本发明涉及植物繁殖技术领域，尤其涉及一种木麻黄愈伤组织再生体系的建立方法。
背景技术：
木麻黄，(学名：casuarinaequisetifoliaforst.)是木麻黄科，木麻黄属常绿乔木。木麻黄科(casuarinaceae)植物属植物界被子植物门双子叶植物纲轮生目，为热带亚热带常绿阔叶树种，乔木或灌木。该科植物常统称为木麻黄，是被子植物较特殊的一类，没有较近亲缘关系，是南半球系统发育比较早、自身变异性大的植物。木麻黄科植物有96种，4属。其叶高度退化，能减少水分流失，具有很强的抗旱能力，天然分布于澳大利亚、东南亚和太平洋群岛，垂直分布于海平面潮线开始至海拔3,000多米的高山[4]。木麻黄具有速生、耐盐碱、耐贫瘠、抗干旱等特点，对我国滨海防风固沙、沿海陆地生态系统的恢复等有重要作用，现已成为重要的沿海防护林和退化地的改造树种，也是薪炭材和造纸等多用途树种。
对木麻黄无性系繁殖与再生体系的研究大大促进了我国对于木麻黄引种后推广种植和品种改良。从1976年对木麻黄嫁接技术[7]的研究开始迄今为止，我国对木麻黄无性系的繁殖与再生研究一直未曾间断过，但其研究主要集中在使用实生苗枝条进行扦插、水培处理得到无性系植株，对所得植株进行逆境处理测量生理生化指标从而进行品种改良。而对于利用木麻黄愈伤组织再生体系获得无性系植株的研究国内外可见报道都很有限。
1996年le等(leqv,boguszd,gherbih,etal.agrobacteriumtumefaciensgenetransfertocasuarinaglauca,atropicalnitrogen-fixingtree[j].plantscience,1996,118(1):57-69)以粗枝木麻黄的45d苗龄实生苗上胚轴为外植体诱导愈伤组织建立了转基因体系，但未见其对愈伤组织再生苗的描述。1997年franche等(franchec,dioufd,leqv,etal.genetictransformationoftheactinorhizaltreeallocasuarinaverticillatabyagrobacteriumtumefaciens[j].plantjournal,1997,11(4):897-904)在此基础上对轮生木麻黄进行了转基因研究，并以木麻黄种胚为外植体建立了愈伤组织再生体系，但木麻黄的种子较小，种胚获得极为不易且以种胚为外植体污染率极高，处理后的种子发芽率仅有30％。2003年刘英等(刘英,仲崇禄,白嘉雨,等.不同盐浓度对木麻黄无性系愈伤组织的影响[j].广东林业科技,2003,19(2):47-50)对木麻黄的愈伤组织进行了耐盐研究，但并未提及是否获得愈伤组织诱导的再生苗。而2010年至2015年期间姜清彬等(姜清彬.细枝木麻黄再生体系及农杆菌介导遗传转化研究[d].中国林业科学研究院,2011；姜清彬,仲崇禄,曾炳山,等.抗生素对细枝木麻黄愈伤组织再生及农杆菌生长的影响[j].东北林业大学学报,2010,38(9):104-107；姜清彬,仲崇禄,陈羽,等.细枝木麻黄离体培养过程中愈伤组织和再生芽的细胞组织学观察[j].热带亚热带植物学报,2015(1):37-42；林永生,蒋晶,乔桂荣,等.细枝木麻黄组织培养和转基因研究(英文)[j].agriculturalscience&technology,2012,40(1):1313-1314.)对细枝木麻黄的愈伤组织再生体系进行了较为系统的研究，并以其实生苗的上胚轴为外植体建立了愈伤组织再生体系，但该体系主要针对细枝木麻黄建立且所需培养周期较长。
目前，现有愈伤组织再生体系的研究大多不够完善，对实验材料的限制性也相对较大，其实验结果的可重复性不高，试验周期较长，研究者不能很好地利用该体系进行后续分子水平上的研究。
因此，有必要进一步深入探究更为完善、快速的木麻黄愈伤组织再生体系。
技术实现要素：
本发明提供了一种木麻黄愈伤组织再生体系的建立方法，该方法可有效缩短体系建立周期，提高转化效率。
具体技术方案如下：
本发明提供了一种木麻黄愈伤组织再生体系的建立方法，包括：
(1)取木麻黄实生苗的幼嫩枝条作为外植体，清洗消毒后，切成小段，接至外植体膨大诱导培养基上进行培养，得到膨大的茎段；所述外植体膨大诱导培养基为：1/2ms+3％蔗糖+0.1mg/ltdz+0.1mg/lnaa，ph5.7±0.1；
(2)取所述膨大的茎段，移至愈伤组织诱导培养基上进行培养，得到愈伤组织；所述愈伤组织诱导培养基为：1/2ms+3％蔗糖+0.5mg/l6-ba+0.1mg/ltdz，ph5.7±0.1；
(3)将所述愈伤组织移至不定芽诱导培养基中进行培养，得到含有不定芽的愈伤组织；
(4)将所述不定芽移至生根培养基中进行生根培养，炼苗后，得到木麻黄再生苗。
本发明中，“tdz”是指噻苯隆；“naa”是指萘乙酸；“6-ba”是指6-苄氨基腺嘌呤；“iaa”是指吲哚乙酸；“iba”是指吲哚丁酸。
本发明在试验初期仅采用常规的方法对外植体直接进行愈伤组织培养，发现获得的愈伤组织无法正常分化得到不定芽或者分化获得的不定芽无法正常生长，从而得到正常的再生苗；而采用特定培养基进行膨大培养后，再进行愈伤组织培养能够得到健康的再生苗。
本发明采用的膨大培养过程是发明人在偶然间发现的，之后经过试验发现只有特定用量和特定类型的激素组分才能够获得膨大的茎段。发明人对膨大诱导培养基和愈伤组织诱导培养基进行了上百种不同激素配比试验，最终得到上述再生周期短、转化率高的再生体系建立方法，得到健康的再生苗。
外植体的选择对再生植株获取的时间以及转化率有较大影响。作为优选，步骤(1)中，所述幼嫩枝条为30-90日龄的实生苗根部1cm以上的枝条。
作为优选，步骤(1)中，所述清洗消毒的方法为：流水冲洗2-3h后，用75％的酒精消毒25～35s，再用无菌水冲洗3～4次后，用2％的次氯酸钠消毒4～6min，最后用无菌水冲洗4～6次；针对木麻黄外植体可起到高效杀菌消毒作用。
膨大诱导培养的条件有利于提高后续愈伤组织的诱导率；作为优选，步骤(1)中，膨大诱导培养的条件为：28℃下暗培养7-10d。
作为优选步骤(2)中，愈伤组织诱导培养的条件为：28℃下暗培养7-13d；利于提高愈伤组织的诱导率。
作为优选，步骤(3)中，所述不定芽诱导培养基为：1/2ms+3％蔗糖+0.5mg/l6-ba，ph5.7±0.1；利于提高不定芽诱导率。
作为优选，步骤(3)中，不定芽诱导培养10～15d后，继代一次，再培养45～60d；不定芽诱导培养的条件为：每天28℃下光照培养16h，光照强度为2lx；利于提高不定芽诱导率。
作为优选，步骤(4)中，所述生根培养基为：1/2ms+3％蔗糖+0.4mg/liaa+0.02mg/liba，ph5.7±0.1；利于提高生根率。
作为优选，步骤(4)中，生根培养的条件为：每天28℃下光照培养16h，光照强度为2lx；利于提高生根率。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明针对木麻黄将愈伤组织诱导培养分成两步，先采用特定的膨大诱导培养基培养获得膨大的茎段，再采用特定的愈伤组织诱导培养基得到愈伤组织，不仅能够获得转化率高的再生体系，而且能够明显缩短再生体系获得的周期，
(2)本发明方法以木麻黄的幼嫩枝条作为外植体，材料较易获得。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下仅列举了能够体现本发明创新之处的少部分具体实施案例。
实施例1
一种木麻黄愈伤组织再生体系的建立方法，具体步骤如下：
(1)以在人工温室中生长30-90天的木麻黄实生苗根部1cm以上的幼嫩枝条为外植体材料，流水冲洗2.5h后，用75％(v/v)的酒精消毒30s，再用无菌水冲洗3次后，用2％(v/v)的次氯酸钠消毒5min，最后用无菌水冲洗5次；将消毒后的幼嫩枝条切成长度为1cm左右的小段，铺放在外植体膨大诱导培养基上，28℃下暗培养8d后，茎段明显膨大，得到膨大的茎段；
其中，外植体膨大诱导培养基为：1/2ms+3％蔗糖+0.1mg/ltdz+0.1mg/lnaa，ph5.7±0.1；
(2)将膨大的茎段重新切割成2-3mm长短，移至愈伤组织诱导培养基上，28℃下暗培养10d，得到愈伤组织；
其中，愈伤组织诱导培养基为：1/2ms+3％蔗糖+0.5mg/l6-ba+0.1mg/ltdz，ph5.7±0.1；
(3)将暗培养的愈伤组织移至不定芽诱导培养基中，每天28℃下光照培养16h，光照强度为2lx，诱导不定芽的产生，培养7d后愈伤组织整体变绿并出现明显可见芽点，每14d继代一次，共培养55d，直至不定芽生长至1cm左右长度；
其中，不定芽诱导培养基为：1/2ms+3％蔗糖+0.5mg/l6-ba，ph5.7±0.1；
(4)将1cm左右长度的不定芽移至生根培养基中，每天28℃下光照培养16h，光照强度为2lx，待根长长至2cm后，取出至于室外进行炼苗，得到木麻黄再生苗。
实验结果：整个再生体系的生长发育周期为4-6个月，其中愈伤组织的诱导率可达到98-100％，不定芽的诱导率为95-100％，生根率可达75-85％。
对比例1
本对比例直接对外植体进行愈伤组织诱导培养，发现诱导获得的愈伤组织无法正常分化。
具体步骤如下：
(1)以在人工温室中生长30-90天的木麻黄实生苗根部1cm以上的幼嫩枝条为外植体材料，流水冲洗2.5h后，用75％(v/v)的酒精消毒30s，再用无菌水冲洗3次后，用2％(v/v)的次氯酸钠消毒5min，最后用无菌水冲洗5次；
将消毒后的幼嫩枝条切成长度为1cm左右的小段，铺放在愈伤组织诱导培养基上，28℃下暗培养14d，得到愈伤组织；其中，愈伤组织诱导培养基为：1/2ms+3％蔗糖+0.5mg/l6-ba+0.1mg/ltdz，ph5.7±0.1；
(2)将暗培养的愈伤组织移至不定芽诱导培养基中，每天28℃下光照培养16h，光照强度为2lx，诱导不定芽；
其中，不定芽诱导培养基为：1/2ms+3％蔗糖+0.5mg/l6-ba，ph5.7±0.1。
但是，愈伤组织的诱导率仅为90％—92％，外植体无膨大，仅在切口两端有白色愈伤产生，15％左右的愈伤存在明显的褐化现象；进行不定芽诱导时，愈伤整体变绿后并无大量明显可见芽点的产生，分化过程中愈伤组织仍存在褐化现象。
对比例2
本对比例采用不同培养基进行膨大诱导培养，发现不是所有的培养基都可以获得膨大的茎段，无法解决愈伤组织无法正常分化的问题。
具体内容如下：
本对比例除设置不同外植体膨大诱导培养基组分的处理外，其余步骤与实施例1完全相同。
根据不同的培养基组分，设置处理1～5。
处理1：1/2ms+3％蔗糖+0.5mg/l6-ba+0.1mg/ltdz，ph5.7±0.1；
处理2：1/2ms+3％蔗糖+0.05mg/lnaa+0.1mg/ltdz，ph5.7±0.1；
处理3：1/2ms+3％蔗糖+0.5mg/l6-ba+0.1mg/lnaa，ph5.7±0.1；
处理4：1/2ms+3％蔗糖+0.5mg/l6-ba+0.02mg/liba，ph5.7±0.1；
处理5：1/2ms+3％蔗糖+0.5mg/l6-ba+0.05mg/lkt，ph5.7±0.1；
结果表明，这5种处理下外植体均不会整体膨大，仅在切口的两端或者一端产生愈伤组织。其中处理2和处理3的外植体中间节间位置会有茎芽产生，愈伤组织的褐化现象比较明显，进行不定芽分化时褐化现象无法抑制，导致不定芽的诱导率大大降低且无法正常生长；进行不定芽诱导60天后并没有得到可用于生根的不定芽；处理4和处理5在愈伤的诱导阶段也会有不定芽的产生，愈伤组织与外植体交接的位置较易产生芽，但很难确定芽时源自于愈伤组织还是外植体本身，且在进行不定芽诱导的阶段带有不定芽的愈伤组织会出现发红、褐化的现象，从而导致不定芽的生长停滞、枯黄死亡。其中处理2的愈伤组织诱导率为80％，处理3的愈伤组织诱导率为87.5％，处理4的愈伤组织诱导率为50％，处理5的愈伤组织诱导率为83％。