金黄色葛仙米的生产方法与流程

本发明属于藻类培养领域，具体涉及葛仙米的培养，特别是金黄色葛仙米的生产方法。

背景技术：

葛仙米，学名拟球状念珠藻(nostocsphaeroides)，是一种淡水微藻，属蓝藻纲，念珠藻科，念珠藻属。其与发菜同属，但形态不同。其胶群体成球形，直径可达几厘米，生长于山区稻田、浅水池沼和湖、溪的砂石间，是地球上最早出现的原核光合生物之一。

葛仙米是湖北的著名土特产，其蛋白含量高达56％，其中的藻胆蛋白具有较强的抗氧化和抗癌作用。葛仙米含有大量具生物学活性的蓝藻多糖，它们具有抑制癌细胞生长、增强机体免疫力和抗病毒等功效。葛仙米还含有包括人体必需的8种氨基酸在内的17种氨基酸；另外va、vb1、vb2、vc和ve等维生素含量也很高，并含有钙、铁、碘、锶、磷、硫、钾、镁、钡、锗和微量锌、铜和锰等矿物质。

历史上关于葛仙米作为食物的文字记载有很多，清代袁枚所撰的《随园食单》(1792)、薛宝辰的《素食说略》和童岳荐的《调鼎集》中均有如何烹饪葛仙米的详细记载。葛仙米在梁代陶弘景的《名医别录》中出现，后又被收入清代赵学敏的《本草纲目拾遗》(1765)、柏鹤亭的《神仙济世良方》(1797)、龙柏的《药性考》(1795)和《全国中草药汇编》中。葛仙米的药用功效可总体概括为：性寒、味淡、清热、收敛、明目益气，令人有子，利肠胃，可用于治疗夜盲症、脱肛、烧伤、烫伤等疾患，久服则可消除疲劳，美容养颜，延年益寿。

葛仙米含有叶绿素、类胡萝卜素、藻胆蛋白和紫外吸收色素(如maas和scytonemin)等多种色素，其群体呈现出来的颜色为多种色素相互作用的结果。常规培养条件下，葛仙米中叶绿素和藻红蛋白含量较高，因此多呈现深绿色或黑色，这是市售葛仙米的两种主要颜色。人工培养过程中，葛仙米存在一定几率呈现出翠绿、红色、蓝色和金黄色等颜色，但将这些特殊颜色的葛仙米作为亲本继续培养时，子代葛仙米又恢复为深绿或黑色，其颜色性状无法通过现有技术中已知的培育方法予以保持。由于金黄色具有富丽堂皇、雍容华贵的文化内涵，市场上对于金黄色葛仙米具有强烈需求，因而需要提供一种能够稳定地生产金黄色葛仙米的方法。

技术实现要素：

在大量实验的基础上，发明人创造性地发现，葛仙米的颜色性状并非可遗传变异，而是诱导性变异，因此，可通过控制葛仙米的培养条件以获得期望颜色的子代产品。

在前述发现的基础上，本发明提供了一种金黄色葛仙米的生产方法，所述生产方法简单易行，能够稳定地得到金黄色的葛仙米。

具体而言，所述金黄色葛仙米的生产方法包括以下步骤：

1)制种：选择葛仙米母体，经灭菌处理后制成接种物，转入灭菌的第一培养基中通气培养；

2)放大培养：待葛仙米直径长至0.5～1.0mm时，按照步骤1)的葛仙米培养物:第一诱导培养基＝1:5-50的比例，将葛仙米转入具有第一诱导培养基的培养容器中进行开放式培养，所述培养容器选自柱状光生物反应器、板式光生物反应器、箱式光生物反应器或跑道池式培养池；

3)诱导：将直径为1.5～2.5mm的葛仙米转移至第二诱导培养基中光照培养30～60天，得到直径为4～6mm的金黄色葛仙米。

通过前述方法，能够提高葛仙米细胞内类胡萝卜素的比例，使其呈现金黄色的外观。步骤2)中，所述“步骤1)的葛仙米培养物”，指的是含有葛仙米和第一培养基在内的培养产物。

所述葛仙米母体应具有弹性好、韧性强的特点。具体而言，步骤1)中，所述葛仙米作母体符合以下特征：

i)外形呈直径为3～10mm规则球形，干物质含量为1-5wt.％，色泽为深绿色；

ii)从50cm高度经自由落体式下落，与坚硬水平面撞击后，不发生破裂，且反弹3-20cm的高度；

iii)掰开时能够拉扯出丝。

由于葛仙米的颜色性状并非可遗传变异，而是诱导性变异，故葛仙米的来源和其遗传信息的微小差别并不会对其诱导性变异产生影响。本发明作为母体的葛仙米来源没有特别限定，只要其符合上述特征则均可采用，而不受其采集地、采集方式等的影响。所述“坚硬水平面”对硬度没有特别限定，一般的金属板、石板、水泥面等材质的平面均可采用，只要其呈基本上刚性且具有大于葛仙米的硬度的材质均可采用。

进一步地，步骤1)中，对于葛仙米母体的灭菌方式选自紫外辐射灭菌、75％(体积比)酒精浸泡灭菌或0.1-1％(重量比)次氯酸钠溶液浸泡灭菌。

进一步地，步骤1)中，所述通气培养的条件为：

i)以空气为原料，提高其co2含量至0.1～5％(体积比)，过滤灭菌后作为通气气体；

ii)培养温度为20～30℃；

iii)培养光周期为24h供光，光强为20～50μmolphotons/(m²·s)，所用光源选自日光灯、led灯、植物生长灯或太阳光中的一种或多种。

进一步地，步骤1)中，所述第一培养基由以下种类和用量的原料组成：

所述水选自纯化水、单蒸水、自来水、天然地表水、地下水中的一种多或中。

进一步地，步骤1)中，对于第一培养基的灭菌方式选自经0.2um孔径滤膜过滤灭菌或高温高压灭菌。

进一步地，步骤1)中，所述葛仙米母体为野生种筛选得到，或者为所述生产方法得到的五代以内的子代。

进一步地，步骤2)中，所述的第一诱导培养基以所述第一培养基为基础，省去nano3、ca(h2po4)2、mgk2(so4)2、nahco3或fecl2中的一种或多种组份。

进一步地，步骤2)中，所述的第二诱导培养基以所述第一培养基为基础，省去nano3、ca(h2po4)2、mgk2(so4)2、nahco3、fecl2、h3bo3、mncl2·4h2o、znso4·7h2o或na2moo4·2h2o中的一种或多种组分。

进一步地，步骤3)中，所述光照培养的光强大于100μmolphotons/(m²·s)，优选100-2500μmolphotons/(m²·s)，或者控制光波长为400～550nm。具体可通过改变光源、添加特殊滤膜等方式来实现。

本发明的有益效果在于：

1、发明人创造性地发现，葛仙米的颜色性状并非可遗传变异，而是诱导性变异，并在此基础上，提供了可以实现稳定量产金黄色葛仙米的方法。

2、本发明通过调控营养盐、光强和光质，提高葛仙米细胞内类胡萝卜素的比例，使其呈现金黄色，丰富了葛仙米产品的种类，满足市场需要。

3、采用本发明的生产方法得到的葛仙米，因类胡萝卜素含量较高，在抗氧化、免疫调节、延缓衰老和视力保护方面的效用大为增强。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面对实施例或现有技术中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是野生种黑色葛仙米的照片。

图2是采用本发明提供的生产方法制备得到的金黄色葛仙米的照片。

具体实施方式

下面将结合本发明的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例所用葛仙米原种采自湖北鹤峰走马镇水稻田，经本实验室分离纯化后获得纯化藻种。选取弹性好、韧性强的深绿色球状葛仙米(φ4mm)作为母体，依次经过自来水冲洗20min，无菌水充分冲洗10min，uvb紫外灯辐照10min，0.15％次氯酸钠溶液中浸泡2min，无菌水冲洗3次，然后制成接种物。

按照以下配方制备第一培养基：nano30.21g/l，ca(h2po4)20.12g/l，mgk2(so4)20.24g/l，nahco30.15g/l,fecl210mg/l，na2edta2.4mg/l，h3bo33mg/l，mncl2·4h2o1.50mg/l，znso4·7h2o0.16mg/l，cuso4·5h2o0.08mg/l，na2moo4·2h2o0.4mg/l，cocl2·6h2o0.04mg/l。培养基配制时采用蒸馏水，在103.5kpa、121℃下灭菌20min，冷却后备用。

将接种物接入经灭菌后的第一培养基中，在40μmolphotons/(m2·s)日光灯、23℃、24h光照条件下，进行通气培养。

30d后，获得直径为1mm群体，此时按1:10的比例转入40l柱状光生物反应器中培养；所用培养基为第一诱导培养基，其组成为：fecl210mg/l，na2edta2.4mg/l，h3bo33mg/l，mncl2·4h2o1.50mg/l，znso4·7h2o0.16mg/l，cuso4·5h2o0.08mg/l，na2moo4·2h2o0.4mg/l，cocl2·6h2o0.04mg/l。在50μmolphotons/(m2·s)、23℃、24h光照条件下，进行开放式培养。

15d后，葛仙米直径达2.0mm，此时将葛仙米转入至500l柱状光生物反应器培养，所用培养基为第二诱导培养基，其组成为：fecl210mg/l，na2edta2.4mg/l，h3bo33mg/l，mncl2·4h2o1.50mg/l，cuso4·5h2o0.08mg/l，cocl2·6h2o0.04mg/l。采用蓝绿光led灯作为光源，光强为150μmolphotons/(m2·s)，培养45d后，即可得到直径为5mm左右的金黄色葛仙米。

实施例2

本实施例所用葛仙米原种采自湖北鹤峰走马镇水稻田，经本实验室分离纯化后获得纯化藻种。选取弹性好、韧性强的黑色球状葛仙米(φ5mm)作为母体，依次经过自来水冲洗20min，无菌水充分冲洗10min，uvb紫外灯辐照10min，75％酒精溶液中浸泡3min，无菌水冲洗3次，然后制成接种物。

按照以下配方制备第一培养基：：nano30.5g/l，ca(h2po4)20.24g/l，mgk2(so4)20.30g/l，nahco30.10g/l,fecl210mg/l，na2edta2.0mg/l，h3bo35.0mg/l，mncl2·4h2o3.0mg/l，znso4·7h2o0.16mg/l，cuso4·5h2o0.08mg/l，na2moo4·2h2o0.8mg/l，cocl2·6h2o0.12mg/l。培养基配制时采用蒸馏水，培养基经0.2um微孔滤膜过滤后备用。

将接种物接入经灭菌后的完全培养基中，在30μmolphotons/(m2·s)日光灯、25℃、24h光照条件下进行通气培养。

28d后，获得直径为1mm群体，此时按1:10比例转入40l柱状光生物反应器中培养；所用培养基为第一诱导培养基，其组成为：fecl210mg/l，na2edta2.4mg/l，h3bo33mg/l，mncl2·4h2o1.50mg/l，znso4·7h2o0.16mg/l，cuso4·5h2o0.08mg/l，na2moo4·2h2o0.4mg/l，cocl2·6h2o0.04mg/l。在50μmolphotons/(m2·s)、25℃、24h光照条件下进行开放式培养。

14d后，葛仙米直径达2.0mm，此时将葛仙米转入至20m²跑道式培养池中培养，所用培养基为第二诱导培养基，其组成为：fecl210mg/l，na2edta2.4mg/l，h3bo33mg/l，mncl2·4h2o1.50mg/l，cuso4·5h2o0.08mg/l，cocl2·6h2o0.04mg/l、。采用太阳光作为光源，前7天用70％遮光率遮阳网遮光，7d后改用遮光率30％遮阳网遮光，培养60天后，即可得到直径为5mm左右的金黄色葛仙米。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。