本发明具体涉及农业生物技术及诱变育种领域，具体而言涉及一种内源抗草甘膦水稻的筛选方法及内源epsps基因。
背景技术：
草甘膦又名n-(膦羧甲基)甘氨酸；农达(roundup)；膦甘酸；镇草宁，是一种无残留、非选择性、灭生性除草剂，对多年生杂草效果很好，应用广。草甘膦通过植物叶片角质层吸收后，在体内经木质部和韧皮部传导至植物的分生组织，从而对植物的细胞分裂、呼吸作用及代谢合成产生干扰作用。草甘膦分子与磷酸烯醇式丙酮酸竞争性结合5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthase,epsps)的活性位点，终止了芳香族氨基酸的合成途径，造成苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的缺乏，植物最终失绿而亡。利用于细菌、植物抗性细胞系的epsps基因可大大提高植物对草甘膦的耐受性。是转基因除草剂作物的研究热点，推广面积最大，经济效益最高的抗草甘膦作物。现已成功研制的抗草甘膦作物有：水稻、大豆、玉米、油菜、烟草、花生、番茄、马铃薯、向日葵、春小麦、苜蓿、胡萝卜、洋葱、菠菜、南瓜、百脉根等20多种植物。由于抗草甘膦作物在世界各地区的推广与种植，影响了除草剂新品种的筛选与开发、世界除草剂销售市场，以及食品工业，还引起作物栽培方式及跟作制度。
水稻作为我国的主要粮食作物，水稻杂草危害也比较严重；目前，抗草甘膦的农作物，尤其是水稻，几乎都是通过转基因的手段获得，但是目前民众对转基因食物接受度差，因此能够开发内源抗草甘膦的水稻，就成了一种迫切的需要。
技术实现要素：
本发明的第一目的在于提供内源抗草甘膦水稻的筛选方法，通过本筛选方法，可以筛选出草甘膦抗性较好的水稻，既能满足抗性需要，又能避免生产中的限制。
本发明的第二目的在于提供水稻抗草甘膦的内源epsps基因，该内源epsps基因具备较强的草甘膦抗性。
为了实现本发明的上述目的，采用以下技术方案：
一种内源抗草甘膦水稻的筛选方法，包括以下步骤：
将水稻稻种通过诱变，获得水稻诱变种；
种植水稻诱变种，获得原代突变种；
将原代突变种进行传代种植，并用草甘膦处理；获得内源抗草甘膦水稻。
一种水稻抗草甘膦的内源epsps基因，水稻抗草甘膦的内源epsps基因通过上述的内源抗草甘膦水稻的筛选方法筛选得到。
本发明的有益效果为：本发明提供的内源抗草甘膦水稻的筛选方法，将普通种的水稻品种，通过诱变和筛选，筛选出草甘膦抗性较好的水稻品种，既能满足对草甘膦的抗性需求，又能避免使用转基因手段；通过上述手段筛选得到的抗性基因，还能运用到其他禾本科农作物中，提供抗性，具有较大的产业应用价值和较好的推广应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实验例1提供的抗性植株的抗性基因电泳结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
草甘膦(glyphosate)是由美国孟山都公司(monsantocompany,st.louis，mo)于1970年开发的一种有机磷除草剂。自1974年在美国登记注册(商品名roundup，中文名农达)以来被广泛应用于农业、城镇、花园、森林等环境下防除草剂，至今已成为全世界使用面积最大的除草剂，其同类产品还有aquamaster(monsantocompany，st.louis，mo)和rodeo(dowagrosciences，indianapolis,in)，主要应用于水环境下杂草的防治。
其主要成分草甘膦发挥作用的途径是抑制植物体内莽草酸途径中的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(epsps)活性，使受害植株不能持续合成必需氨基酸进而影响植物正常生长乃至死亡。
由于普通水稻的莽草酸途径也会被抑制，容易导致水稻死亡；通过诱变5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(epsps)基因，提高水稻草甘膦抗性。
下面对本发明实施例的一种内源抗草甘膦水稻的筛选方法及内源epsps基因进行具体说明。
一种内源抗草甘膦水稻的筛选方法，包括以下步骤：
将水稻稻种通过诱变，获得水稻诱变种；
种植水稻诱变种，获得原代突变种；
将原代突变种进行传代种植，并用草甘膦处理；获得内源抗草甘膦水稻。
进一步地，在本发明的较佳实施例中，诱变包括化学诱变或辐射诱变。
由于遗传物质在自然状态下发生突变的几率极小，且突变还存在正向突变和负向突变；要获得优异的突变品种，就需要大量的样本进行筛选；因此，通过化学诱变或者辐射诱变等化学或物理的方法，提高遗传物质发生突变的几率，然后通过相应的筛提高选压，进行筛选；多代的累积筛选，获得表现优异的品种。
本发明中，通过化学诱变或辐射诱变，提高水稻的突变几率，然后通过筛选，可以获得抗性较强的水稻品种。
进一步地，在本发明的较佳实施例中，化学诱变采用甲基磺酸乙酯ems浸泡水稻稻种，甲基磺酸乙酯ems的浓度为0.3％-0.7％，浸泡的时间为6-8h。
甲基磺酸乙酯ems被证明是最为有效而且负面影响小的诱变剂。与其他烷化诱变剂类似，是通过与核苷酸中的磷酸、嘌呤和嘧啶等分子直接反应来诱发突变。甲基磺酸乙酯ems诱发的突变主要通过两个步骤来完成,首先鸟嘌呤的o6位置被烷基化，成为一个带正电荷的季铵基团,从而发生两种遗传效应:一是烷化的鸟嘌呤与胸腺嘧啶配对，代替胞嘧啶，发生转换型的突变；二是由于鸟嘌呤的n27烷基活化，糖苷键断裂造成脱嘌呤而后在dna复制过程中，烷基化鸟嘌呤与胸腺嘧啶配对，导致碱基替换，即g∶c变为a∶t。当然，化学诱变存在着染色体结构和数量方面的诱导变异，但这种单一碱基对改变而形成的点突变仍是化学诱变的主要形式。这样的点突变将是品种改良和退化特性恢复的希望所在。诱变剂也可与核苷结构的磷酸反应，形成酯类而将核苷酸从磷酸与糖分子之间切断，产生染色体的缺失。这些dna结构上的变化都可能促使不表达的基因或区段被激活，而表现出被掩盖的性状。甲基磺酸乙酯ems化学诱变产生点突变的频率较高，而染色体畸变相对较少，可以对作物的某一种特殊性状进行改良。与其它诱变剂相比，甲基磺酸乙酯ems诱变后产生的突变频率高，且多为显性突变体，易于突变体的筛选。甲基磺酸乙酯ems是目前运用最广泛也是公认最为有效的诱变剂。
由于辐射诱变操作麻烦，虽然也是效果也较好；但是对环境等要求较高；因此，比较看甲基磺酸乙酯ems诱变是更为合适的选择。
进一步地，在本发明的较佳实施例中，水稻稻种进行诱变前还包括前处理，前处理为将水稻稻种用水在15℃-26℃条件下浸泡4-7h。
进一步地，在本发明的较佳实施例中，种植水稻诱变种前还包括对水稻诱变种进行出苗，出苗包括将水稻诱变种进行出芽，然后移植到苗床培育25-33天。
进一步地，在本发明的较佳实施例中，原代突变种进行传代种植包括对原代突变种进行消毒和发芽。
进一步地，在本发明的较佳实施例中，消毒采用0.4％-0.8％的次氯酸钠溶液进行，消毒的时间为17-26min。
对种子进行消毒，可以避免微生物影响，导致种子发芽失败，提高种子的发芽率。
进一步地，在本发明的较佳实施例中，发芽是将经过消毒的原代突变种在38-45℃浸泡40-48h后，在33-42℃的条件下进行出芽。
消毒时间不宜过长；时间过长，消毒剂也会对种子的胚乳等产生影响，影响发芽；温度高也容易伤害胚乳、胚芽等结构。
进一步地，在本发明的较佳实施例中，草甘膦的浓度为1‰-6‰。
草甘膦的浓度过高，在普通的实施过程中，没有实际使用意义，因此，具有针对性的选用合适浓度的草甘膦，对筛选具有草甘膦抗性的水稻，具有重要的作用。
一种水稻抗草甘膦的内源epsps基因，水稻抗草甘膦的内源epsps基因通过上述的内源抗草甘膦水稻的筛选方法筛选得到。
从获得的内源抗草甘膦水稻的品种中，通过提取草甘膦抗性基因，该草甘膦抗性基因可以应用到较广的范围内，尤其是在农业生产中具有较高的利用价值。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供一种内源抗草甘膦水稻的筛选方法，筛选的具体步骤为：
包括甲基磺酸乙酯ems诱变和草甘膦筛选两个主要过程。
甲基磺酸乙酯ems诱变的主要步骤包括：
1.1去颗粒饱满的水稻稻种，用清水在15℃条件下浸泡7h；
1.2再用0.3％的甲基磺酸乙酯ems浸泡8h；
1.3取出浸泡水稻稻种，并用水将残留的甲基磺酸乙酯ems冲洗掉，获得水稻诱变种。
获得的水稻诱变种通常称为m0代种子。
用草甘膦筛选水稻诱变种，以获得抗草甘膦的水稻品种；具体方法为：
2.1将作为m0代种子的水稻诱变种于42℃的恒温箱中浸种2天至露白；
2.2再将已经露白的种子放入37℃的培养箱中出芽，种子长出根和胚芽鞘；
2.3件已经长根和胚芽鞘的种子移栽到苗床，苗床培育25天后，将幼苗移栽到大田；
2.4大田幼苗以20cm×25cm的株行距进行单株种植，常规水肥管理，单株收取种子，为原代突变种(m1代种子)；
2.5将原代突变种(m1代种子)单株选取10粒为一组，用0.4％的次氯酸钠溶液消毒26min，冲洗干净；
2.6将冲洗干净的m1代种子在38℃的条件下浸种48h至露白，然后33℃的条件下出芽1天，播种于苗床，30天后移栽到大田，单株收获种子为m2代种子；
2.7将m2代种子随机选取约20000粒育苗至三叶期；用6‰的草甘膦水剂喷施幼苗；
2.8将存活的水稻苗培养并收获，获得内源抗草甘膦水稻。
实施例2
本实施例提供一种内源抗草甘膦水稻的筛选方法，筛选的具体步骤为：
包括甲基磺酸乙酯ems诱变和草甘膦筛选两个主要过程。
甲基磺酸乙酯ems诱变的主要步骤包括：
1.1去颗粒饱满的水稻稻种，用清水在26℃条件下浸泡4h；
1.2再用0.7％的甲基磺酸乙酯ems浸泡6h；
1.3取出浸泡水稻稻种，并用水将残留的甲基磺酸乙酯ems冲洗掉，获得水稻诱变种。
获得的水稻诱变种通常称为m0代种子。
用草甘膦筛选水稻诱变种，以获得抗草甘膦的水稻品种；具体方法为：
2.1将作为m0代种子的水稻诱变种于42℃的恒温箱中浸种2天至露白；
2.2再将已经露白的种子放入37℃的培养箱中出芽，种子长出根和胚芽鞘；
2.3件已经长根和胚芽鞘的种子移栽到苗床，苗床培育33天后，将幼苗移栽到大田；
2.4大田幼苗以20cm×25cm的株行距进行单株种植，常规水肥管理，单株收取种子，为原代突变种(m1代种子)；
2.5将原代突变种(m1代种子)单株选取10粒为一组，用0.8％的次氯酸钠溶液消毒17min，冲洗干净；
2.6将冲洗干净的m1代种子在45℃的条件下浸泡40h至露白，然后42℃的条件下出芽1天，播种于苗床，30天后移栽到大田，单株收获种子为m2代种子；
2.7将m2代种子随机选取约20000粒育苗至三叶期；用1‰的草甘膦水剂喷施幼苗；
2.8将存活的水稻苗培养并收获，获得内源抗草甘膦水稻。
实施例3
本实施例提供一种内源抗草甘膦水稻的筛选方法，筛选的具体步骤为：
包括甲基磺酸乙酯ems诱变和草甘膦筛选两个主要过程。
甲基磺酸乙酯ems诱变的主要步骤包括：
1.1去颗粒饱满的水稻稻种，用清水在26℃条件下浸泡5h；
1.2再用0.5％的甲基磺酸乙酯ems浸泡8h；
1.3取出浸泡水稻稻种，并用水将残留的甲基磺酸乙酯ems冲洗掉，获得水稻诱变种。
获得的水稻诱变种通常称为m0代种子。
用草甘膦筛选水稻诱变种，以获得抗草甘膦的水稻品种；具体方法为：
2.1将作为m0代种子的水稻诱变种于42℃的恒温箱中浸种2天至露白；
2.2再将已经露白的种子放入37℃的培养箱中出芽，种子长出根和胚芽鞘；
2.3件已经长根和胚芽鞘的种子移栽到苗床，苗床培育30天后，将幼苗移栽到大田；
2.4大田幼苗以20cm×25cm的株行距进行单株种植，常规水肥管理，单株收取种子，为原代突变种(m1代种子)；
2.5将原代突变种(m1代种子)单株选取10粒为一组，用0.5％的次氯酸钠溶液消毒20min，冲洗干净；
2.6将冲洗干净的m1代种子在42℃的条件下浸泡44h至露白，然后42℃的条件下出芽1天，播种于苗床，30天后移栽到大田，单株收获种子为m2代种子；
2.7将m2代种子随机选取约20000粒育苗至三叶期；用2.5‰的草甘膦水剂喷施幼苗；
2.8将存活的水稻苗培养并收获，获得内源抗草甘膦水稻。
实验例1
选取贵州地方稻种黎平杂边禾成熟胚种子，先以自来水常温浸种5h后，再用0.5％的化学诱变剂甲基磺酸乙酯ems溶液常温浸泡水稻种子8h，以流水冲洗处理后的种子至除尽表面的残留的ems，此处理的水稻种子即为m0代种子。将m0代种子于42℃恒温箱浸种2天至露白后，再放入37℃培养箱中催芽1天待种子根与胚芽鞘长出后播种于苗床，30天后将幼苗移栽至大田，以20cm×25cm株行距进行单株种植，常规肥水管理，生育期观测植株表型，单株收取m1种子。每处理株系各选取m1代种子10粒，以浓度为0.5％的naclo3进行种子消毒，消毒时间为20min，以流水冲洗直至除尽表面的消毒液后，在42℃恒温箱浸种2天至露白，37℃培养箱中催芽1天，播种于苗床，30天后移栽幼苗至大田，常规肥水管理，各生育期对植株表型进行观测，筛选突变体，单株收取具有表型变异的m2种子。
草甘膦田间杂草致死浓度的测定；
在试验田化为20个小田块，分为两组，每组10块，草甘膦(产品名：草甘膦异丙胺盐，草甘膦含量30％，青岛奥迪斯生物科技有限公司)田间喷施浓度为183-488g/亩的范围内，设有0、1.0‰、1.5‰、2.0‰、2.5‰、3.0‰、3.5‰、4.0‰、4.5‰、5.0‰和6.0‰十个浓度的草甘膦对应每组的10个小田块，并统计杂草死亡比例，杂草死亡率大于80％位致死浓度，通过实验得出草甘膦田间杂草敏感致死浓度为2.5‰，两组实验田块的致死率结果如表1所示。
表1杂草草甘膦致死率结果
将收获的m2代种子育苗至三叶期，用草甘膦田间致死浓度2.5‰的草甘膦水剂进行喷洒，经过5～10天观察，对存活植株移栽观察，经过一个月观察，通过重复喷洒2.5‰浓度的草甘膦水剂筛选，存活苗确定为草甘膦抗性水稻，获得两株存活苗，最终获得一株抗性较强的植株命名为osgr。
将获得的草甘膦抗性水稻取样，克隆草甘膦抗性水稻的抗草甘膦的内源草甘膦基因。
提取水稻叶片的rna，用于克隆抗草甘膦的内源草甘膦基因。根据水稻epsps基因的序列设计扩增引物，扩增基因的上游引物为：osepsps-f：5’-cccaagcttgggatggcgtccaacgccgcg-3’；下游引物为：osepsp-r：5’-ggaattcctcagttcctgacgaaagtgc-3’；pcr扩增反应体系为：takaralataq(5u/μl，2×gcbufferⅰ12.5μl，dntpmixture(各2.5mm)4μl，rna：2.5μl，osepsps-f：0.5μl，osepsp-r：0.5μl，ddh2o：4.75μl，(25μl体系)。反应条件为：94℃3min，[94℃30s，(60-55℃30s)72℃3.5min]5cycles；[94℃30s，55℃30s，72℃3.5min，30cycles]72℃7min，4℃forever，35cycles。电泳：1％琼脂糖凝胶，电压90v，40min。扩增获得目标条带电泳图。
如图1所示，突变株osgr的抗草甘膦的内源草甘膦基因的条带较为明显。
用takarapcrpurifcationkit试剂盒回收目标片段。测序，野生型条带测序结果与已报到的epsps基因cds序列相同，突变株osgr抗草甘膦除草剂基因测序碱基序列如seqidno.1所示，通过序列比对，发现有3个碱基发生突变，即突变体osgr的epsps基因cds序列中第226位碱基c变为g，导致第76位的脯氨酸p变成丙氨酸a；第301位碱基g变为t，导致第101位的a变为s，第311位碱基a变为c，104位的e变为a。
综上所述，本发明实施例的内源抗草甘膦水稻的筛选方法，能够获得高抗草甘膦的抗性植株，然后通过克隆抗性植株内源epsps基因，获得抗性植株抗草甘膦的抗药性基因epsps，具有较高的应用价值和社会推广价值。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。