本发明涉及用于离体培养何首乌的培养基组合物及利用其大量生产种苗的方法。
背景技术
何首乌(polygonimultifloriradix)是指属蓼科的植物何首乌的块根。何首乌为多年生草本植物，并且是藤本植物，根为纺锤形或块根，长度为5～15cm，直径为3～12cm。茎为蔓性且有节，茎的下部为木质且中空，叶子交错且为单叶，叶柄长且为卵形或心形。叶子的边缘平整，两面无毛。花是在茎的末端或叶脉上有大圆锥形的花序，10月开绿白色的花，花瓣为5个。
何首乌的切断前的块根长度为6～12cm，直径为3～12cm，外侧呈红褐色至暗褐色，具有凹凸不平且不规则的纵向凹槽，并且有根的痕迹。切断的药材的截面呈浅红褐色或浅黄褐色，几个近似圆形的异型维管束形成云锦状的纹理。这种云锦状的纹理是在干燥前的块茎或干燥后的药材中也会出现的特征之一，其被熟知为可以在形态上区分何首乌的鉴别点。
另一方面，已知何首乌作为药材有助于强化肝功能、预防动脉硬化、改善血液循环障碍、恢复元气，并且曾进行过多项对皮肤有益、健壮骨骼和肌肉、有助于神经衰弱或失眠症等多种药理作用及功效的研究并进行了报道。
如上所述，虽然曾进行过多项关于何首乌的药理作用及功效的研究，但是几乎没有开展关于以营养体为基础生产无病株植物体及生产标准育苗的技术开发。随着传统医学和替代医学受到越来越多的关注，有效地利用多种生物资源正在成为社会性、科技性的重要话题，因此，目前使作为药用的利用度高的何首乌的块根肥大的方法和构建生产标准育苗的体系作为开发系统性的生产技术的一个环节，对在未来确保并优先获得中药资源具有重大意义。
此外，由于如何首乌分为赤何首乌和白何首乌的错误的信息，隔山消[学名为cynanchumwilfordii(maxim.)hemsl.]的块根白首乌(cynanchiwilfordiiradix)被误认为是白何首乌，从而将白首乌认作何首乌而混用及误用，在1990年代中期，块根的生长快于隔山消且起源于中国的植物耳叶牛皮消[中文名为牛皮消，学名为cynanchumauriculatumroyleexwight]的种子进入韩国国内，并代替隔山消进行栽培，因此，目前其不仅作为白首乌而进行流通，而且还作为何首乌而进行流通，由此导致混用及误用的问题。
白首乌的起源植物隔山消与何首乌不同，其是萝藦科的多年生草本植物，根深入且形成纺锤形的粗块根，茎向左缠绕向上且无节，切断时流出白色乳液。何首乌的叶子交错，但隔山消的叶子对生。叶子的特征是形状为三角状的心形，末端尖锐，边缘平整。何首乌的花为圆锥形花序，但隔山消的叶脉上有伞形花序，7～8月开浅黄绿色的花。花的特征是形状为宽披针形，花萼为5个，花冠为5个，裂片向内弯曲。
耳叶牛皮消为与隔山消相同的蓼科植物，其植物的形态与隔山消非常相似，因此难以区分。耳叶牛皮消的茎与隔山消相同，为蔓性，对生，无节，叶柄长。叶子的特征为宽形，两侧为圆形耳朵状，下垂或向内弯曲，末端尖锐，边缘平整。花的特征为叶脉上有聚伞花序，8～10月开黄白色的花，花萼和花瓣为5个，这与隔山消相同，但是花萼向下弯曲。在形态上难以区分的隔山消和耳叶牛皮消的鉴别通常以开花期的花的形状来进行区分。隔山消的花的特征为黄绿色，开花时花萼不会向后弯曲，但是耳叶牛皮消的花为黄白色，开花时花萼向后弯曲。
另外，就与栽培或培养何首乌相关的技术的例子而言，韩国授权专利第1272092号公开了何首乌的栽培方法，韩国林学会刊(j.koreanfor.sor.(2011)vol.100.no.2,pp172～177)中公开了通过培养腋芽的野生白何首乌的离体增殖，韩国公开专利第2010-0114741号公开了何首乌的栽培方法及通过该方法栽培的何首乌，但是没有公开关于本发明的用于离体培养何首乌的培养基组合物及利用其大量生产何首乌的方法的技术。
技术实现要素：
要解决的技术问题
本发明是根据如上所述的要求提出的，本发明涉及用于离体培养何首乌的培养基组合物及利用其大量生产种苗的方法，确认了在本发明的培养基中何首乌的生长率优异，而且在添加激动素和iaa或者激动素和naa作为植物生长调节剂时，块根的分化得到增强，并且还确认了通过增加主要无机盐类的含量，不仅块根能够很好地进行分化，而且能够很好地进行土壤驯化，从而完成了本发明。
技术方案
为了实现上述目的，本发明提供用于离体培养何首乌的培养基组合物，其包含cuso4·5h2o、fenaedta、h3bo3、mnso4·h2o、na2moo4·2h2o、znso4·7h2o、cacl2、ca(no3)2·4h2o、kh2po4、k2so4、mgso4、nh4no3、甘氨酸、肌醇(myo-inositol)、烟酸(nicotinicacid)、盐酸吡哆醇(pyridoxinehcl)及盐酸硫胺(thiaminehcl)作为有效成分。
此外，本发明提供大量生产何首乌的方法，其包括利用所述用于离体培养何首乌的培养基组合物由何首乌的营养体培养组织培养苗的步骤。
此外，本发明提供何首乌的组织培养苗，其通过所述大量生产何首乌的方法进行生产。
发明效果
本发明涉及用于离体培养何首乌的培养基组合物及利用其大量生产种苗的方法，确认了在本发明的培养基中何首乌的生长率优异，而且在添加激动素和iaa或者激动素和naa作为植物生长调节剂时，块根的分化得到增强，并且还确认了通过增加主要无机盐类的含量，不仅块根能够很好地进行分化，而且能够很好地进行土壤驯化。因此，可以有效地使用本发明的用于离体培养何首乌的培养基组合物及利用其的大量生产何首乌的方法。
附图说明
图1为对通过继代培养能够从何首乌的种子诱导何首乌的离体培养体进行确认的图。a为何首乌的种子，b～d为接种(1周)的消毒种子，e为消毒后经过1周的种苗(seedling)，f为第2周的外植体(explant)，g为获得的离体培养体(何首乌)。
图2为对用于何首乌的最佳培养的各培养基(培养基1至培养基10)的生长率进行确认的图。
图3为在何首乌的最佳培养基(培养基7)的条件下对块根分化能力优异的植物生长调节剂进行确认的图。对照区(con.)是没有用植物生长调节剂进行处理的对照区，ga3为用赤霉素a3进行处理的，2ip为用异戊烯腺嘌呤(isopentenyladenine)进行处理的，tdz为用噻苯隆(thidiazuron)进行处理的，激动素(kinetin)为用激动素进行处理的，ba为用苄基腺嘌呤(benzyladenine)进行处理的。各处理是以0.1ppm、0.5ppm、1.0ppm或2.0ppm的浓度进行处理。
图4为对根据植物生长调节剂的种类及浓度的组合的何首乌块根分化效果进行确认的图。
图5为示出通过增加何首乌的最佳培养基中包含的无机盐类的含量来进行培养的效果的图。第1天(day1)为示出在离体培养后驯化第1天的块根的照片，4周(4weeks)为移植到土壤后经过4周的何首乌的照片。条(bar)表示2cm。
图6为对根据在何首乌的最佳离体培养条件下确认的最佳培养基(培养基7)及植物生长调节剂(1.0ppm的激动素及作为植物生长素类激素的1.0ppm的iaa或0.5ppm的naa)的处理的块根肥大效果进行确认的照片。第0天(day0)为离体培养后即刻拍摄的照片，5周(5weeks)为驯化5周后的照片，16周(16weeks)为移植到土壤后经过16周的状态的照片。条(bar)表示2cm。
图7为示出何首乌的最佳培养苗的土壤驯化过程的图。a为何首乌经过组织培养的模样，b为驯化预处理，c为何首乌的组织培养苗(第0天(day0))，d为移植到土壤中的模样，e为在驯化中保持温度和湿度的模样，f为移植到土壤后经过4周的模样，g为经过驯化的健壮苗的整体模样。
图8为示出无病株何首乌培养苗的苗圃定植后到形成块根为止的生长过程的照片。a为覆盖(mulching)的育苗圃的照片，b为无病株何首乌的培养苗，c为进行苗圃定植(第1天(day1))的照片，d为苗圃定植后经过11周的照片，e为苗圃定植后经过16周的照片，f为苗圃定植后经过20周后的块根照片。
图9为示出将实生苗(a)、扦插苗(b)及本发明的组织培养苗(c)进行6个月栽培后生产的何首乌的照片及在何首乌的标准育苗中根发芽的模样(d)的照片。
图10为将实生苗、扦插苗及本发明的组织培养苗进行6个月栽培后生产的何首乌的照片。
图11为将实生苗、扦插苗及本发明的组织培养苗进行6个月栽培后生产的何首乌的根长(a)、表面积(b)及鲜重(c)进行比较的结果。
图12为将实生苗、扦插苗及本发明的组织培养苗进行6个月栽培后生产的何首乌的干燥前后的照片(a)，并对干重(dryweight)(b)及水含量和实际重量的比率(％)(b)进行确认的结果。
具体实施方式
本发明涉及用于离体培养何首乌的培养基组合物，其包含cuso4·5h2o、fenaedta、h3bo3、mnso4·h2o、na2moo4·2h2o、znso4·7h2o、cacl2、ca(no3)2·4h2o、kh2po4、k2so4、mgso4、nh4no3、甘氨酸、肌醇(myo-inositol)、烟酸(nicotinicacid)、盐酸吡哆醇(pyridoxinehcl)及盐酸硫胺(thiaminehcl)作为有效成分。
所述用于离体培养何首乌的培养基组合物优选用于使何首乌离体培养苗的块根肥大，但并不限定于此。所述块根是指用作何首乌的药用部位的部分。
除了所述有效成分以外，所述培养基组合物优选还进一步包含植物生长调节剂，优选的植物生长调节剂的例子有激动素和吲哚-3-乙酸(indole-3-aceticacid，iaa)或者激动素和1-萘乙酸(1-naphthaleneaceticacid，naa)，但并不限定于此，并且植物生长调节剂的含量优选为0.01～5.0ppm的激动素和0.75～5.0ppm的iaa或者0.01～5.0ppm的激动素和0.01～0.8ppm的naa，进一步优选为0.1～2.0ppm的激动素和1.0～2.0ppm的iaa或者0.1～2.0ppm的激动素和0.1～0.5ppm的naa，最优选为1.0ppm的激动素和1.0ppm的iaa或者1.0ppm的激动素和0.5ppm的naa，但并不限定于此。
所述有效成分的含量优选为0.125～0.375mg/l的cuso4·5h2o、18.35～55.05mg/l的fenaedta、3.1～9.3mg/l的h3bo3、11.15～33.45mg/l的mnso4·h2o、0.125～0.375mg/l的na2moo4·2h2o、4.3～12.9mg/l的znso4·7h2o、36.25～326.25mg/l的cacl2、235.63～706.89mg/l的ca(no3)2·4h2o、85～255mg/l的kh2po4、495～4455mg/l的k2so4、90.27～270.81mg/l的mgso4、200～600mg/l的nh4no3、1～3mg/l的甘氨酸、50～150mg/l的肌醇(myo-inositol)、0.25～0.75mg/l的烟酸(nicotinicacid)、0.25～0.75mg/l的盐酸吡哆醇(pyridoxinehcl)及0.5～1.5mg/l的盐酸硫胺(thiaminehcl)，进一步优选地，在所述培养基成分中cacl2的含量为108.75～326.25mg/l，k2so4的含量为495～1485mg/l；或者cacl2的含量为36.25～108.75mg/l，k2so4的含量为1485～4455mg/l，但并不限定于此。
本发明的何首乌(药材名：polygonimultifloriradix，英文药名：polygonummultiflorumroot，韩国药典中称为：polygonummultiflorumroot，日本药典中称为：polygonumroot，台湾卫生署称为：fleeceflowerroot)是指蓼科块根。
此外，本发明涉及大量生产何首乌的方法，其包括利用所述用于离体培养何首乌的培养基组合物由何首乌的营养体培养组织培养苗的步骤。
所述培养的条件优选为20～27℃的温度、3,000～7,000勒克斯(lux)的光度以及16/8小时的明/暗周期的条件，但并不限定于此。在培养所述组织培养苗的步骤之后，进一步包括在土壤中驯化的步骤，但并不限定于此。
此外，本发明涉及何首乌的组织培养苗，其通过所述大量生产何首乌的方法进行生产。所述何首乌的组织培养苗是指包含何首乌的离体植物体。
下面，通过实施例对本发明进行更加详细的说明。这些实施例仅仅是用于更加具体地说明本发明，本发明的范围并不受限于这些实施例，这对于本技术领域中具有通常知识的技术人员而言是显而易见的。
实施例1.何首乌离体无菌植物体的诱导
为了诱导何首乌离体无菌植物体，在去除种子的外皮后，在70％(v/v)的乙醇中浸渍30秒，之后用灭菌水进行洗涤，并在3％(v/v)的naocl(次氯酸钠，sodiumhypochlorite)溶液中进行2次表面杀菌，每次5分钟，共进行10分钟。将用灭菌水充分洗涤5次以上后在滤纸(filterpaper)上进行干燥的种子接种于20ml的ms(murashige&skoog)固体培养基。基础培养基使用添加有3％(w/v)的蔗糖(sucrose)和0.45％(w/v)的植物琼脂(phytoagar)(mbcell公司，美国)的ms培养基，将ph调整为5.6～5.8后在121℃下进行15分钟的高压灭菌并进行使用。培养是在内部温度为25±1℃、光度为5,000勒克斯(lux)的16/8小时(明/暗)条件的培养器中进行，将从种子发芽的植物体在与所述培养基相同条件的新培养基中进行继代培养而使其增殖，从而诱导何首乌离体培养体。
如图1所示，将何首乌的种子接种于灭菌培养基，并通过发芽及增殖生产离体培养体。
实施例2.根据培养基的组成的何首乌离体培养体的生产
为了获知用于生产何首乌离体培养体的合适的培养基组成，在多种培养基条件下进行何首乌的离体培养。本发明中使用的培养基全部购自duchefa公司，并且添加3％(w/v)的蔗糖(sucrose)和0.45％(w/v)的植物琼脂(phytoagar)进行使用。
本实施例2中，为了离体培养何首乌，利用10种培养基(培养基1～10)进行培养。本发明中使用的培养基全部购自duchefa公司，并且添加3％(w/v)的蔗糖(sucrose)和0.45％(w/v)的植物琼脂(phytoagar)进行使用。
本实施例2中使用的培养基1是由1650mg/l的nh4no3、1900mg/l的kno3、440mg/l的cacl2·2h2o、370mg/l的mgso4·7h2o、170mg/l的kh2po4、0.83mg/l的ki、6.2mg/l的h3bo3、22.3mg/l的mnso4·4h2o、8.6mg/l的znso4·7h2o、0.25mg/l的na2moo4·2h2o、0.02mg/l的cuso4·5h2o、0.025mg/l的cocl2·6h2o、43mg/l的乙二胺四乙酸铁(ferric-edta)、3％的蔗糖(sucrose)且ph为5.7、100mg/l的肌醇(inositol)、0.5mg/l的烟酸(nicotinicacid)、0.5mg/l的盐酸吡哆醇(pyridoxine·hcl)、0.4mg/l的盐酸硫胺(thiamine·hcl)、1～30mg/l的吲哚乙酸(indoleaceticacid，iaa)及0.04～10mg/l的激动素(kinetin)组成的培养基。
培养基2是由2500mg/l的kno3、150mg/l的cacl2·2h2o、250mg/l的mgso4·7h2o、134mg/l的(nh4)2so4、150mg/l的nah2po4·h2o、0.75mg/l的ki、3.0mg/l的h3bo3、10mg/l的mnso4·h2o、2.0mg/l的znso4·7h2o、0.25mg/l的na2moo4·2h2o、0.025mg/l的cuso4·5h2o、0.025mg/l的cocl2·6h2o、43mg/l的乙二胺四乙酸铁(ferric-edta)、2％的蔗糖(sucrose)且ph为5.5、100mg/l的肌醇(inositol)、1.0mg/l的烟酸(nicotinicacid)、1.0mg/l的盐酸吡哆醇(pyridoxine·hcl)、10mg/l的盐酸硫胺(thiamine·hcl)、0.1mg/l的激动素(kinetin)、0.1～1.0mg/l的2,4-d组成的培养基。
培养基3是由2830mg/l的kno3、463mg/l的硫酸铵(ammoniumsulphate)、166.02mg/l的cacl2·2h2o、90.37mg/l的mgso4、400mg/l的kh2po4、3.33mg/l的mnso4·h2o、1.60mg/l的硼酸(boricacid)、0.80mg/l的ki、1.5mg/l的znso4·7h2o、37.26mg/l的硫酸亚铁·7h2o(ferroussulphate·7h2o)、1.0mg/l的edta二钠盐·2h2o(edtadisodiumsalt·2h2o)、0.5mg/l的盐酸吡哆醇(pyridoxinehydrochloride)、0.5mg/l的烟酸(nicotinicacid)、2.0mg/l的甘氨酸(glycine)组成的培养基。
培养基4是由0.025mg/l的cocl2·6h2o、0.025mg/l的cuso4·5h2o、36.7mg/l的fenaedta、6.2mg/l的h3bo3、0.83mg/l的ki、16.90mg/l的mnso4·h2o、0.25mg/l的na2moo4·2h2o、8.6mg/l的znso4·7h2o、270.00mg/l的kh2po4、1800mg/l的kno3、175.79mg/l的mgso4、166mg/l的cacl2、400mg/l的nh4no3、100mg/l的肌醇(myo-inositol)、0.4mg/l的盐酸硫胺(thiaminehcl)组成的培养基。
培养基5是由0.001mg/l的cuso4·5h2o、3.47mg/l的feso4·7h2o、1.5mg/l的h3bo3、0.75mg/l的ki、5.31mg/l的mnso4·h2o、0.0001mg/l的moo3、200mg/l的na2so4、2.67mg/l的znso4·7h2o、208.47mg/l的无水ca(no3)2(ca(no3)2·anhydrous)、65mg/l的kcl、80mg/l的kno3、351.6mg/l的mgso4、16.8mg/l的nah2po4组成的培养基。
培养基6是由0.0025mg/l的cocl2·6h2o、0.0025mg/l的cuso4·5h2o、36.7mg/l的fenaedta、10.62mg/l的h3bo3、1.58mg/l的ki、1.68mg/l的mnso4·h2o、0.0025mg/l的na2moo4·2h2o、1.06mg/l的znso4·7h2o、226.50mg/l的cacl2、600mg/l的kcl、2000mg/l的kno3、244.33mg/l的mgso4、250mg/l的nah2po4、400mg/l的(nh4)2so4、100mg/l的肌醇(myo-inositol)、1.0mg/l的烟酸(nicotinicacid)、1.0mg/l的盐酸吡哆醇(pyridoxinehcl)及10.0mg/l的盐酸硫胺(thiaminehcl)组成的培养基。
培养基7是由0.25mg/l的cuso4·5h2o、36.7mg/l的fenaedta、6.2mg/l的h3bo3、22.3mgl的mnso4·h2o、0.25mg/l的na2moo4·2h2o、8.6mg/l的znso4·7h2o、72.50mg/l的cacl2、471.26mg/l的ca(no3)2·4h2o、170mg/l的kh2po4、990mg/l的k2so4、180.54mg/l的mgso4、400mg/l的nh4no3、2.00mg/l的甘氨酸、100mg/l的肌醇(myo-inositol)、0.5mg/l的烟酸(nicotinicacid)、0.5mg/l的盐酸吡哆醇(pyridoxinehcl)及1.0mg/l的盐酸硫胺(thiaminehcl)组成的培养基。
培养基8是由0.03mg/l的cuso4·5h2o、36.70mg/l的fenaedta、10mg/l的h3bo3、18.94mg/l的mnso4·h2o、0.25mg/l的na2moo4·2h2o、10mg/l的znso4·7h2o、166mg/l的cacl2、68mg/l的kh2po4、950mg/l的kno3、90.27mg/l的mgso4、720mg/l的nh4no3、0.03mg/l的生物素(biotin)、0.5mg/l的叶酸(folicacid)、2.0mg/l的甘氨酸(glycine)、100mg/l的肌醇(myo-inositol)、5.0mg/l的烟酸(nicotinicacid)、0.5mg/l的盐酸吡哆醇(pyridoxinehcl)及0.5mg/l的盐酸硫胺(thiaminehcl)组成的培养基。
培养基9是由0.025mgl的cocl2·6h2o、0.025mg/l的cuso4·5h2o、36.7mg/l的fenaedta、6.2mg/l的h3bo3、0.08mg/l的ki、0.76mg/l的mnso4·h2o、0.25mg/l的na2moo4·2h2o、8.6mg/l的znso4·7h2o、578.92mg/l的无水ca(no3)2(ca(no3)2·anhydrous)、270.00mg/l的kh2po4、1800mg/l的kno3、175.79mg/l的mgso4、400mg/l的nh4no3、100mg/l的肌醇(myo-inositol)、0.4mg/l的盐酸硫胺(thiaminehcl)组成的培养基。
培养基10是由0.025mg/l的cocl2·6h2o、0.025mg/l的cuso4·5h2o、73.4mg/l的fenaedta、6.2mg/l的h3bo3、0.3mg/l的ki、16.90mg/l的mnso4·h2o、0.25mg/l的na2moo4·2h2o、8.6mg/l的znso4·7h2o、332.02mg/l的cacl2、480mg/l的kno3、180.54mg/l的mgso4、330.60mg/l的nah2po4、400mg/l的nh4no3组成的培养基。
本实施例2的结果为以根据下述的式(1)的生长率为基准筛选出最佳培养基，并且在下面的实施例中利用本发明的用于培养何首乌的培养基。
式(1)
生长率(growthindex，％)＝[(最终生长-最初生长)/最初生长]×100
结果如图2所示，在10种培养基中培养基7显示出最优异的生长率。因此选定培养基7为最佳培养基。
实施例3.根据植物生长调节剂的种类及浓度的何首乌分化能力的确认
除了用于最佳培养的生长率之外，对用于块根分化的植物生长调节剂的种类及浓度进行优化。
植物生长调节剂中的作为有效地增强何首乌的分化能力的细胞分裂素(cytokinin)类植物激素，确认了1.0ppm的激动素(kinetine)对根分化(rooting)有效(图3)。所述细胞分裂素在根的末端生物合成，并且促进植物分生组织的细胞分裂，因此与植物生长素一同利用于组织培养。所述细胞分裂素起到打破休眠的作用，并抑制植物组织的老化。此外，促进叶子和侧芽的生长，并防止叶子和果实的老化。
此外，何首乌的块根用作药材，因此进一步添加植物生长素(auxin)类植物激素，并对块根的生长发育进行测量。
具体而言，将在培养何首乌的最佳培养基(培养基7)、各细胞分裂素类植物激素处理区中有效果的处理区a组(培养基7+1.0ppm的激动素(kinetin))、b组(培养基7+1.0ppm的激动素(kinetin)+1.0ppm的tdz+0.1ppm的2ip)进行固定，并以不同浓度的植物生长素类(iba：吲哚-3-丁酸(indole-3-butyricacid)、iaa：吲哚-3-乙酸(indole-3-aceticacid)、naa：1-萘乙酸(1-naphthaleneaceticacid)、ipa：吲哚-3-丙酸(indole-3-propionicacid))植物激素进行处理，并测量块根的分化。
对于利用植物生长调节剂的何首乌的块根分化能力(根的生长及数量)，确认了在本发明的培养基7中添加1.0ppm的激动素(kinetin)及1.0ppm的iaa的处理区和在本发明的培养基7中添加1.0ppm的激动素(kinetin)及0.5ppm的naa的处理区中的效果优异(图4)。
实施例4.药用部位肥大条件的确立
1)无机盐的效果
何首乌的药用部位为块根，因此使块根肥大的条件很重要。因此，欲将在各最佳培养基的效果中确认的生长最小的培养基即培养基9和生长最大的培养基即培养基7的无机盐的组成进行比较，通过各无机盐产生的影响来促进块根的肥大。对以下三种情况下的块根肥大效果进行比较，即，添加217.5mg/l的本发明的培养基即培养基7中的主要无机盐cacl2(培养基1中包含的cacl2的3倍)的情况，添加2,970mg/l的k2so4(培养基7中包含的k2so4的3倍)的情况，添加5,400mg/l的培养基9中的主要无机盐kno3(培养基9中包含的kno3的3倍)的情况。
比较结果，如图5所示，确认了在本发明的培养基中添加217.5mg/l的cacl2(培养基7中包含的cacl2的3倍)的情况和添加2,970mg/l的k2so4(培养基7中包含的k2so4的3倍)的情况下，块根的肥大得到增强，但在添加5,400mg/l的培养基9中的主要无机盐kno3(培养基9中包含的kno3的3倍)的情况下，几乎没有生成根。由此判断kno3对根的分化产生负面影响。
2)激素的效果
以在何首乌的最佳离体培养条件下确认的培养基和植物生长调节剂的处理区为基础，将块根的肥大效果实质性地应用于土壤来进行确认。
将培养基7及处理区1(培养基7+1.0ppm的激动素(kinetin)+1.0ppm的iaa)、处理区2(培养基7+1.0ppm的激动素(kinetin)+0.5ppm的naa)适应环境后，移植到园艺床土，并进行4个月的监测的结果，可以确认与形成块根且没有用激素进行处理的对照区相比，块根变得肥大(图6)。
实施例5.基外环境适应及土壤适应
通过所获得的大量有机体的营养体繁殖是以下述的方法经过驯化预处理过程后诱导环境适应及土壤适应。用塑料袋覆盖并保持90％的湿度进行驯化7天，逐渐取下覆盖物后在22℃的生长箱中培育的结果，4周的环境适应后显示出95％的生存率，经过驯化的植物体显示出块根的肥大及增殖和高土壤适应性。为了适应土壤环境，移植到以1:1的比例混合珍珠岩和园艺床土的土壤中适应环境，然后大量生产何首乌的培养苗(图7)。
实施例6.移植及定植(苗圃)
何首乌的培养苗在土壤中生根后，可以在苗圃中进行定植，虽然可以在韩国的所有地区进行定植，但是为了过冬，重要的是需要在10月末(霜降之前需要剪掉地上部)进行剪枝，由此可以在冬季期间维持块根，防止冻灾损失。合适的壤土为有机物的含量多且排水顺畅的壤土、砂质壤土，如果排水不顺畅，则块根容易腐烂，因此需要注意(图8)。
在本实施例6中，对定植后栽培6个月的何首乌的根进行观察的结果，如图9至图10所示，确认了与由实生苗或扦插苗生产的何首乌相比，由本发明的组织培养苗生产的何首乌更加肥大。此外，确认了与由实生苗或扦插苗生产的何首乌相比，由本发明的组织培养苗生产的何首乌的去除何首乌残根前后的何首乌的根长、根的表面积及鲜重(freshweight)更加优异(图11)，并且确认了与扦插苗或实生苗相比，所生产的何首乌的干重也更重且水的含量更少，由此确认了利用本发明的组织培养苗时，能够大量生产肥大的何首乌(图12)。