池建有排污系统，定期排污，控制水质；鱼池的水流速度为12-18米/分钟，鱼池中水的ph值为6.5-6.8。
（2）亲鱼的选择：选择体质健壮、无病害、性腺发育良好的虹鳟鱼公鱼亲鱼和虹鳟鱼四倍体雌鱼亲鱼进行人工催产；
（3）注射催产剂：虹鳟鱼四倍体雌鱼亲鱼胸腔注射催产剂，催产剂选用促黄体素释放激素类似物、地欧酮及0.7％的鱼用生理盐水；药物分2次注射，水温19℃时，两针间距10小时；第一针雌鱼剂量为1μg促黄体素释放激素类似物+0.2ml0.7％生理盐水/kg鱼体重，雄鱼不注射；第二针雌鱼剂量为6μg促黄体素释放激素类似物+3mg地欧酮+0.2ml0.7％生理盐水/kg鱼体重，雄鱼剂量为雌鱼剂量的一半；
（4）产卵前亲鱼管理：注射催产药物的亲鱼放入催产池中，催产池水温控制在9-15℃，保持催产池安静避光；催产池水中溶氧保持在9-15mg/ml，每天投喂鱼体重1%的饲料；
（5）人工授精：亲鱼催产剂注射后24小时后采集亲鱼精液，取雌鱼的卵粒挤入容器，与精液搅拌，向所述容器内倒入适量的可将精液和卵粒侵没的8%的生理盐水，搅拌并静置2-3分钟进行授精，采用脱粘或用人工鱼巢收集受精卵；
（6）电休克处理：采用热休克与电休克相结合的方法，受精卵在9-10℃冷流水下静置20分钟；再在9-10℃温度下用10v交流电休克处理20分钟；
（7）孵化：受精卵选用孵化桶孵化，孵化桶的放卵密度为400-500粒/l水体，孵化桶中水温控制在9-13℃；孵化桶内水体流速应适时调控，受精卵脱膜前流速为0.4m/s，脱膜后流速为0.2m/s，控制孵化水质与催产池水质一致；脱膜后在孵化桶中经过4天的发育，再进行苗种培育。
实施例4：三倍体虹鳟鱼制种技术方法
所述制种技术方法包括以下步骤：
（1）鱼池建造管理：建设水深在90厘米、池壁高120厘米的流水式鱼池，池底进水处至排水处有一定的坡度，鱼池建有排污系统，定期排污，控制水质；鱼池的水流速度为12-18米/分钟，鱼池中水的ph值为7.5-8.5。
（2）亲鱼的选择：选择体质健壮、无病害、性腺发育良好的虹鳟鱼公鱼亲鱼和虹鳟鱼四倍体雌鱼亲鱼进行人工催产；
（3）注射催产剂：虹鳟鱼四倍体雌鱼亲鱼胸腔注射催产剂，催产剂选用促黄体素释放激素类似物、地欧酮及0.7％的鱼用生理盐水；药物分2次注射，水温19℃时，两针间距10小时；第一针雌鱼剂量为1μg促黄体素释放激素类似物+0.2ml0.7％生理盐水/kg鱼体重，雄鱼不注射；第二针雌鱼剂量为6μg促黄体素释放激素类似物+3mg地欧酮+0.2ml0.7％生理盐水/kg鱼体重，雄鱼剂量为雌鱼剂量的一半；
（4）产卵前亲鱼管理：注射催产药物的亲鱼放入催产池中，催产池水温控制在9-15℃，保持催产池安静避光；催产池水中溶氧保持在9-15mg/ml，每天投喂鱼体重1%的饲料；
（5）人工授精：亲鱼催产剂注射后24小时后采集亲鱼精液，取雌鱼的卵粒挤入容器，与精液搅拌，向所述容器内倒入适量的可将精液和卵粒侵没的4%的生理盐水，搅拌并静置2分钟进行授精，采用脱粘或用人工鱼巢收集受精卵；
（6）热休克+电休克处理：采用热休克与电休克相结合的方法，受精卵在9-10℃冷流水下静置15分钟；在温度为18-20℃下处理10分钟，再在20-25℃和5-8v交流电休克处理15分钟；
（7）孵化：受精卵选用孵化桶孵化，孵化桶的放卵密度为400-500粒/l水体，孵化桶中水温控制在9-13℃；孵化桶内水体流速应适时调控，受精卵脱膜前流速为0.4m/s，脱膜后流速为0.2m/s，控制孵化水质与催产池水质一致；脱膜后在孵化桶中经过4天的发育，再进行苗种培育。
实施例5：三倍体虹鳟鱼制种技术方法
所述制种技术方法包括以下步骤：
（1）鱼池建造管理：建设水深在90厘米、池壁高120厘米的流水式鱼池，池底进水处至排水处有一定的坡度，鱼池建有排污系统，定期排污，控制水质；鱼池的水流速度为12-18米/分钟，鱼池中水的ph值为7.5-8.5。
（2）亲鱼的选择：选择体质健壮、无病害、性腺发育良好的虹鳟鱼公鱼亲鱼和虹鳟鱼四倍体雌鱼亲鱼进行人工催产；
（3）注射催产剂：虹鳟鱼四倍体雌鱼亲鱼胸腔注射催产剂，催产剂选用促黄体素释放激素类似物、地欧酮及0.7％的鱼用生理盐水；药物分2次注射，水温19℃时，两针间距10小时；第一针雌鱼剂量为1μg促黄体素释放激素类似物+0.2ml0.7％生理盐水/kg鱼体重，雄鱼不注射；第二针雌鱼剂量为6μg促黄体素释放激素类似物+3mg地欧酮+0.2ml0.7％生理盐水/kg鱼体重，雄鱼剂量为雌鱼剂量的一半；
（4）产卵前亲鱼管理：注射催产药物的亲鱼放入催产池中，催产池水温控制在9-15℃，保持催产池安静避光；催产池水中溶氧保持在9-15mg/ml，每天投喂鱼体重1%的饲料；
（5）人工授精：亲鱼催产剂注射后24小时后采集亲鱼精液，取雌鱼的卵粒挤入容器，与精液搅拌，向所述容器内倒入适量的可将精液和卵粒侵没的4-8%的生理盐水，搅拌并静置2-3分钟进行授精，采用脱粘或用人工鱼巢收集受精卵；
（6）热休克+电休克处理：采用热休克与电休克相结合的方法，受精卵在9-10℃冷流水下静置10-20分钟；在温度为26-31℃下处理10-12分钟，再在26-31℃和5-8v交流电休克处理15-20分钟；
（7）孵化：受精卵选用孵化桶孵化，孵化桶的放卵密度为400-500粒/l水体，孵化桶中水温控制在9-13℃；孵化桶内水体流速应适时调控，受精卵脱膜前流速为0.4m/s，脱膜后流速为0.2m/s，控制孵化水质与催产池水质一致；脱膜后在孵化桶中经过4天的发育，再进行苗种培育。
实施例1~5诱导率、存活率比较：
实施例1、4、5均采用热休克和电休克结合诱导，但是实施例5的温度相对更高，从结果可以看出，温度过高导致受精卵存活率较低。实施例2制采用热休克，且温度较高，受精卵存活率较低、诱导率较低；实施例3为只采用电休克，可以看出，电休克诱导率非常低。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。