本发明涉及化合物在植物病害防治中的应用领域，尤其涉及3,3-二甲基辛烷在防治植物根结线虫的应用及其使用方法。
背景技术：
植物根结线虫病是一种在世界范围内广泛发生的土传病害，寄主范围超过 3000种，尤以茄科、葫芦科、十字花科等植物受害严重，每年世界农业生产因各类灾害的损失中，根结线虫引起的损失超过1570亿美元(Abad et al.,2008)。如今，化学防治因其操作简便、见效快而受到广泛的使用，如甲基溴，1,3-二氯丙烯等 (Schneider et al.,2003,Xiong et al.,2015)。但是，这些化学杀线剂存在毒性、残留和抗性的问题，随着对环境和公共卫生安全问题的日益关注，在一些发达国家，许多具有高毒性的化学杀线虫剂已撤销或被限制使用(Schneider et al.,2003)。因此，在植物寄生线虫控制方面，迫切需要一些对环境友好的线虫抑制剂来替代。
目前已公开的植物和微生物代谢物的组成成分中有杀线虫作用的化学物质有：从万寿菊属植物中分离得到的多联噻吩类化合物(Uhlenbroeket al.,1958)；从菊科植物中分离得到的多炔类化合物(Commerset al.,1973)；从芸苔属植物中分离异硫氰酸盐与芥子油苷类化合物(Ellenbyet al.,1951)；生氰糖苷与生物碱类化合物(Chandravadanaet al.,1994)；萜、倍半萜及二萜类化合物(Raoet al.,1996)；酚类化合物(Mcheret al.,1988)；2,4-二叔丁基苯酚(专利CN103621501A)。但尚未有3,3-二甲基辛烷用于防治根结线虫的公开文件。
技术实现要素：
发明目的：本发明提供了一种化合物3,3-二甲基辛烷在防治植物根结线虫中的应用及其防治方法，解决了现有的化学杀线剂存在毒性、残留和抗性的问题，同时解决了对环境和公共卫生安全有危害的问题。
技术方案：本发明的化合物3,3-二甲基辛烷在防治植物根结线虫的应用，具有防治根结线虫效果好、且绿色环保的优势。
其中，所述3,3-二甲基辛烷为植物内生细菌蜡状芽孢杆菌BCM2(Bacillus cereus BCM2)菌株诱导植物根系分泌物的组成成分之一。
内生细菌是能够定殖在植物组织内又不引起植物病害的微生物。植物内生菌是植物病害防治重要的菌种资源，可以在促进植物组织健康生长的同时控制植物病害的发展。目前，已经有许多促生长的内生细菌被公开报道能够降低植物病原的危害，越来越多的研究人员致力于内生细菌防治根结线虫的研究，表明内生细菌在生防线虫方面有较强的潜力。
基于上述应用的一种防治根结线虫的方法，包括使植物体内含有3,3-二甲基辛烷的步骤。
根际土壤环境和生物因素对根系分泌物有很大影响，通常根结线虫需要寄主植物产生促进其孵化以及发育的因子，内生细菌在根部的大量繁殖改变了根系分泌物的组成，从而影响根结线虫的发育和对寄主的识别。植物根系分泌物在植物-线虫相互作用中起着重要的作用，植物化学物质被认为是很好的生物农药候选物，或者可以开发化学合成的具有强的杀线虫活性的衍生物的模式化合物作为一种对环境友好的杀线虫制剂。
所述使植物体内含有3,3-二甲基辛烷的步骤采用将能够诱导植物分泌3,3-二甲基辛烷的内生细菌植入植物体内或在植物体外施加3,3-二甲基辛烷的方式，这两种方式可在植物的根系部分实施。
所述植入和体外施加的方式分别包括将内生细菌悬液接种至植物体内(将植物根系部分接入内生细菌悬液)和将植物根系部分的土壤或营养液中施入3,3- 二甲基辛烷溶液的步骤。
其中，所述内生细菌为蜡状芽孢杆菌BCM2菌株及具有相同功能的菌株。
所述内生细菌悬液中内生细菌的菌体密度为1×107-1×109cfu/mL，优选菌体密度为1×109cfu/mL。
所述3,3-二甲基辛烷溶液中3,3-二甲基辛烷的浓度为3-5mmol/L，优选4 mmol/L。
上述的植物为番茄、黄瓜、辣椒、芹菜、生姜等能感染根结线虫的农作物和经济类植物。
基于上述应用及防治方法的一种防治根结线虫的药物，所述药物为3,3-二甲基辛烷或含有3,3-二甲基辛烷的制剂。
所述制剂为液体剂型或固体剂型，且所述含有3,3-二甲基辛烷制剂中3,3-二甲基辛烷的浓度是3-5mmol/L。
有益效果：1、本发明的化合物3,3-二甲基辛烷在防治植物根结线虫作为药物应用及其使用方法，解决了化学杀线剂存在毒性、残留和危害环境的问题；
2、解决了对环境和公共卫生安全有危害的问题，且绿色环保；3、防治方式多样，体内、体外均可接种和使用；4、防治根结线虫效果好，体外条件下，趋避率可达56.05％，体内条件下，趋避率可达66.25％。
具体实施方式
实施例1
1、双盆系统下蜡状芽孢杆菌BCM2菌株对南方根结线虫的趋避作用
将培养2周的番茄苗栽种到装满营养土(河沙：田土＝1：1)的7×7×8cm的双盆中(双盆中间有一直径2cm，长4cm的塑料管连通)，缓苗后，在其中一侧伤根接种10mL OD600＝0.480(菌体密度为2.25×108cfu/mL)的BCM2菌悬液，另一侧伤根接入10mL无菌水；3d后于连接管中间加入1000条二龄幼虫。每个处理重复10次，接种后30d调查线虫侵染情况。计数根结数、根中线虫数和每100g根际土壤中线虫数，测量番茄株高、鲜重、干重和根重。
实验结果如下表1，结果显示，南方根结线虫对接种BCM2菌株的番茄的侵染显著减少，相比对照组，接种BCM2一侧的每100g土壤中的线虫数减少了 62.33％，表明南方根结线虫更多的移动到未接种BCM2一侧。接种BCM2一侧的番茄根部每g根的根结数、根中的虫数分别减少了44.99％、58.65％。本实验的结果证明内生细菌BCM2存在番茄体内，促使了番茄根系趋避了线虫的侵入。
表1：BCM2接种番茄对南方根结线虫的趋避作用
注：“*”表明与对照组有显著差异(P＜0.05，n＝10)
2、番茄根系分泌物的收集与浓缩
将培养2周的番茄苗栽种到装满营养土(河沙：田土＝1：1)的直径15cm，高14cm的花盆中，缓苗后，在其中接种10mL OD 600＝0.5(菌体密度为1×109 cfu/mL)的BCM2菌悬液，在接种BCM2 15天后，将番茄苗从花盆中取出，尽量避免伤根，根部洗净后放入灭菌的塑料杯中，每个塑料杯5株苗，加入100mL 灭菌双蒸水，没过根系，每天28℃/20℃：14h/10h；光照/黑暗：14h/10h；相对湿度75％放置48h。每个处理重复6次。将未加BCM2菌悬液的番茄苗做同样地处理作为对照组。将收集到的根系分泌物抽滤，分别过0.45um和0.22um的滤膜以除去土壤以及细菌等杂质，收集滤液50mL，加等体积环己烷萃取24h。萃取完毕后，将水相和有机相分开挥发。
3、体外条件下番茄根系分泌物的粗分物对南方根结线虫的趋避作用
平皿中倒入含0.5％琼脂的水琼脂培养基，1cm2滤纸片均匀放在水琼脂平皿上，2个滤纸片间隔1cm。挥干后的根系分泌物加200μL无菌水和200μL DMSO (助溶)，实验组和对照组分别取20μL滴加于两边的滤纸片，中间滴加20μL J2 悬液(约100条)，每个处理重复10次。48h后观察J2运动情况。
将滤纸片转移到2mL离心管中，加入1mL无菌水，1500rpm震荡10min，自然沉降10min，弃滤纸，12000rpm离心1min，光学显微镜镜检J2的数量；使用倒置显微镜镜检平皿上滤纸所在位置的J2数量，二者的总数即为该滤纸片上根系分泌物所吸引的J2总数。
实验结果如表2所示，与对照组相比，接种BCM2后，番茄根系分泌物中萃取的有机相部分趋避J2效果显著，线虫减少比率是67.14％；萃取的无机相的物质对南方根结线虫则无趋避作用。表明番茄根系分泌物中萃取的有机相部分存在趋避南方根结线虫的物质。
表2：环己烷萃取的根系分泌物对南方根结线虫的趋避作用
注：“*”表明与对照组有显著差异(P＜0.05，n＝10)
4、接种BCM2和不接种BCM2的番茄根系分泌物差异活性成分检测
采用气相色谱仪Agilent 7890A对环己烷萃取后的番茄根系分泌物进行检测。柱型号：HP-5毛细管色谱柱，30m x 0.32mm x 0.25um。柱温240℃，升温程序：从60℃以10℃/min的速度升至140℃，保持2min；以15℃/min的速度升至220℃，保持2min；以20℃/min的速度升至240℃，保持10min。进样口温度 220℃。载气：氦气；载气流速：1ml/min。分流比：无分流。进样量：1ul。根据峰面积大小，比较未接种BCM2和接种BCM2的番茄根系分泌物的物质种类变化及含量变化。
实验结果：接种BCM2后，番茄根系分泌物的组成成分及含量均发生不同程度变化，一些物质分泌含量增多。表3为含量显著增高的6种物质，其中含量提高百分比最多的物质是物质6，其后依次为物质1＞4＞5＞2＞3。
表3：BCM2接种番茄根系分泌物中高分泌的物质组分
5、番茄根系分泌物差异活性成分鉴定
采用气相色谱-质谱仪Agilent 6890/5975对有差异的活性成分进行气相色谱- 质谱(GC-MS)鉴定。柱型号：DB-5毛细管色谱柱，30m x 0.25mm x 0.25um。气化温度：280℃；柱温：60℃，以15℃/min升至300℃。载气：氦气；载气流速：1ml/min。分流比：无分流。吹扫时间：0.8min。进样量：2ul。质谱条件：电离方式EI，电离能量70eV，扫描范围20-650amu，离子源温230℃。采用谱库NIST确定物质名称。
实验结果：通过GC-MS，在谱库NIST查询到1号物质为3,3-二甲基辛烷。
6、3,3-二甲基辛烷标准物品气相色谱标定
在物质成分未知的情况下，利用谱库是必需的，但是不能完全定性。为确定通过谱库NIST鉴定的物质是否正确，本研究在Dr.Ehrenstorfer GmbH公司购买相同的化合物，溶于环己烷后通过实施例5的方法进行气相色谱检测，观测其保留时间是否一致。若一致，则为同一种物质；若不一致，则表明物质不同。
实验结果：Dr.Ehrenstorfer GmbH公司购买得到的标准物品的气相色谱结果显示，3.3-二甲基辛烷标准品的保留时间与物质1一致，确定根系分泌物中1号物质为3,3-二甲基辛烷。
7、3,3-二甲基辛烷对南方根结线虫的化感验证
将3,3-二甲基辛烷配制成0.25、1.0和4.0mmol/L三个不同浓度。配制时先用无水乙醇将药剂溶解，再缓慢加入蒸馏水至所需浓度，乙醇最终浓度1.0％，以1.0％乙醇为对照(CK)。
按照实施例3的方法，将3,3-二甲基辛烷的三个浓度在水琼脂平皿上进行对南方根结线虫的趋避作用验证。
进一步采用实施例1的双盆法验证：培养双盆的番茄苗，一边分别施加 4mmol/L的3,3-二甲基辛烷10mL，另一边施入10mL 1.0％乙醇(CK)；每3d 处理一次，连续处理3次，第一次施药完毕后于中间加入1000条J2。30d后调查线虫侵染情况。每个处理重复3次。
实验结果如表4：体外条件下，3,3-二甲基辛烷在4mmol/L的浓度下对线虫有显著的趋避作用，随浓度降低，其趋避作用减弱。
表4：3,3-二甲基辛烷对南方根结线虫的趋避作用
注：“*”表明与对照组有显著差异(P＜0.05，n＝3)
双盆系统中施加4mmol/L的3,3-二甲基辛烷后，结果如表5所示，根结、根中虫数以及土壤中线虫数分别减少了47.45％、37.18％以及66.25％。该结果显示 4mmol/L的3,3-二甲基辛烷对南方根结线虫有显著的趋避作用。
表5：双盆系统中番茄根部根结数/g根、根中虫数/g根以及100g土壤中线虫数
注：“*”表明与对照组有显著差异(P＜0.05，n＝3)。