本发明涉及作物病害防治技术领域，尤其涉及采用含有一株解淀粉芽孢杆菌的生物育苗基质培育烟苗，对烟草黑胫病起到防治作用。
技术背景
烟草黑胫病是制约烟草产业发展的重要病害。烟草黑胫病是由寄生疫霉烟草致病变种(phytophthoraparasiticavar.nicotianae)引起的烟草真菌性土传病害之一。该病常与烟草青枯病混合发生，导致烟草矮化、萎蔫、叶片发黄、根和茎基部坏死，发病率3％～12％，重者损失达50％。目前，除东北烟区零星发生外，我国其他烟草主栽区均普遍发生。
烟草漂浮育苗是20世纪80年代在美国、日本、加拿大等国家首先出现，20世纪90年代开始推广的育苗技术。该技术首先于1994～1997年在湖北试验成功，随后在云南等主产区迅速推广。根据中国烟叶公司的统计，2006年约占全国育苗总面积的70％，2010年约占78.9％，2012年约占84.3％。烟草漂浮育苗基质是烟草育苗的基础,是决定烟苗根系生长环境的重要因素,它除了支持和固定植株外,更重要地是充当中转站的作用,使来自营养液的养分和水分得以中转。漂浮育苗基质为幼苗的生长提供稳定协调的水、肥、气的生长介质。普遍认为,基质必须具备四方面的功能:(1)供给水分；(2)供给养分；(3)保证根际的气体交换；(4)为烟苗提供支撑。本发明方法采用的防治烟草黑胫病的生物育苗基质不仅具备上述功能，同时还具有防治烟草黑胫病的功效。
技术实现要素：
本发明目的是提供一种生产成本低、无毒、无污染、无残留、对人畜安全、通过漂浮育苗培培育出具有防治烟草黑胫病的的烟草种苗。本发明的技术方案如下：
1.一种防治烟草黑胫病的方法，其特征在于：用防治烟草黑胫病的生物育苗基质对烟草种子进行漂浮育苗，所述防治烟草黑胫病的生物育苗基质由解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)yn2010-kccgmccno.5722的发酵液，草炭、珍珠岩和蛭石组成，且草炭:珍珠岩:蛭石的体积比为3:1:1，解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)yn2010-kccgmccno.5722的最终有效活菌数达到1×107cfu/cm3以上。
2.根据技术方案1所述的一种防治烟草黑胫病的方法，其特征在于：所述防治烟草黑胫病的生物育苗基质按如下方法制备得到：将草炭、珍珠岩和蛭石按草炭:珍珠岩:蛭石的体积比3:1:1混合后，加入解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)yn2010-kccgmccno.5722的发酵液搅拌均匀，且加入的解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)yn2010-kccgmccno.5722发酵液使所述防治烟草黑胫病的生物育苗基质中解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)yn2010-kccgmccno.5722的最终有效活菌数达到1×107cfu/cm3以上。
3.根据技术方案1或2所述的一种防治烟草黑胫病的方法，其特征在于：所述解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)yn2010-kccgmccno.5722的发酵液通过下述方法制备得到：
(1)将所述的解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)yn2010-kccgmccno.5722活化后，按5～10％接种量，将活化的解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)yn2010-kccgmccno.5722接种到种子培养基，在培养温度36℃、转速160rpm条件下，摇床培养12h，得到一级种子液，所述种子培养基为液体lb培养基，ph7.0～8.0；
(2)按5～10％接种量，将一级种子液转接到种子罐内的二级种子培养基，在35～38℃，转速100rpm，通气量为1500l/h，罐压保持在0.04～0.06mpa条件下培养12h，得到二级种子液；所述二级种子培养基由以质量分数计的以下成分组成：玉米粉2～4％，蔗糖1～3％，黄豆粉1～2％，鱼粉1～3％，硫酸镁0.04～0.06％，碳酸钙5～7％，磷酸氢二钾0.02～0.04％，硫酸锰0.01～0.03％，余量为水，ph7.0～8.0；
(3)按5～10％接种量，将二级种子液接种到发酵罐内的发酵培养基，在35～38℃，转速100rpm，通气量为1500l/h、罐压保持在0.04～0.06mpa条件下培养46～48h，培养后的发酵液中解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)yn2010-kccgmccno.5722的有效活菌数≧1×1010cfu/ml时，该发酵液即为所述解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)yn2010-kccgmccno.5722的发酵液，所述发酵培养基与步骤(2)中所述的二级种子培养基相同。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明方法不需要增加烟草漂浮育苗的工序，即可培育出具有防治烟草黑胫病的种苗，从而减少了烟草种苗在移栽后对烟草黑胫病的防治成本。
本发明方法通过烟草漂浮育苗，将具有防治烟草黑胫病的生物育苗基质中的一种微生物在烟草漂浮育苗期间定殖在烟草种苗内，使培育出的烟草种苗移栽于土壤后，具有预防烟草黑胫病的功能，其对烟草黑胫病的平均防效达69％以上，防治效果显著。同时本发明方法培育的烟草种苗生长快、健壮。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明，各实施例无特殊说明为常规方法。
实施例1解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)yn2010-kc的获得、鉴定和保藏
1、本发明解淀粉芽孢杆菌yn2010-kc的获得
1.1材料
采自健康烟草的茎和叶。
1.2培养基制备
将lb固体培养基和燕麦培养基融化，分别倒入灭菌培养皿，冷却，制成平板。lb培养基用于分离和保存内生细菌，燕麦培养基用于培养烟草黑胫病菌和对峙培养。
1.3分离培养
健康烟草茎、叶经酒精消毒后，用灭菌水冲洗3次，于灭菌的研钵中研磨，将研磨汁液涂布于lb平板上。随机挑取形态不同的菌落进行纯化培养并保存，将所得的其中一株菌命名为yn2010-kc。
1.4拮抗内生细菌筛选
以烟草黑胫病病原菌为指示菌，采用燕麦平板对峙培养法，观察其对烟草黑胫病菌的抑菌作用，并测定其抑菌带宽度。
2、解淀粉芽孢杆菌yn2010-kc的鉴定
2.1形态学鉴定
取菌株yn2010-kc在lb培养基上培养，37℃培养36小时，进行形态观察鉴定，菌体为杆状、端圆，周生鞭毛、具运动性，产生椭圆形芽孢；在lb和psa平板上菌落圆形、淡黄色、菌落中央呈火山口状隆起、表面干燥有褶皱。与《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等编著，科学出版社，2001年)中描述的芽孢杆菌属形态特征基本一致，初步判断菌株yn2010-kc属于芽孢杆菌(bacillusspp.)。
2.1、生理生化鉴定
菌株革兰氏染色、芽孢染色、淀粉水解、葡萄糖利用、柠檬酸盐利用、v-p反应、硝酸盐还原、明胶液化等均呈阳性。
2.2、分子鉴定结果
对提取的细菌基因组dna进行pcr扩增，得到了约为1500bp的明亮条带。yn2010-kc菌株的16srdna序列经与ncbi数据库blast比对，与其同源性较高的菌株均属于芽孢杆菌属，其中菌株yn2010-kc与bacillusamyloliquefacienscc178(cp006845.1)、b.amyloliquefacienssubsp.plantarumstr.fzb42(cp00560.1)、b.amyloliquefacienssubsp.plantarumas43.3相似度均达99％，结合菌株的形态特征，生理生化特性及16srdna序列，将yn2010-kc鉴定为解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)。
3、解淀粉芽孢杆菌yn2010-kc的保藏
所述的解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)yn2010-kc于2012年1月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称：cgmcc)，保藏号为cgmccno.5722，并于2012年1月12日检测为存活。该普通微生物中心地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编:100101。因此，上述解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)yn2010-kc表述为解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)yn2010-kccgmccno.5722。
实施例2防治烟草黑胫病的生物育苗基质的制备，包括以下步骤：
(1)将-80℃保存的解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)yn2010-kccgmccno.5722接种在液体lb培养基上，36℃培养24h，得活化的解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)yn2010-kccgmccno.5722，按1％接种量，将活化的所述解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)yn2010-kccgmccno.5722接种到种子培养基，在培养温度36℃、转速160rpm条件下，摇床培养12h，得到一级种子液，所述种子培养基为液体lb培养基，ph7.0～8.0；
(2)按1％接种量，将一级种子液转接到种子罐内的二级种子培养基，在35～38℃，转速100rpm，通气量为1500l/h，罐压保持在0.04～0.06mpa条件下培养12h，得到二级种子液；所述二级种子培养基由以质量分数计的以下成分组成：玉米粉2～4％，蔗糖1～3％，黄豆粉1～2％，鱼粉1～3％，硫酸镁0.04～0.06％，碳酸钙5～7％，磷酸氢二钾0.02～0.04％，硫酸锰0.01～0.03％，余量为水，ph7.0～8.0；
(3)按1％接种量，将二级种子液接种到发酵罐内的发酵培养基，在35～38℃，转速100rpm/min，通气量为1500l/h、罐压保持在0.04～0.06mpa条件下培养46～48h，培养后的发酵液中解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)yn2010-kccgmccno.5722的有效活菌数≧1×1010cfu/ml时，该发酵液即为所述解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)yn2010-kccgmccno.5722的发酵液，所述发酵培养基与步骤(2)中所述的二级种子培养基相同。
(4)将草炭、珍珠岩和蛭石按体积比3:1:1混合后，添加解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)yn2010‐kccgmccno.5722发酵液，添加的解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)yn2010‐kccgmccno.5722发酵液使配制的防治烟草黑胫病的生物育苗基质中解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)yn2010-kccgmccno.5722的最终有效活菌数达到1×107cfu/cm3以上即为防治烟草黑胫病的生物育苗基质。
实施例3本发明方法培育的烟苗对烟草黑胫病的防治效果试验
1、供试材料：供试烟草品种为云烟97(云南省烟草公司提供)，对照药剂为40％烯酰吗啉1500倍液，18×9育苗盘，接种病原菌为寄生疫霉烟草致病变种，该病原菌根据科赫氏法则从患黑胫病烟草植株分离得到，通过形态学鉴定、生理生化鉴定和分子生物学鉴定确定为寄生疫霉烟草致病变种。
2、试验设计：
a处理：本发明方法漂浮育苗的烟苗对烟草黑胫病的防效试验
ⅰ、防治烟草黑胫病的生物育苗基质的配制：用草炭、珍珠岩、蛭石以草炭:珍珠岩:蛭石的体积比3：1：1混合均匀后，添加实施例2制备的解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)yn2010-kccgmccno.5722发酵液，使解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)yn2010-kccgmccno.5722在防治烟草黑胫病的生物育苗基质中最终有效活菌数达到1×107cfu/cm3即得到防治烟草黑胫病的生物育苗基质。
ⅱ、漂浮育苗
将防治烟草黑胫病的生物育苗基质装入18×9育苗盘，云烟97种子播种于育苗盘穴内，按常规的烟草漂浮育苗方法进行漂浮育苗，漂浮育苗水体为无菌水。
ⅲ、烟草种苗移栽
将漂浮育苗培育的云烟97种苗移栽到装有土壤的塑料盆中，浇100ml无菌水/株作为定根水，移栽3天后将配置好的寄生疫霉烟草致病变种孢子悬液(1×104个/ml)灌接于烟苗根部，接种量为5ml/株，然后按烟草常规栽培进行管理。
b处理：40％烯酰吗啉处理
ⅰ、配制育苗基质：
用草炭、珍珠岩、蛭石以草炭:珍珠岩:蛭石的体积比3：1：1混合均匀后为育苗基质
ⅱ、漂浮育苗：
用草炭、珍珠岩、蛭石以草炭:珍珠岩:蛭石的体积比3：1：1混合均匀后为育苗基质装入18×9育苗盘，云烟97种子播种于育苗盘穴内，然后浇40％烯酰吗啉1500倍液100ml/每穴，按常规的烟草漂浮育苗方法进行漂浮育苗，漂浮育苗水体为无菌水。
ⅲ、烟草种苗移栽
将漂浮育苗培育的云烟97种苗移栽到装有土壤的塑料盆中，浇100ml无菌水/株作为定根水，移栽3天后将配置好的寄生疫霉烟草致病变种孢子悬液(1×104个/ml)灌接于烟苗根部，接种量为5ml/株，然后按烟草常规栽培进行管理。
c处理：清水对照组
ⅰ、配制育苗基质：
用草炭、珍珠岩、蛭石以草炭:珍珠岩:蛭石的体积比3：1：1混合均匀后为育苗基质
ⅱ、漂浮育苗：
用草炭、珍珠岩、蛭石以草炭:珍珠岩:蛭石的体积比3：1：1混合均匀后为育苗基质装入18×9育苗盘，云烟97种子播种于育苗盘穴内，按常规的烟草漂浮育苗方法进行漂浮育苗，漂浮育苗水体为无菌水。
ⅲ、烟草种苗移栽
将漂浮育苗培育的云烟97种苗移栽到装有土壤的塑料盆中，浇100ml无菌水/株作为定根水，移栽3天后将配置好的寄生疫霉烟草致病变种孢子悬液(1×104个/ml)灌接于烟苗根部，接种量为5ml/株，然后按烟草常规栽培进行管理。
以上a、b、c每处理45株，三次重复。在温室进行，温室温度28℃，管理期间浇水无菌水保持土壤湿润以利于发病。
3、调查方法：接种病原菌20天后，调查各处理烟株的发病情况，计算病情指数、发病率和相对防效，调查方法见烟草病害分级及调查方法(yc/t39-1996)。
表1实施例3各处理对烟草黑胫病的温室防治效果
表1可见，本发明方法漂浮育苗的烟苗对烟草黑胫病的防治效果达到69.12％，其防效比40％烯酰吗啉提高27.72％，产生了显著的技术效果。