本发明属于组织培养技术领域，具体涉及一种植叶促根方法，尤其涉及一种番木瓜组培苗分化芽的茎段悬空植叶促根技术方法。
背景技术：
番木瓜(Carica papaya L.)又称木瓜、乳瓜、万寿果，为热带、亚热带常绿软木质大型多年生草本植物，可高达8-10米，具乳汁；茎不分枝或有时于损伤处分枝，具螺旋状排列的托叶痕。番木瓜果实长于树上，外形像瓜，故名之木瓜。番木瓜素有“岭南佳果”的美誉，其营养价值排在世界十大营养水果的首位，是我国农业品种结构调整的重要经济作物。
番木瓜传统的育种方式是杂交育种，目前商业种植大都是用种子进行实生苗繁殖，如CN103650857 A公开了一种番木瓜育苗及栽培方法，包括以下步骤：母株选择与采种、育苗、建园和定植、定植后管理、病虫害防治，母株选择具有优良性状的品种，要求果形端正，大小均匀，抗逆性强，生长健壮，节间较密，能连续结果的长圆形两性花株和雌株，育苗地选择：选择地势稍高、光照好、排水灌溉方便的砂壤土地块育苗。但番木瓜种子实生苗株性复杂，分为雌性株、雄性株、两性株，其中两性株占比约55％，而且仅两性株果实具有较高的商品价值。由于种子实生苗株性需要在定植开花之后才能鉴定识别，因此，果农在种植时无法保证两性株的一致性，导致种植成本的增加、产量和经济价值的损失。
目前我国番木瓜商业栽培已经开始利用组培苗，利用组织培养技术和两性株的侧芽可大量繁殖株性稳定和遗传性状稳定的番木瓜两性株种苗。如CN1596620A公开了一种番木瓜种苗的组织培养方法，包括如下步骤：外植体采集：取大田成龄番木瓜侧芽为外植体；预处理和消毒：采用含Vc+AgNO3+PVP的溶液、含羧苄青霉素(Carb.)的水先后预处理和用70％酒精、0.15％升汞消毒；培养：培养阶段包括初始接种、继代增殖培养、壮苗培养、催根培养、试管苗移栽等步骤。CN1481674A公开了一种生产株性稳定的番木瓜组培苗方法，涉及通过组织培养技术的植物再生方法。它是采用选株→外植体无菌消毒→接种于初代培养基上→诱导不定芽发生→切取不定芽转入继代培养基中增植培养→不定芽转入生根培养基中诱导不定根发生→形成具有根、茎、叶的完整番木瓜组培苗→假植→移植于营养杯→组培苗大田种植的方法。
然而，现有组培苗繁育技术中存在分化芽生根难、根系易出现膨化无根毛和愈伤化导致假植成活率低等问题，如何解决以上问题将成为降低番木瓜组培苗成本并大量推广应用的关键因素。
技术实现要素：
为此，本发明的目的在于提供一种番木瓜组培苗分化芽的茎段悬空植叶促根方法，解决了现有番木瓜组培快繁过程中分化芽生根难、根系易出现膨化无根毛和愈伤化导致假植成活率低的问题，通过组织培养快繁培育出了优良番木瓜种苗。
为达上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种番木瓜组培苗分化芽的茎段悬空植叶促根方法，将番木瓜组培苗分化芽叶片倒插于生根培养基，从而使分化芽基部切口悬空进行生根培养，该方法避免了根系出现膨化和愈伤化。
本发明的促根方法流程一般为：外植体选择和采集→外植体杀菌和消毒→初代培养→不定芽增殖培养→生根培养。
本发明建立了一种促进番木瓜组培苗分化芽有效生根的方法：茎段悬空的植叶促根法，通过该技术可从分化芽茎段切口愈合处长出1-6条具有根毛的正常根，出根率可从常规操作方法的20-50％提高到70-95％。
作为优选，本发明的植叶促根方法包括如下步骤：
(1)选取较为老熟的具有3片叶以上的分化芽，将倒数第二或者第三片叶片的部分叶尖端倒插进生根培养基，以支撑固定分化芽和吸收培养基养分，从而使分化芽基部切口悬空于空气中不接触培养基；
(2)第一周光照强度为2000-5000lx，第二周及以后光照强度为5000-10000lx进行生根培养。培养至大部分根系长约2-4cm，此时即可移植到基质培养基，生长成为正常小植株。第一周为从分化芽到生根的过渡阶段，此时因分化芽剪切受伤和恢复，不宜光照过强，第二周后适当增强光照有利于生根培养和壮苗。上述条件设置的光照强度是发明人经过大量研究发现的较为适宜的生根培养条件。
通过该技术培养7-9天可从分化芽基部切口愈合处长出1-6条具有根毛的正常根，培养14-21天后大部分根系长2-4cm，移植到无菌基质培养基(3/4蛭石+1/4泥炭土，加入不含蔗糖和有机物的1/2MS培养液使基质持水量至70％)后可生长成为正常小植株，成活率可达100％。与常规将分化芽基部直接插入生根培养基的生根技术相比，该技术可将分化芽生根率提高至75-90％，根系不会出现膨化和愈伤化现象，根毛发达，假植成活率95％以上。
作为优选，步骤(1)中选取的分化芽具有3-5片叶。
优选地，将叶尖端1/2-2/3插进生根培养基。
优选地，生根培养基为1/2MS+IBA 2mg/L+活性炭2g/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH为5.8。1/2MS是MS培养基各种成分的1/2浓度。
步骤(1)中使用的分化芽可通过现有技术进行制得，本发明没有特别限定，例如选择番木瓜组织培养外植体、消毒杀菌后，通过初代培养和增殖培养后获得的大量番木瓜分化芽。
作为优选，所述分化芽通过包括如下步骤的方法制得：
(a)外植体选择和采集：根据结果性状和株性表现，挑选大田成龄优良单株侧芽，去掉叶片和叶柄后截取顶端作为外植体；
(b)外植体杀菌和消毒：先用酒精溶液浸泡，无菌水冲洗；再用升汞溶液浸泡，无菌水冲洗；
(c)初代培养：经消毒的外植体初始接种于初代培养基在光照强度为1500lx下培养25-28天；培养中观察外植体培养的污染情况和出芽情况；
(d)不定芽增殖培养：截取经初代培养后的外植体萌发的不定芽接种于增殖培养基，在光照强度为2000lx下，以21-28天为一个继代周期培养5个继代周期以上。
优选地，步骤(a)中截取顶端2-5cm作为外植体。
优选地，步骤(b)中酒精溶液浓度为75％，浸泡30秒；升汞溶液浓度为0.1％，浸泡6～8分钟。升汞溶液中加入1滴吐温-80。
优选地，第一次无菌水冲洗2-3次，第二次无菌水冲洗4-5次。
优选地，步骤(c)中初代培养基为MS+6-BA 0.1mg/L+KT0.2mg/L+IAA0.4mg/L+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8。
优选地，光照培养在28℃条件下，每日光照培养12小时。
优选地，步骤(d)中增殖培养基为MS+6-BA 0.2mg/L+KT0.2mg/L+NAA0.1mg/L+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8。
优选地，光照培养在28℃条件下，每日光照培养12小时。
优选地，培养8-10个继代周期后可产生大量丛生不定芽。
作为优选，步骤(2)中每日光照培养12-14小时，优选为12hr/12hr光照/黑暗条件下培养。
优选地，生根培养在28-32℃下进行。
作为优选，本发明的方法包括如下步骤：
(1)外植体选择和采集：根据结果性状和株性表现，挑选大田成龄优良单株侧芽，去掉叶片和叶柄后截取顶端2-5cm作为外植体；
(2)外植体杀菌和消毒：先用75％酒精溶液浸泡处理30秒，无菌水冲洗2次；0.1％升汞溶液(1滴吐温-80)浸泡处理6～8分钟，无菌水冲洗4次；
(3)初代培养：经消毒的外植体初始接种于初代培养基：MS+6-BA0.1mg/L+KT0.2mg/L+IAA0.4mg/L+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8，28℃条件下，每日光照培养12小时，光照强度为1500lx，培养25-28天；
(4)不定芽增殖培养：外植体经初代培养后，截取萌发的幼芽接种于增殖培养基：MS+6-BA 0.2mg/L+KT0.2mg/L+NAA0.1mg/L+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8，28℃条件下，每日光照培养12小时，光照强度为2000lx，连续培养时间25-28天为一个继代周期，8-10个继代周期培养后可产生大量丛生不定芽；
(5)生根培养：选取具有3-5片叶、较老熟的单个不定芽，将叶片倒插于生根培养基，使不定芽茎段悬空于培养瓶中进行生根培养，生根培养基组成为：1/2MS+IBA 2mg/L+活性炭5g/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH＝5.8，28-32℃，每日光照培养12-14小时，第一周光照强度为2000-5000lx，第二周及以后光照强度为5000-10000lx，培养7-9天后可见根尖从分化芽切口愈合处长出，培养14-21天后大部分根系长2-4cm，此时即可移植到基质培养基，生长成为正常小植株。
与常规生根技术相比，本发明的茎段悬空植叶促根技术利用侧芽为外植体，通过消毒杀菌后进行初代培养和继代培养后获得大量分化芽，该技术可将分化芽生根率提高至75-90％，根系不会出现膨化和愈伤化现象，根毛发达，假植成活率达到95％以上。
具体实施方式
为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅用于帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
一种番木瓜组培苗分化芽的茎段悬空植叶促根技术，应用材料为“穗黄”番木瓜品种，包括以下步骤：
(1)外植体的选择和采集：于晴朗天气选取大田成龄优良单株健壮侧芽，去掉叶片和叶柄后，截取顶端2-5cm作为外植体。
(2)外植体杀菌和消毒：(1)先用75％酒精溶液浸泡处理30秒，无菌水冲洗2次；(2)0.1％升汞溶液(1滴吐温-80)浸泡处理6～8分钟，无菌水冲洗4次。
(3)初代培养：经消毒的外植体初始接种于初代培养基：MS+6-BA0.1mg/L+KT0.2mg/L+IAA0.4mg/L+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8，28℃条件下，每日光照培养12小时，光照强度为1500lx，培养25-28天。
(4)不定芽增殖培养：外植体经初代培养后，截取萌发的不定芽接种于增殖培养基：MS+6-BA 0.2mg/L+KT0.2mg/L+NAA0.1mg/L+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8，28℃条件下，每日光照培养12小时，光照强度为2000lx，连续培养时间25-28天为一个继代周期。8-10个继代周期培养后可产生大量丛生不定芽。
(5)选取具有3-5片叶、较老熟的单个不定芽，将叶片倒插于生根培养基，使不定芽茎段悬空于培养瓶中进行生根培养。生根培养基组成为：1/2MS+IBA 2mg/L+活性炭5g/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH＝5.8，28-32℃，每日光照培养12-14小时，第一周光照强度为3000lx，第二周及以后光照强度为8000lx，培养7-9天后可见根尖从分化芽切口愈合处长出，培养14-21天后大部分根系长2-4cm，此时即可移植到基质培养基，生长成为正常小植株。
实施例2
按照实施例1进行，所不同的是应用材料为“日升”番木瓜品种。
实施例3
按照实施例1进行，所不同的是应用材料为“夏选”番木瓜品种。
实施例4
按照实施例1进行，所不同的是步骤(5)中第一周光照强度为2000lx，第二周光照强度为5000lx。
实施例5
按照实施例1进行，所不同的是步骤(5)中第一周光照强度为5000lx，第二周光照强度为10000lx。
对比例1
按照实施例1进行，所不同的是在生根培养时，将分化芽茎段基部插于生根培养基中进行生根。
对比例2
按照实施例2进行，所不同的是在生根培养时，将分化芽茎段基部插于生根培养基中进行生根。
对比例3
按照实施例3进行，所不同的是在生根培养时，将分化芽茎段基部插于生根培养基中进行生根。
对比例4
按照实施例1进行，所不同的是步骤(5)中第一周光照强度为1000lx，第二周光照强度为2000lx。
对比例5
按照实施例1进行，所不同的是步骤(5)中第一周光照强度为3000lx，第二周光照强度为12000lx。
实施例1-5和对比例1-5不同品种番木瓜组培苗分化芽的生根结果如下表1中所示。从表1的结果可以看出，使用本发明的悬空植叶促根方法配合特定的光照及其他合适条件，分化芽生根率及假植成活率更高，且根系不会出现膨化和愈伤化现象，根毛发达。
表1
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。