一种墨兰组织培养快速繁殖方法与流程

本发明涉及一种繁殖墨兰的方法，特别涉及一种墨兰组织培养快速繁殖方法，属于植物组织培养
技术领域：
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背景技术：
：墨兰作为国兰之一，属于兰属中的地生种，又名报岁兰，因为它的花期正在二十四节气之尾的大寒季节，这时，农历旧的一年将终，新的一年即将开始，墨兰花开，人们愈加喜爱墨兰的不为世俗、寂寞幽香、独守高雅的品格，因有“花中四君子”之一的美称。墨兰叶带形，近薄革质，暗绿色。花葶从假鳞茎基部发出，直立，较粗壮，略长于叶，花的色泽常为暗紫色或紫褐色而具浅色唇瓣，也有黄绿色、桃红色或白色，有较浓的香气。墨兰分布于中国、印度、缅甸、越南、泰国、日本琉球群岛等。墨兰具有极高的观赏价值、药用价值和收藏价值，非常适合装点室内环境和作为礼仪盆花，其根还具有一定的平喘药用功效，其市场需求十分旺盛，野生墨兰遭到过度采挖，野生自然资源急剧减少，是国家重点保护的野生植物之一。为保护墨兰野生资源、满足市场需求，解决墨兰的快速繁殖势在必行。墨兰种子没有胚乳，自然条件下极难萌发。墨兰传统上主要靠分株繁殖，但繁殖周期长而且繁殖率低，不能形成规模种植，繁殖的兰花品质也不高，无法满足当今社会的需求。所以，具有繁殖速度快、周期短、可以规模化生产等优点的植物组织培养技术是墨兰快速繁殖的一条有效且重要的途径。兰科植物组织培养的过程中，由种子诱导出的原球茎进一步生长伸长即成为根状茎，根状茎是国兰快速增殖的良好材料，是快速繁殖提高增殖系数的关键。但墨兰在离体培养特别是批量培养时，根状茎增殖速度慢，分化形成的苗少，且培养过程中容易发生褐化导致一部分外植体死亡。因此探究墨兰根状茎增殖培养基和分化培养基的优化可以极大的促进墨兰繁殖，利于扩大墨兰市场。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种墨兰组织培养快速繁殖方法，以解决现有技术中存在的上述问题，本发明所提供的方法不仅能有效缩短墨兰培养时间，60天后的增殖倍数达10，60天后可长成2cm大小芽，每个根状茎小芽数量平均5个左右；并能有效减少褐化率的培养基，降低生产成本，使墨兰实现规模化生产，满足市场需求。本发明的技术方案如下：一种墨兰根状茎组织培养快速繁殖方法，是以墨兰的根状茎为外植体，包括以下依序进行的步骤：(1)准备无菌根状茎：准备无菌、生长状态良好的有分枝的根状茎，直径约为2mm，切成1cm长度备用；(2)根状茎增殖：将无菌墨兰根状茎均匀接种于增殖培养基表面，25℃，光照2000lx，12小时/天；所述增殖培养基配方：1/2ms+naa5mg/l+精氨基酸0.1-0.3g/l+琼脂7g/l+蔗糖30g/l+活性炭1g/l，ph5.8；(3)根状茎分化：将步骤(2)增殖了60天的1cm长的根状茎转至分化培养基中，25℃，光照2000lx，12小时/天，所述分化培养基配方：1/2ms+naa0.5mg/l+tdz0.5mg/l+柠檬酸钠1.5g/l+山梨酸钾4.0g/l+琼脂7g/l+蔗糖30g/l，ph5.8。优选地，步骤(2)的增殖培养基配方：1/2ms+naa5mg/l+精氨基酸0.2g/l+琼脂7g/l+蔗糖30g/l+活性炭1g/l，ph5.8。本发明方法的优点：1、本发明方法使用的外植体为墨兰根状茎，接种容易且不易污染，增殖分化速度快，增殖率高。2、本发明方法使用的第一种培养基所添加的一定浓度的精氨酸可以促进根状茎细胞的分裂，从而达到快速增殖。3、本发明使用的第二种培养基所添加的tdz、柠檬酸钠和山梨酸钾复合使用能促进根状茎快速分化成芽，并防止根状茎和培养基褐化，不需要频繁的继代接种，就可长成较大的小苗。附图说明图1在(a)-(d)增殖培养基上根状茎的增殖a、无精氨酸培养基(a)上根状茎的增殖；b、在有精氨酸0.1g/l培养基(b)上根状茎的增殖；c、在有精氨酸0.2g/l培养基(c)上根状茎的增殖；d、在有精氨酸0.3g/l培养基(d)上根状茎的增殖；图2在(e)-(g)分化培养基上根状茎的分化a、在无tdz，无柠檬酸钠和山梨酸钾培养基(e)上根状茎的分化；b、在有tdz，无柠檬酸钠和山梨酸钾培养基(f)上根状茎的分化；c、在有tdz，有柠檬酸钠和山梨酸钾培养基(g)上根状茎的分化；图3生长壮大的墨兰试管苗。具体实施方式通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。本发明所用墨兰根状茎来自武汉生物工程学院科研楼细胞工程实验室。所用试剂采购厂家分别为：1/2ms粉末：上海宇涵生物科技有限公司；naa：北京康倍斯科技有限公司；6-ba：北京康倍斯科技有限公司；蔗糖：天津市恒兴化学试剂制造有限公司；琼脂：北京康倍斯科技有限公司；活性炭：北京康倍斯科技有限公司，精氨酸：上海源叶生物科技有限公司。tdz：上海康朗生物科技有限公司。【实施例1】1、准备无菌根状茎：准备无菌，生长状态良好的有分枝的根状茎，直径约为2mm，切成1cm长度备用。2、墨兰根状茎增殖：(1)增殖培养基制备(以一升为例)：如表1所示，(a)培养基：取300ml左右蒸馏水加热，当有小气泡出现时，加入7g琼脂，搅拌均匀，溶解完全后，再加入蔗糖30g和1/2ms2.37g，搅拌至溶解完全，加入植物生长调节剂naa5mg和活性炭1g；(b)培养基：在(a)培养基的基础上，再添加0.1g精氨酸加入上述制备液，(c)培养基：在(a)培养基的基础上，再添加0.2g精氨酸加入上述制备液，(d)培养基：在(a)培养基的基础上，再添加0.3g精氨酸加入上述制备液。所有培养基定容到1l，调节ph为5.8。各自分装到兰花瓶中，装量为100ml/瓶，各为10瓶。(2)根状茎增殖：将1cm长度墨兰根状茎分别转入增殖培养基(a)-(d)，每瓶2g，将根状茎材料用无菌纸巾擦拭掉水和培养基，称量后均匀接种于培养基表面，25℃，光照2000lx，12小时/天。如图1所示，60天之后取出瓶内根状茎擦拭水分和残留培养基后进行称量，记录(a)-(d)培养基上各自根状茎的重量。(b)培养基上根状茎重量比60天前接种时增加6倍，(c)培养基上根状茎重量比60天前接种时增加10倍，(d)培养基上根状茎重量比60天前接种时增加7倍，而(a)培养基上根状茎重量只比60天前接种时增加4倍。表1、增殖培养基配方abcd1/2ms√√√√naa5mg/l5mg/l5mg/l5mg/l精氨基酸0g/l0.1g/l0.2g/l0.3g/l琼脂7g/l7g/l7g/l7g/l蔗糖30g/l30g/l30g/l30g/l活性炭1g/l1g/l1g/l1g/l3、墨兰根状茎分化：(1)分化培养基制备(以一升为例)：如表2所示(e)培养基：取300ml左右蒸馏水加热，当有小气泡出现时，加入7g琼脂，搅拌均匀，溶解完全后，再加入蔗糖30g和1/2ms2.37g，搅拌至溶解完全，加入植物生长调节剂naa0.5mg；(f)培养基：在(e)培养基的基础上，再添加tdz0.5mg；(g)培养基：在(e)培养基的基础上，再添加tdz0.5mg，柠檬酸钠1.5g，山梨酸钾4.0g，定容到1l，调节ph为5.8。各自分装到兰花瓶中，装量为100ml/瓶。(2)根状茎分化：步骤2中的1cm长度墨兰根状茎分别转入分化培养基(e)-(g)，每瓶18个，培养室培养。约15天，根状茎开始分化，约60天，小芽长至2-3cm。记录(e)-(g)培养基上根状茎的数目，如图2所示，(e)培养基上每个根状茎小芽的数目为2，根状茎，培养基出现褐化现象，这时候(f)培养基上根状茎小芽的数目为3-4，根状茎，但培养基褐化，急需继代，让小芽继续生长。而(g)每个根状茎小芽的数目为5个，根状茎还为绿色，培养基为白色，没有出现褐化现象。培养基上根状茎不需继代，小芽还可以继续在原来培养基上生长，大大减少了组织培养继代接种的工作量。小芽在培养基上继续生长60天，可以长成壮大的墨兰试管苗，如图3所示。表2、分化培养基配方当前第1页12