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技术领域：
】本发明涉及植物组织培养
技术领域：
，具体涉及一种加快杜鹃兰种子萌发的方法。
背景技术：
：杜鹃兰属兰科杜鹃兰属多年生药用草本植物，以其干燥假鳞茎入药，外用可治蛇虫咬伤、皮肤烫伤等，内服可抗肝癌、乳腺癌等。由于人们对杜鹃兰药材的无节制采挖，导致其野生资源濒临枯竭。自然条件下，杜鹃兰几乎不能授粉结实。通过人工授粉虽可使其结果，但因其种胚发育不完全、种皮抑制等障碍因素，故其有性繁殖十分困难。人工种植中虽可采用假鳞茎繁殖，但繁殖系数极低，难以实现规模化生产。目前，有关杜鹃兰的研究主要集中在化学成分分析、药理毒理研究、组培快繁等方面，有性繁殖中如何突破其种子萌发这一难题尚鲜见报道。为此，研发筛选适宜杜鹃兰种子萌发的培养基，提升杜鹃兰有性繁殖技术水平，对杜鹃兰的人工种植具有重要的意义。技术实现要素：本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供一种加快杜鹃兰种子萌发的方法，本发明的方法能使杜鹃兰种子提早萌发，并能提高种子萌发率。为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种加快杜鹃兰种子萌发的方法，该方法包括以下步骤：(1)种子选择：选取成熟的杜鹃兰蒴果；(2)种子表面处理：采摘杜鹃兰蒴果后，用流水冲洗进行表面清洁，然后置于超净工作台内，用75％的酒精浸泡2-3min，并用无菌水洗3-5次，接着再用植物消毒液浸泡5-10min，最后用无菌水洗3-5次，用无水滤纸吸干表面水分；(3)种子消毒：以解剖刀纵向剖开蒴果，抖出杜鹃兰种子，先用75％的酒精消毒种子15-20s，无菌水洗3-5次，再植物消毒液浸泡8-12min；最后用无菌水洗3-5次，用滤纸吸干表面水分；(4)种子培养：用无菌棉棒粘取消毒后的杜鹃兰种子涂布在萌发培养基上，暗处理8d后转置到光照下继续培养，培养温度25℃，光照强度为1500lx-2000lx，培养光照时间12h/d；所述植物消毒液是由以下重量份的原料混合制成：甘草酸0.10-0.15份，柠檬汁12-15份，金银花叶提取物0.5-0.8份，吐温-602-4份，水75-100份；所述萌发培养基为ls+0.10-0.20mg/lnaa+0.05-0.08mg/lggr6+8.0-12.0g/l枸杞叶汁+15.0-20.0g/l辣木叶汁+20-40g/l蔗糖+6-8g/l琼脂，ph为5.4-5.8。本发明中，优选地，所述成熟的杜鹃兰蒴果是指异株异花授粉、且生长期在180-200天的蒴果。本发明中，优选地，所述金银花叶提取物的提取方法为：将新鲜金银花叶用8-10倍量的水煎煮2次，每次1.5-2h，合并提取液，过滤浓缩至干。本发明中，优选地，所述辣木叶汁通过以下方法得到，取新鲜辣木叶，先洗净原料，然后充分捣碎，再用纱布过滤，所得滤液即为辣木叶汁。本发明中，优选地，所述枸杞叶汁是将取新鲜枸杞叶洗净后，充分捣碎，再用纱布过滤，所得滤液即为枸杞叶汁。综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：(1)本发明对杜鹃兰种子消毒时主要采用植物消毒剂进行浸泡，该植物消毒剂是甘草酸、柠檬汁、金银花叶提取物加乳化剂吐温-60和水混合制成的；其中柠檬汁和金银花叶提取物均具有良好的杀菌抗病毒的作用，但两者复合使用时消毒效果和杀菌谱均不能满足种子消毒的需要，经本申请人反复试验后发现加入少量的甘草酸配合可起到增效作用，能大大增加消毒的效果；采用该植物消毒液可以大大降低外植体的损伤率和降低接种的污染率，降低接种的污染率，还能降种子萌发的时间提前。(2)本发明采用的培养基中添加了辣木叶汁和枸杞叶汁作为营养物质，采用naa和ggr6作为生长素，采用ls作用基础培养基，辣木叶中含有多种矿物质、维生素、20种氨基酸、46种抗氧素和36种自然防炎体和矿物质，每100克的辣木中含有的维生素c是柑橘的7倍，铁是菠菜的3倍，维生素a是胡萝卜的4倍，钙质是牛奶的4倍，钾是香蕉的3倍，蛋白质是酸奶的2倍；枸杞叶富含甜菜碱、芦丁以及多种氨基酸和微量元素等，这两种物质的联合添加，与生长调节剂、基础培养基一起作用，可以显著提高提高杜鹃兰种子的萌发率和缩短萌发时间。【具体实施方式】为了更清楚地表达本发明，以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。在本发明的实施例中，辣木叶汁、枸杞叶汁和芦荟汁的制备方法如下：辣木叶汁：先洗净叶片然后充分捣碎，再用纱布过滤，所述滤液即为辣木叶汁。枸杞叶汁：先洗净叶片然后充分捣碎，再用纱布过滤，所述滤液即为辣木叶汁。柠檬汁：先将柠檬除去表皮后，用机器搅打成汁即得。在本发明的一些实施例中，金银花提取物通过以下方法得到：将新鲜金银花叶用8倍量的水煎煮2次，每次1.5h，合并提取液，过滤浓缩至干。在本发明的另一些实施例中，金银花提取物通过以下方法得到：将新鲜金银花叶用10倍量的水煎煮2次，每次2h，合并提取液，过滤浓缩至干。上述方法得到的金银花提取物的抗菌活性没有显著的差异，故在以下实施例中，不通过具体实施例进行赘述。一、具体实施例实施例1一种加快杜鹃兰种子萌发的方法，该方法包括以下步骤：(1)种子选择：选取异株异花授粉、且生长期在180天的杜鹃兰蒴果；(2)种子表面处理：采摘杜鹃兰蒴果后，用流水冲洗进行表面清洁，然后置于超净工作台内，用75％的酒精浸泡2min，并用无菌水洗3次，接着再用植物消毒液浸泡5min，最后用无菌水洗3次，用无水滤纸吸干表面水分；所用植物消毒液是由以下重量份的原料混合制成：甘草酸0.10份，柠檬汁12份，金银花叶提取物0.5份，吐温-602份，水75份；(3)种子消毒：以解剖刀纵向剖开蒴果，抖出杜鹃兰种子，先用75％的酒精消毒种子15s，无菌水洗3次，再植物消毒液浸泡8min；最后用无菌水洗3次，用滤纸吸干表面水分；(4)种子培养：用无菌棉棒粘取消毒后的杜鹃兰种子涂布在萌发培养基上，所用萌发培养基为ls+0.10mg/lnaa+0.05mg/lggr6+8.-12.0g/l枸杞叶汁+15.0g/l辣木叶汁+20g/l蔗糖+6g/l琼脂，ph为5.5；暗处理8d后转置到光照下继续培养，培养温度25℃，光照强度为1500x，培养光照时间12h/d。实施例2一种加快杜鹃兰种子萌发的方法，该方法包括以下步骤：(1)种子选择：选取异株异花授粉、且生长期在180天的杜鹃兰蒴果；(2)种子表面处理：采摘杜鹃兰蒴果后，用流水冲洗进行表面清洁，然后置于超净工作台内，用75％的酒精浸泡2.5min，并用无菌水洗4次，接着再用植物消毒液浸泡8min，最后用无菌水洗4次，用无水滤纸吸干表面水分；所用植物消毒液是由以下重量份的原料混合制成：甘草酸0.12份，柠檬汁13份，金银花叶提取物0.6份，吐温-603份，水85份；(3)种子消毒：以解剖刀纵向剖开蒴果，抖出杜鹃兰种子，先用75％的酒精消毒种子18s，无菌水洗4次，再植物消毒液浸泡10min；最后用无菌水洗4次，用滤纸吸干表面水分；(4)种子培养：用无菌棉棒粘取消毒后的杜鹃兰种子涂布在萌发培养基上，所用萌发培养基为ls+0.15mg/lnaa+0.06mg/lggr6+10.0g/l枸杞叶汁+18.0g/l辣木叶汁+30g/l蔗糖+7g/l琼脂，ph为5.6；暗处理8d后转置到光照下继续培养，培养温度25℃，光照强度为2000lx，培养光照时间12h/d。实施例3一种加快杜鹃兰种子萌发的方法，该方法包括以下步骤：(1)种子选择：选取异株异花授粉、且生长期在180天的杜鹃兰蒴果；(2)种子表面处理：采摘杜鹃兰蒴果后，用流水冲洗进行表面清洁，然后置于超净工作台内，用75％的酒精浸泡3min，并用无菌水洗5次，接着再用植物消毒液浸泡10min，最后用无菌水洗5次，用无水滤纸吸干表面水分；所用植物消毒液是由以下重量份的原料混合制成：甘草酸0.15份，柠檬汁15份，金银花叶提取物0.8份，吐温-604份，水100份；(3)种子消毒：以解剖刀纵向剖开蒴果，抖出杜鹃兰种子，先用75％的酒精消毒种子20s，无菌水洗5次，再植物消毒液浸泡12min；最后用无菌水洗5次，用滤纸吸干表面水分；(4)种子培养：用无菌棉棒粘取消毒后的杜鹃兰种子涂布在萌发培养基上，所用萌发培养基为ls+0.20mg/lnaa+0.08mg/lggr6+12.0g/l枸杞叶汁+20.0g/l辣木叶汁+40g/l蔗糖+8g/l琼脂，ph为5.8；暗处理8d后转置到光照下继续培养，培养温度25℃，光照强度为2000lx，培养光照时间12h/d。二、不同方法对杜鹃兰种子的萌发时间和萌发率比较试验对比例1种子选择时选取同株异花授粉生长期在180天的杜鹃兰蒴果，其他培养方法与实施例2相同，考察种子的选择对萌发时间和萌发率的影响。对比例2种子选择时选取异株异花授粉生长期在160天的杜鹃兰蒴果，其他培养方法与实施例2相同，考察种子的选择对萌发时间和萌发率的影响。对比例3种子表面处理和种子消毒时，植物消毒液采用质量浓度为0.1％的次氯酸钠溶液代替，其他培养方法与实施例2相同，考察消毒方式的不同对萌发时间和萌发率的影响。对比例4种子表面处理和种子消毒时，植物消毒液不添加甘草酸，具体组成为：柠檬汁13份，金银花叶提取物0.6份，吐温-603份，水85份，其他培养方法与实施例2相同，考察消毒方式的不同对萌发时间和萌发率的影响。对比例5-7种子培养时，萌发培养基的组成分别如下：①采用ms代替ls：ms+0.15mg/lnaa+0.06mg/lggr6+10.0g/l枸杞叶汁+18.0g/l辣木叶汁+30g/l蔗糖+7g/l琼脂，ph为5.6；②培养基中不添加ggr6：ls+0.15mg/lnaa+10.0g/l枸杞叶汁+18.0g/l辣木叶汁+30g/l蔗糖+7g/l琼脂，ph为5.6。③培养基中采用土豆泥代替辣木叶汁和枸杞叶汁：ls+0.15mg/lnaa+土豆泥75g/l+30g/l蔗糖+7g/l琼脂，ph为5.6。按照实施例1-3、对比例1-7中的方法进行种子萌发试验，每组处理50粒杜鹃兰种子，每组设3个重复，记录每组的种子萌发时间，即种子播种至种胚突破种皮开始萌发的时间，以天(d)计。统计自种子开始萌发后第30d的种子萌发率。公式如下：种子萌发率＝(单位面积内的萌发种子数/供试种子总数)×100％。试验结果如下表1：表1种子萌发时间和种子萌发率萌发时间(d)萌发率(％)实施例13363实施例23064实施例33260对比例13816对比例24612对比例33846对比例46238对比例54548对比例65836对比例75926从表1的结果可以看出，实施例1-3所处理的种子萌发率高，可达64％，且种子萌发时间可以缩短至30天左右。上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。当前第1页12