本发明涉及一种无甲醛组织固定防腐液及其制备方法，属于组织固定防腐液技术领域。
背景技术：
在医学病理诊断领域，组织或组织切片的传统固定保存液为甲醛溶液(10％福尔马林)，甲醛虽然对组织固定的硬化作用强，渗透性强、杀菌效果好，但缺点也明显，强烈的刺激性气味，加上甲醛容易挥发扩散的性质，给医疗工作者对组织的后续处理和观察带来了很大障碍，不但影响工作效率，也严重影响人体健康，是导致肺病及肺癌的真凶，同时强烈的刺激性气味，使医疗工作人员的工作效率低下等，并且病理切片用福尔马林固定后由于甲醛的交联影响染色观察，需要后续的修复处理才能做显微镜下结构观察。
虽然市面上也有一些醇类或醇类组合的固定防腐液，但是这些固定防腐液固定时间比较长、效果比较差、而且改变了组织细胞的形态学结构、固定组织颜色也不是很好，并且多元醇类固定液在应用过程与甲醛固定液同样都需要做标本的修复操作，使标本处理操作繁琐，浪费了时间。
技术实现要素：
为解决传统固定防腐液(福尔马林)污染环境、危害人体健康，固定后的切片还需要修复处理环节，操作繁琐，浪费病理诊断宝贵时间，并且现存的新型固定液固定时间长、固定效果差、改变组织细胞的形态学结构、固定组织颜色不好、以及同样需要修复处理、长期保存组织或组织标本易腐败等问题。本发明提供了一种环保防腐组织固定液及其制备方法，该固定液固定性能好，防腐能力强，且不含甲醛，安全无毒，能够用于组织标本的固定和保存，采用的技术方案如下：
本发明的目的在于提供一种环保防腐组织固定液，该固定液由如下重量份的组分制备而成：41重量份～83重量份蛋白固定剂，0.04重量份～0.13重量份防腐剂，0.9重量份～3.6重量份渗透压调节剂，9重量份～39重量份保湿剂，0.1重量份～0.5重量份抗氧化剂和8重量份～30重量份水；其中蛋白固定剂由2-甲基-1,2-苯并异噻唑-3-酮(mbit)、二甲亚砜、氮酮和乙醇组成；防腐剂由5-氯-2-甲基-4异噻唑啉-3-酮(cit)和2-甲基-4异噻唑啉-3-酮(mit)组成。
优选地，所述渗透压调节剂选自硝酸钾、硝酸钠、氯化钾、氯化钠、蔗糖和氯化钙中的任意三种。
优选地，所述保湿剂选自异丙醇、丙二醇、聚乙二醇和甘油中的任意三种或四种。
优选地，所述抗氧化剂为维生素c。
优选地，所述41份～83份蛋白固定剂由1重量份～5重量份的2-甲基-1,2-苯并异噻唑-3-酮，3重量份～8重量份二甲亚砜，2重量份～5重量份氮酮和35重量份～65重量份乙醇组成。
优选地，所述0.04重量份～0.13重量份防腐剂由0.03重量份～0.1重量份5-氯-2-甲基-4异噻唑啉-3-酮和0.01重量份～0.03重量份2-甲基-4异噻唑啉-3-酮组成。
优选地，所述0.9重量份～3.6重量份渗透压调节剂由0.3重量份～0.8重量份硝酸钾、硝酸钠0.8重量份～1.2重量份、氯化钾0.3重量份～0.8重量份、氯化钠0.8重量份～1.2重量份、蔗糖0.8重量份～1.2重量份和氯化钙0.3重量份～0.8重量份中的任意三种组成。
优选地，所述9重量份～39重量份保湿剂由3重量份～8重量份异丙醇、3重量份～8重量份丙二醇、5重量份～15重量份聚乙二醇和3重量份～8重量份甘油中的任意三种或四种组成。
更优选地，所述组织固定防腐保存液由如下重量份的组分制备而成：2-甲基-1,2-苯并异噻唑-3-酮2重量份，二甲亚砜7重量份，氮酮3重量份，乙醇55重量份；5-氯-2-甲基-4异噻唑啉-3-酮0.06重量份，2-甲基-4异噻唑啉-3-酮0.02重量份；硝酸钠0.5重量份，氯化钠1重量份，蔗糖1重量份；异丙醇5重量份，丙二醇5重量份，聚乙二醇10重量份；维生素c0.2重量份；水10.22重量份。
本发明还提供了一种上述的固定防腐保存液的制备方法，该制备方法是将2-甲基-1,2-苯并异噻唑-3-酮、二甲亚砜和氮酮溶解于乙醇，将渗透压调节剂、防腐剂、抗氧化剂溶解于水，然后将上述获得的两种混合液混合后再加入保湿剂，搅拌均匀获得固定防腐保存液。
本发明有益效果：
本发明首次将2-甲基-1,2-苯并异噻唑-3-酮(mbit)用于组织固定的技术领域，本发明固定防腐保存液中的2-甲基-1,2-苯并异噻唑-3-酮(mbit)作为的固定剂，兼具组织及组织标本固定和防腐的双重作用功效。传统固定液如甲醛固定液是通过组织蛋白交联进行固定的，而本发明通过将2-甲基-1,2-苯并异噻唑-3-酮(mbit)作为固定防腐液，使得其与组织蛋白或脂蛋白中的半胱氨酸共价键结合，同时还能够破坏蛋白中的二硫键并与之共价结合，进而使酶类功能性蛋白物质和非酶类结构性蛋白失活，从而达到固定组织标本的目的。本发明未遵循现有的固定原理的思路，而是开辟了一种新的思路来实现固定组织标本的目的。
本发明中没有使用甲醛，避免了甲醛对医疗工作者及其相关人员的健康威胁，并且本发明的固定防腐保护液无需像甲醛一样使蛋白质交联而使其失活，因此本发明的固定防腐保护液在组织标本做病理切片中无需做组织修复处理的工作，大大简化了繁琐操作步骤，能够显著提高医疗病理诊断工作者的工作效率。
本发明固定防腐保存液固定速度快，固定效果和防腐效果好，利用本发明固定防腐保存液制作的标本硬而韧，不含甲醛，安全无毒环保。本发明的固定防腐保存液能够用于组织器或标本保存和病理分析前标本固定，及对手术采集的样本进行固定保存处理。
本发明的固定防腐保存液中还包含渗透调节剂、保湿剂、抗氧化剂，可以起到增效作用，使得溶液的渗透速度快、固定效果好、组织可以长期保存在固定防腐保存液中，从内到外不霉变，组织不自溶、不收缩、颜色自然、硬度适中、组织细胞接近鲜活状态。另本发明液配制方法简单，原料易得。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
一种无甲醛组织固定防腐液，由如下重量份的组分组成：
41重量份～83重量份蛋白固定剂：由1重量份～5重量份2-甲基-1,2-苯并异噻唑-3-酮，3重量份～8重量份二甲亚砜，2重量份～5重量份氮酮和35重量份～65重量份乙醇组成；
0.04重量份～0.13重量份防腐剂：由0.03重量份～0.1重量份5-氯-2-甲基-4异噻唑啉-3-酮(cit)和0.01重量份～0.03重量份2-甲基-4异噻唑啉-3-酮(mit)组成；
0.9重量份～3.6重量份渗透压调节剂：由0.3重量份～0.8重量份硝酸钾、硝酸钠0.8重量份～1.2重量份、氯化钾0.3重量份～0.8重量份、氯化钠0.8重量份～1.2重量份、蔗糖0.8重量份～1.2重量份和氯化钙0.3重量份～0.8重量份中的任意三种组成；
9重量份～39重量份保湿剂：由3重量份～8重量份异丙醇、3重量份～8重量份丙二醇、5重量份～15重量份聚乙二醇和3重量份～8重量份甘油中的任意三种或四种组成；
0.1重量份～0.5重量份抗氧化剂：抗氧化剂为维生素c；
8重量份～30重量份水。
实施例1
本实施例提供了一种无甲醛组织固定防腐溶液组合物，它由2-甲基-1,2-苯并异噻唑-3-酮(mbit)、二甲亚砜、乙醇、氮酮、5-氯-2-甲基-4异噻唑啉-3-酮(cit)和2-甲基-4异噻唑啉-3-酮(mit)、kno3、kcl、cacl2、异丙醇、丙二醇、甘油、维生素c和纯净水组成；各组分具体重量如下：
2-甲基-1,2-苯并异噻唑-3-酮(mbit)1.0kg，二甲亚砜3kg，氮酮2kg和乙醇35kg(共计41kg蛋白固定剂)；
5-氯-2-甲基-4异噻唑啉-3-酮(cit)0.03kg和2-甲基-4异噻唑啉-3-酮(mit)0.01kg(共计0.04kg防腐剂)；
硝酸钾0.3kg，氯化钾0.3kg和氯化钙0.3kg(共计0.9kg渗透压调节剂)；
异丙醇3kg，丙二醇3kg和甘油3kg(共计9kg保湿剂)；
0.1kg维生素c；
8kg水。
将上述重量的组分按照如下方法配制成固定防腐保存液：将2-甲基-1,2-苯并异噻唑-3-酮、二甲亚砜、氮酮溶解于乙醇，将渗透压调节剂、防腐剂、抗氧化剂溶解于水，然后将上述获得的两种混合液混合后再加入保湿剂，搅拌均匀获得固定防腐保存液。
使用方法：
将组织或组织切片浸与5倍的以上体积的本发明固定防腐保存液中，使其浸没，密闭容器，2h～4h以后完成组织或组织切片固定，取出组织/组织切片做其他使用或长期保存，密闭条件下固定防腐保存液的有效使用期限为2年。
实施例2
本实施例提供了一种无甲醛组织固定防腐溶液组合物，它由2-甲基-1,2-苯并异噻唑-3-酮(mbit)、二甲亚砜、氮酮、乙醇、kcl、nano3、蔗糖、2-甲基-4异噻唑啉-3-酮(mit)、5-氯-2-甲基-4异噻唑啉-3-酮(cit)、异丙醇、丙二醇、聚乙二醇、维生素c和纯净水组成；各组分具体重量如下：
2-甲基-1,2-苯并异噻唑-3-酮(mbit)5.0kg，二甲亚砜8kg，氮酮5kg和乙醇65kg(共计83kg蛋白固定剂)；
5-氯-2-甲基-4异噻唑啉-3-酮(cit)0.1kg和2-甲基-4异噻唑啉-3-酮(mit)0.03kg(共计0.13kg防腐剂)；
硝酸钠1.2kg，氯化钠1.2kg和蔗糖1.2kg(共计3.6kg渗透压调节剂)；
异丙醇8kg，丙二醇8kg，聚乙二醇15g和甘油8kg(共计39kg保湿剂)；
0.5kg维生素c；
30kg水。
将上述重量的组分按照如下方法配制成固定防腐保存液：将2-甲基-1,2-苯并异噻唑-3-酮、氮酮、二甲亚砜溶解于乙醇，将渗透压调节剂、防腐剂、抗氧化剂溶解于水，然后将上述获得的两种混合液混合后再加入保湿剂，搅拌均匀获得固定防腐保存液。
使用方法：
将组织或组织切片浸与5倍的以上体积的本发明固定防腐保存液中，使其浸没，密闭容器，2h～4h以后完成组织或组织切片固定，取出组织/组织切片做其他使用或长期保存，密闭条件下固定防腐保存液的有效使用期限为2年。
实施例3
本实施例提供了一种无甲醛组织固定防腐液组合物，它由2-甲基-1,2-苯并异噻唑-3-酮(mbit)、二甲亚砜、氮酮、乙醇、nano3、蔗糖、nacl、2-甲基-4异噻唑啉-3-酮(mit)、5-氯-2-甲基-4异噻唑啉-3-酮(cit)、异丙醇、丙二醇、聚乙二醇、维生素c和水；各组分具体重量如下：
2-甲基-1,2-苯并异噻唑-3-酮(mbit)2kg，二甲亚砜7kg，氮酮3kg和乙醇55kg(共计67kg蛋白固定剂)；
5-氯-2-甲基-4异噻唑啉-3-酮0.06kg和2-甲基-4异噻唑啉-3-酮0.02kg(共计0.08kg防腐剂)；
硝酸钠0.5kg，氯化钠1kg和蔗糖1kg(共计2.5kg渗透压调节剂)；
异丙醇5kg，丙二醇5kg，聚乙二醇10g(共计20kg保湿剂)；
0.2kg维生素c；
10.22kg水。
将上述重量的组分按照如下方法配制成固定防腐保存液：将2-甲基-1,2-苯并异噻唑-3-酮、二甲亚砜、氮酮溶解于乙醇，将渗透压调节剂、防腐剂、抗氧化剂溶解于水，然后将上述获得的两种混合液混合后再加入保湿剂，搅拌均匀获得固定防腐保存液。
使用方法：
将组织或组织切片浸与5倍的以上体积的本发明固定防腐保存液中，使其浸没，密闭容器，2h～4h以后完成组织或组织切片固定，取出组织/组织切片做其他使用或长期保存，密闭条件下固定防腐保存液的有效使用期限为2年。
实施例4
本实施例与实施例3的区别在于：渗透压调节剂为2.4kg：由0.8kg硝酸钠，0.8kg氯化钠和0.8kg蔗糖组成，其他成分均匀实施例3相同。配置方法和使用方法均与实施例3相同，同样可以达到2年的有效使用期限。
实施例5
本实施例与实施例3的区别在于：渗透压调节剂为2.4kg：由0.8kg硝酸钾，0.8kg氯化钾和0.8kg氯化钙组成，其他成分均匀实施例3相同。配置方法和使用方法均与实施例3相同，同样可以达到2年的有效使用期限。
实施例6
本实施例与实施例3的区别在于：保湿剂为15kg：由5kg丙二醇，5kg聚乙二醇和5kg甘油组成，其他成分均匀实施例3相同。配置方法和使用方法均与实施例3相同，同样可以达到2年的有效使用期限。
通过如下实验说明本发明所能够获得的有益效果：
对照例1：市场上现有的福尔马林固定液(10％福尔马林的水溶液)，根据实际使用经验及文献报道，固定时间大约在2h-4h；
对照例2：常规多元醇固定液(乙醇、异丙醇、叔丁醇、丙二醇等组合物)，根据实际使用经验及文献报道，固定时间大约在4h-8h；
利用实施例1-6制备的固定防腐液，以及市场上比较常规的10％福尔马林固定液和常规多元醇固定液对肝脏、直肠、肾脏进行固定实验，对固定效果等指标进行检测记录，结果如表1所示，具体固定实验的方法为：
将组织或组织切片浸与5倍体积的以上的固定液中，使其浸没，密闭容器，24h以后完成组织或组织切片固定。
表1固定防腐液对标本(小组织)的固定防腐情况
由表1可知：通过对比实施例1-6和对照1、对照例2可知：本发明实施例1-6在固定速度、固定效果、防腐效果、标本硬度、环境污染和成本等方面的效果均优于对照例1和2，本发明相比于现有技术取得了显著的进步：第一，固定时间显著短于多元醇类和甲醛固定液；第二，固定后组织与活体组织的生物学形态非常接近，不改变组织细胞的形态学结构，固定效果好；第三，固定后的组织无异味，组织内部无自溶或腐败现象发生；第四，标本硬度强且韧性大，容易切割而又不容易撕裂；第五，不含甲醛等有毒有机试剂，安全环保，解决了传统固定防腐液(福尔马林)污染环境、危害人体健康的问题；第六，本发明实施例1-6固定后的切片无需修复处理环节，操作简单，节约病理诊断宝贵时间，解决了甲醛固定液需要后续修复处理，操作繁琐，诊断时间长的问题；第七，试剂成本可以接受属于低中档。
通过对比实施例1-6可知：实施例3的固定液各个方面的效果最好，因此该实施例为最优实施例。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。