本发明涉及一种造血干细胞冻存方法。
背景技术：
造血干细胞是血液系统中的成体干细胞，是一个异质性的群体，具有长期自我更新的能力和分化成各类成熟血细胞的潜能。它是研究历史最长且最为深入的一类成体干细胞，对研究各类干细胞，包括肿瘤干细胞，具有重要指导意义。血液系统中的成熟细胞寿命极短，因此在人的一生中，造血干细胞需要根据机体的生理需求适时的补充血液系统各个成熟细胞组分。同时在损伤、炎症等应激状态下，造血干细胞也扮演着调节和维持体内血液系统各个细胞组分的生理平衡的角色。造血干细胞在临床上应用极为广泛，造血干细胞冻存是保证造血干细胞移植成功的关键技术之一，故其冻存方式尤为重要。目前临床造血干细胞冻存有-196℃液氮程控降温保存和-80℃非程控降温保存，前者能长期保存且细胞损伤少，一般可保存23～25年，但操作复杂、设备昂贵，解冻后有细胞凝集现象，后者可保存干细胞1～2年，其操作相对简便、费用低，但保存细胞时间及细胞活性受限。探索一种操作简便、快速、成本低廉及保存时间更长的干细胞冻存方法，对于临床造血干细胞的储存、应用及造血干细胞移植成功具有重要意义。在造血干细胞的冻存中，使用的冻存剂及方法均非常重要。目前应用于-80℃低温保存干细胞的保护剂有二甲基亚砜(下称DMSO)、CP-1、羟乙基淀粉、RPMI1640培养基、人血白蛋白等，不同的保护剂的配方及使用方法差异较大，对干细胞的保存效果与保存时间也存在差异，多数保存细胞的存活率为80％左右，干细胞安全难以保证，一些冻存方法还存在操作复杂缺点。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种造血干细胞的冷冻保存方法，细胞存活率更高，本发明克服了传统的技术偏见。
为了实现以上目的，本发明的技术方案如下：造血干细胞冻存方法，其特征在于：包括橡皮塞、多个中空橡皮球以及密封容器；
密封容器的顶部设置有一开口，开口上设置有橡皮塞，多个中空橡皮球设置于密封容器内部，并且各个中空橡皮球之间连接，中空橡皮球的直径大于等于2cm；中空橡皮球表面设置多个孔；
第一步，准备一个消毒后的注射器，注射器的针孔插入橡皮塞，利用注射器将密封容器内的空气抽完；
第二步，取造血干细胞保护剂、造血干细胞悬液或骨髓液，体积比为1-2:6；将造血干细胞悬液或骨髓液与造血干细胞保护剂混合均匀，通过注射器注入到密封容器内，轻轻的摇晃密封容器2-3分钟；
第三步，利用注射器将事先高温处理过的空气注入到密封容器内，使得密封容器内的压强介于2.0-3.0个大气压之间；然后将密封容器放入-80℃冰箱保存12小时；
所述的造血干细胞保护剂由试剂A和试剂B组成，试剂A与试剂B的体积比为2：3；
所述试剂A由二甲基亚砜、RPMI1640无菌培养基、羟乙基淀粉组成，溶剂为生理盐水，二甲基亚砜、RPMI1640无菌培养基、羟乙基淀粉的质量百分比分别为30％、5％、15％；
所述试剂B为人血白蛋白溶液，人血白蛋白的质量百分比为10％。
更加优选的技术方案，所述的造血干细胞保护剂、造血干细胞悬液或骨髓液的体积比为1.5:6。
以上体积的单位均为ml。
二甲基亚砜(DMSO)具有高极性、高沸点、热稳定性好、与水混溶的特性，能溶于乙醇、丙醇、苯和氯仿等大多数有机物，被誉为“万能溶剂”。
与现有技术方案相比，本发明的有益效果：采用密封容器充入消毒空气的方法，通过实验发现粒细胞巨噬细胞集落生成单位CFU-GM、细胞活力、CD34+细胞回收率的检测明显高于传统方法保存效果，原因在于现有的造血干细胞保护剂在冷冻过程相较于造血干细胞悬液而言要冷冻的快点，大约在毫秒级，造血干细胞悬液中的细胞也比较活跃在慢于保护剂冷冻的过程中容易与保护剂碰撞摩擦，从而导致细胞活力降低、CD34+和CFU-GM数值降低，本发明克服了技术偏见，将高温消毒(冷却后)的空气注入密封容器并且一部分充满在中空橡皮球中，当造血干细胞悬液和保护剂进入密封容器中时，空气会进入到造血干细胞悬液和保护剂中，这样在冷冻过程中虽然造血干细胞慢于保护剂冷冻的速度但是由于充满了大量的空气可以很好的保护造血干细胞与保护剂之间的摩擦碰撞。
附图说明
图1是密封容器的结构示意图。
其中1是橡皮塞；2是中空橡皮球；3是密封容器。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步说明。
实施例：造血干细胞冻存新方法，包括橡皮塞、多个中空橡皮球以及密封容器；
密封容器的顶部设置有一开口，开口上设置有橡皮塞，多个中空橡皮球设置于密封容器内部，并且各个中空橡皮球之间连接，中空橡皮球的直径等于2cm；
第一步，准备一个消毒后的注射器，注射器的针孔插入橡皮塞，利用注射器将密封容器内的空气抽完；
第二步，取造血干细胞保护剂、造血干细胞悬液或骨髓液，体积比为1:4；将造血干细胞悬液或骨髓液与造血干细胞保护剂混合均匀，通过注射器注入到密封容器内，轻轻的摇晃密封容器3分钟；
第三步，利用注射器将事先高温处理过的空气注入到密封容器内，使得密封容器内的压强介于2.8个大气压；然后将密封容器放入-80℃冰箱保存12小时；
所述的造血干细胞保护剂由试剂A和试剂B组成，试剂A与试剂B的体积比为2：3；所述试剂A由二甲基亚砜、RPMI1640无菌培养基、羟乙基淀粉组成，溶剂为生理盐水，二甲基亚砜、RPMI1640无菌培养基、羟乙基淀粉的质量百分比分别为30％、5％、15％；所述试剂B为人血白蛋白溶液，人血白蛋白的质量百分比为10％。
按照以上方法制备造血干细胞保护剂150ml+250ml，准备600ml(A组)+600ml(B组)+600ml(C组)造血干细胞悬液，取上述150ml保护剂与600ml(C组)造血干细胞混合均匀，分成10份分别装入10个密封袋保存，作为C组试验用。
实验一共分3组即A,B,C，每组分别采用10个密封袋保存，采用本发明技术方案和传统的冻存方案在不同时间点进行抽样检测，每组的数据均取平均值(即每组的数据均是取10个数据的平均值)，结果如下。
本发明冻存方法与传统造血干细胞冻存方法实际效果比较如下表，其中传统冻存方法指-196℃液氮程控降温保存和-80℃非程控降温保存，传统冻存方法(包括保护剂配比)属于现有的公知技术，不详细描述。但是传统保护剂的配比各个资料文件中数值略有不同，为了更好的进行试验，以下试验中传统冻存方法(即传统-196℃液氮程控降温保存)采用的保护剂中二甲基亚砜、羟乙基淀粉、人血白蛋白的质量百分比为10％，6％，4％；保护剂与造血干细胞悬液的体积比为1:4。传统冻存方法(传统-80℃非程控降温保存)采用的保护剂中二甲基亚砜，1640、血液保存液I的质量百分比为10％,5％，4％，保护剂与造血干细胞悬液的体积比为1:4。
一种用于造血干细胞冻存的装置，包括橡皮塞、多个中空橡皮球以及密封容器；
密封容器的顶部设置有一开口，开口上设置有橡皮塞，多个中空橡皮球设置于密封容器内部，并且各个中空橡皮球之间连接，中空橡皮球的直径大于等于2cm；中空橡皮球的表面设置多个孔。
表1是冻存过程中不同时间点细胞活力的检测(％)
表2是冻存过程中不同时间点粒细胞巨噬细胞集落生成单位CFU-GM的检测(每10万个细胞)
表3是冻存过程中不同时间点CD34+细胞(造血干细胞)的检测(％)
通过以上3组实验可以发现，本发明的方法冻存的干细胞的细胞活性、粒细胞巨噬细胞集落生成单位CFU-GM和CD34+细胞回收率均略优于传统冻存方法。