本发明属于植物重金属污染修复技术领域，具体涉及一种显著降低生菜镉积累的混种方法。
背景技术：
在农业生产上，通过间(混)作方式不仅能提高植物产量，减少病虫害的发生，还能改善土壤环境，提高土壤酶活性和作物对养分元素的吸收。可通过间套作技术将植物修复技术应用于农田土壤重金属污染修复，合理搭配的间(混)种可以提高超富集植物对重金属的积累作用，降低蔬菜对重金属的吸收，有利于蔬菜在土壤重金属污染修复的同时进行正常的农业生产。
杂交育种一般是指品种间有性杂交育种，它是通过品种间杂交创造变异而选育新品种的方法。而生态型(ecotype)是指同一物种内因适应不同生境而表现出具有一定结构或功能差异的不同类群。由于两亲本可以互为父母本进行杂交，因此有正反交之称。这种杂交方式比复交后代分离小，稳定较快。但是不同成对杂交组合后代分离大小及稳定快慢，决定于亲本间的差异大小和亲缘远近。育种实践证明，成对杂交的两亲本，如果来源较近，性状差异较小，杂交后代分离小，稳定较快；反之则分离大，稳定较慢。利用不同生态型植物杂交改良品种是一个切实可行的方法，王坚等利用9个不同生态类型的59份粳稻亲本材料，以生态型为单位进行杂交，研究各生态类型和杂种主要品质特性，结果表明：各类型中华北粳、日本粳和韩国粳为亲本的生态组合不仅表现出较高的整精米率，而且高整精米率出现的比例大；尚春树用不同生态来源6个早熟大豆品种进行了完全双列杂交，得出了东北、南方大豆早熟基因源能在华北有效应用的结论，改变了过去本地只利用东北大豆早熟基因源，认为南方品种引入华北不能早熟的观点，为华北寻找早熟基因源拓宽了范围。利用不同生态型的超富集植物进行杂交育种，对其后代进行筛选，可能得到集不同生态型超富集植物优势性状于一体的改良品种。就超富集植物而言，由于重金属胁迫的强选择压力和植物耐金属胁迫的显性性状的缘故，导致超富集植物种群之间耐金属胁迫的分化非常快速，生长在不同矿山或重金属污染土壤上的种群，甚至生长在同一矿山或重金属污染土壤上的不同个体之间耐重金属胁迫或积累金属的能力也不相同，从而分化出不同的生态型。不同生态型超富集植物间的杂交育种，可为重金属污染的修复治理开辟一条新的路径。
不同的蔬菜对土壤重金属的吸收存在很大的差异，重金属在蔬菜中的含量由高到低依次为叶菜类、根茎类、瓜果类。近年来，叶菜类蔬菜以其在生产过程中较之其他类型蔬菜更高的重金属积累量，引起了人们的广泛关注。生菜(lactucasativa)是叶用莴苣的俗称，属菊科莴苣属，为一年生或二年生草本作物，作为生吃蔬菜食用有较高的营养价值。其作为四川地区叶菜类蔬菜的常见代表，已经有研究证实其在受重金属污染的土壤上生长时对重金属镉具有一定的积累量。
如何通过不同生态型作物的混种方式对生菜的生长与镉积累进行有效调控，以期解决生菜栽培过程中由于遭受严重的土壤镉污染而导致的生菜安全性生产日益严重的问题，成为现有蔬菜栽培中面临的一个技术问题。
技术实现要素：
本发明的目的就是为了解决上述技术问题，而提供一种显著降低生菜镉积累的混种方法，不仅能够通过混种有效提高生菜的产量，而且混种栽培后生菜中的镉含量得到大幅度降低。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种显著降低生菜镉积累的混种方法，是将两种生态型少花龙葵的正反杂交f1代与生菜进行混种，所述正反杂交f1代是将农田生态型少花龙葵和矿山生态型少花龙葵分别作为母本进行正反杂交所得的杂交后代，所述正反杂交f1代与生菜按株数比1:2进行混种。
其中，所述矿山生态型少花龙葵是指位于山地亚热带气候区生长的少花龙葵，所述农田生态型少花龙葵是指位于亚热带湿润季风气候区生长的少花龙葵。
进一步的，所述正反杂交的方式包括以下两种方式：
以农田生态型少花龙葵作为母本进行杂交：在盛花期，于前一天将农田生态型少花龙葵花苞中雄蕊除去，并套袋隔离，于第二天将矿山生态型少花龙葵花粉涂抹于农田生态型少花龙葵去雄花的雌蕊上，并套袋隔离，待植株成熟收集种子留用；
以矿山生态型少花龙葵作为母本进行杂交：在盛花期，于前一天将矿山生态型少花龙葵花苞中雄蕊除去，并套袋隔离，于第二天将农田生态型少花龙葵花粉涂抹于矿山生态型少花龙葵去雄雌蕊上，并套袋隔离，待植株成熟收集种子留用；
上述两种杂交方式中收集到的种子即为正反杂交f1代。
进一步的，所述正反杂交f1代选取至少有4片真叶展开时进行混种。
进一步的，混种期间保持土壤田间持水量为80％。
进一步的，混种期间进行田间管理，及时去除杂草和防治病虫害。
如本发明实施例所示，本发明采用两种生态型少花龙葵的正反杂交f1代与生菜进行混种，产生了以下有益效果：
(1)混种后生菜的产量得以大幅度增长，与单种生菜相比，其根系产量可增长20％以上，地上部分产量可增长10％以上；
(2)混种后生菜中镉含量得以大幅度降低，与单种相比，混种后生菜根系部分镉含量下降了25％以上，生菜地上部分镉含量下降了26％以上；且正反杂交f1代的镉含量也得以降低；
(3)混种后生菜中镉积累量显著降低，而正反杂交f1代中镉积累量大幅度提升。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行具体描述，有必要指出的是，以下实施例仅仅用于对本发明进行解释和说明，并不用于限定本发明。本领域技术人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例
(一)试验材料与方法
1.1试验材料
1.1.1植物材料
四川省汉源县小关村铅锌矿区收集矿山生态型少花龙葵种子(同一株)，四川农业大学雅安校区农场农田收集农田生态型少花龙葵种子(同一株)。
四川农业大学雅安校区农场(北纬30°23′，东经103°48′)，位于四川省雅安市雨城区，平均海拔620m，属亚热带湿润季风气候区，多年平均气温16.2℃，多年平均降雨量为1743.3mm，多年平均日照1035h，多年平均蒸发量为1011.2mm。
四川省汉源县小关村铅锌矿区(东经：102°38′，北纬：29°24′)位于四川省雅安市汉源县，平均海拔890m，地处北温带与季风带之间的山地亚热带气候区，具有典型的干热河谷气候特点，多年平均气温17.9℃，多年平均降雨量为741.8mm，多年平均日照1475.8h，多年平均蒸发量为1248.2mm。
1.1.2土壤
试验用土壤为紫色土，取自四川农业大学雅安校区农场农田(北纬30°23′，东经103°48′)，土壤ph6.94，有机质43.64g·kg-1，全氮3.63g·kg-1，全磷0.38g·kg-1，全钾17.54g·kg-1，全镉0.103mg·kg-1，碱解氮195.00mg·kg-1，速效磷6.25mg·kg-1，速效钾191.13mg·kg-1，有效态镉0.022mg·kg-1。
1.1.3植物材料培育
将收集的少花龙葵种子直接播种于21cm×20cm(直径×高)的塑料盆，试验用土取自四川农业大学雅安校区农场。盛花期开始杂交，处理方式如下：
(1)农田生态型少花龙葵为母本杂交：在开花前一天下午，将农田生态型少花龙葵花苞中雄蕊除去，并套袋隔离。于第二天中午将矿山生态型少花龙葵花粉涂抹于农田生态型少花龙葵去雄花的雌蕊上，并套袋隔离。
(2)矿山生态型少花龙葵为母本杂交：在开花前一天下午，将矿山生态型少花龙葵花苞中雄蕊除去，并套袋隔离。于第二天中午将，农田生态型少花龙葵花粉涂抹于矿山生态型少花龙葵去雄雌蕊上，并套袋隔离。
待植株成熟收集种子留用，即为两种生态型少花龙葵杂交f1代，标记为父矿少花龙葵与父农少花龙葵。
1.2试验方法
试验于2014年4月-6月在四川农业大学雅安校区农场内进行。2014年4月将土壤风干、压碎、过5mm筛后，称取3.0kg装于21×20cm(高×直径)的塑料盆内，分别加入10mg/kg的镉，镉的加入形式为分析纯的cdcl2·2.5h2o，使其与土壤充分混匀，保持土壤田间持水量的80％，自然放置平衡4周后再次混合备用。2014年4月把收集来的两种生态型少华龙葵杂交f1代在种子培育箱中播种育苗，在培养皿里铺上一层滤纸，用少量的水打湿，有助于种子粘在上面，然后在种子上面再铺一层滤纸，放进种子发芽箱，每天浇水保持湿度。5月将培育好，长势一致，4片真叶展开的不同生态型少花龙葵及其杂交f1代幼苗分别与生菜幼苗移栽于盆中。不同生态型少花龙葵及其f1代混种每盆2株，生菜单种(ck)每盆4株，混种每盆6株，每个处理重复3次。盆与盆之间的距离为15cm，完全随机摆放。土壤表面覆盖黑麦草秸秆以减少土壤水分蒸发。在整个生长过程中不定期的交换盆与盆的位置以减弱边际效应的影响，并及时去除杂草，防治病虫害。试验共计5个处理：生菜单种作为对照(简记为生菜单种(ck))、生菜混农田型少花龙葵(简记为生菜混农田)、生菜混矿山型少花龙葵(简记为生菜混矿山)、生菜混父农少花龙葵(简记为生菜混父农)与生菜混父矿少花龙葵(简记为生菜混父矿)。
1.3测定指标与方法
35天后分别取生菜叶子测定叶绿素(chl)和超氧化物歧化酶(sod)、过氧化物酶(pod)、过氧化氢酶(cat)活性。叶绿素含量与sod、pod、cat活性参照张治安用紫外分光光度计测定。
种植2个月后(2014年6月)，对生菜整株收获，用自来水将根系和地上部分的土壤清洗干净，再用去离子水冲洗3次。称量生菜鲜重，测定其生物量，然后将根系、茎杆和叶片于110℃杀青15min，75℃烘干至衡重，称重，粉碎，过100目筛。称取1.000g样品，加入硝酸-高氯酸(体积比为4:1)放置12h后消化至溶液透明，过滤，定容至50ml，用icap6300型icp光谱仪测定(thermoscientific，usa)镉含量。
1.4数据处理
采用dps系统进行方差分析(duncan新复极差法进行多重比较)。
(二)结果与分析
2.1混种两种生态型少花龙葵及其杂交f1代对生菜产量的影响
混种两种生态型少花龙葵及其杂交f1代对生菜产量的影响如表1所示。从表1中可以看出，混种后，生菜根系与地上部分的产量均显著高于生菜单种(ck)(p＜0.05)，生菜根系与地上部分的产量的大小顺序均为：生菜(混父农)＞生菜(混父矿)＞生菜(混农田)＞生菜(混矿山)＞生菜单种(ck)；与单种相比，混种矿山、混种农田、混种父矿、混种父农的生菜根系产量分别增加了18.26％、21.00％、21.96％、22.43％(p＜0.05)；生菜地上部分产量分别增加了3.20％、5.30％、7.80％、14.3％(p＜0.05)，这说明混种不同生态型少花龙葵及其杂交f1代能够促进生菜的生长，其中混种杂交后代的生菜的各部分产量都要大于混种亲本的。
表1混种两种生态型少花龙葵及其杂交f1代对生菜产量的影响
注:数据后的小写字母表示5％水平差异。表2～4同。
农田(农田型)：农田型少花龙葵；矿山(矿山型)：矿山型少花龙葵，父矿：父矿少花龙葵；父农：父农少花龙葵，下同。
2.2混种对生菜及不同生态型少花龙葵和杂交f1代镉含量的影响
不同混种处理对生菜镉含量的影响如表2所示，对两种生态型少花龙葵及其杂交f1代镉含量的影响如表3所示。从表2中可以看出，四种处理在根系镉含量与地上部分镉含量相较于生菜单种(ck)显著降低(p＜0.05)；生菜根系镉含量以及根系的富集系数的大小顺序均为：生菜单种(ck)＞生菜(混农田)＞生菜(混矿山)＞生菜(混父矿)＞生菜(混父农)；与单种相比，混种矿山、混种农田、混种父矿、混种父农的生菜根系的镉含量分别下降了14.40％、17.69％、24.09％、31.64％(p＜0.05)；生菜地上部分镉含量的大小顺序为：生菜单种(ck)＞生菜(混矿山)＞生菜(混农田)＞生菜(混父矿)＞生菜(混父农)；与单种相比，混种矿山、混种农田、混种父矿、混种父农的生菜的地上部分镉含量分别下降了9.45％、13.82％、26.07％、29.13％(p＜0.05)。混种后父农少花龙葵和父矿少花龙葵两种杂交f1后代中镉含量与矿山型少花龙葵和农田型少花农葵相比均显著下降。
表2混种对生菜镉含量的影响
表3混种对两种生态型少花龙葵及其杂交f1代镉含量的影响
2.3混种对生菜镉积累量的影响
不同混种处理对生菜镉积累量的影响如表4所示。从表4可以看出，经生菜混父农以及生菜混父矿处理后，生菜中地上部分镉积累量均显著下降，与生菜单种(ck)相比，降幅分别为38.91％和21.19％。
表4混种对生菜镉积累量的影响
2.4混种对两种生态型少花龙葵及其杂交f1代镉积累量的影响
不同混种处理对两种生态型少花龙葵及杂交f1代镉积累量的影响如表5所示。从表5可以看出，经杂交f1代与生菜混种后，父矿少花龙葵和父农少花龙葵的镉积累量与亲本矿山少花龙葵和亲本农田少花龙葵的镉积累量相比，无论是根系部分镉积累量还是地上部分镉积累量，均得以大幅度提升，可以更好地将超富集植物少花龙葵用于土壤镉污染的治理。
表5混种对两种生态型少花龙葵及其杂交f1代镉积累量的影响
2.5混种两种生态型少花龙葵及其杂交f1代对生菜叶片色素含量的影响
混种两种生态型少花龙葵及其杂交f1代对生菜叶片色素含量的影响如表6所示。从表6中可以看出：混种不同生态型少花龙葵及其杂交f1代后叶绿素a、b含量与总量相较于单种大部分都有显著的增加(p＜0.05)，且大小顺序均为生菜(混父矿)＞生菜(混父农)＞生菜(混矿山)＞生菜(混农田)＞生菜单种(ck)。其中相较于生菜单种(ck)，混种矿山、混种农田、混种父矿、混种父农的叶绿素a含量分别增加了：2.08％(p＞0.05)、0.86％(p＞0.05)、13.54％(p＜0.05)、8.79％(p＜0.05)；混种矿山、混种农田、混种父矿、混种父农的叶绿素b含量分别增加了：7.14％、3.33％、17.14％、10.00％(p＜0.05)；混种矿山、混种农田、混种父矿、混种父农的叶绿素总含量分别增加了：3.32％、1.44％、14.40％、9.19％(p＜0.05)。从叶绿素a/b看，混种不同生态型少花龙葵及其杂交f1代后叶绿素a/b均高于单种且大小顺序也为(混父矿)＞生菜(混父农)＞生菜(混矿山)＞生菜(混农田)＞生菜单种(ck)。但是混种杂交f1代后的生菜的叶绿素含量比混种亲本的增加的幅度更大，其中混种父矿的生菜的叶绿素含量增加幅度最大，较单种的叶绿素a、b与总量分别增加了13.54％、17.14％、14.40％。
表6混种两种生态型少花龙葵及其杂交f1代对生菜叶片色素含量的影响
2.6混种两种生态型少花龙葵及其杂交f1代对生菜抗氧化酶活性的影响
混种两种生态型少花龙葵及其杂交f1代对生菜抗氧化酶活性的影响如表7所示。从表7中可以看出，混种不同生态型少花龙葵及其杂交f1代后，生菜中的sod、pod与cat的活性显著增高(p＜0.05)，且大小顺序都为：生菜(混父矿)＞生菜(混父农)＞生菜(混矿山)＞生菜(混农田)＞生菜单种(ck)，这说明混种不同生态型少花龙葵及其杂交f1代能够提高生菜的抗性；其中混种杂交f1代的生菜的抗氧化酶活性要高于混种亲本的，这说明杂交f1代比亲本更有利于生菜在镉胁迫的条件下生长。
表7两种生态型少花龙葵及其杂交f1代对生菜抗氧化酶活性的影响