一种视网膜水肿动物模型的建立方法与流程

本发明涉及一种视网膜水肿动物模型的建立方法。

背景技术

黄斑水肿作为一种常见的眼部病变，多见于视网膜静脉阻塞、糖尿病性视网膜病变、慢性葡萄膜炎、眼外伤、以及眼内手术后等。患者自觉视力下降、视物变形，逐渐加重，严重影响患者生活质量。黄斑水肿的发病机制主要是由于上述原发疾病造成黄斑区毛细血管损伤发生渗漏造成水肿。目前有大量科研工作者致力于治疗黄斑水肿的药物研发。临床前期实验需要一种视网膜水肿动物模型，用于观察所研发药物的治疗效果。该模型的建立要求简单、低创、起效快、维持时间长。

根据文献报道，可先建立黄斑水肿原发疾病的动物模型，随疾病进展，产生视网膜水肿。糖尿病视网膜病变模型建立耗时久、花费大，产生视网膜水肿几率不定；慢性葡萄膜炎模型多累及眼前段，易造成白内障等并发症，视网膜水肿形成几率不定且观察困难；眼球外伤或眼内手术导致的视网膜水肿，具有一定的偶然性，非人为可控。以上几种方案均无法提供快速起效、维持时间长的视网膜水肿动物模型。我们设想，可否阻塞视网膜静脉，造成视网膜水肿模型。

视网膜静脉阻塞动物模型多有报道。制备方法包括血管结扎法、透热法、凝血酶静脉滴注法、玻璃体腔内注入内皮素-1法、激光光凝法以及光化学反应法等。血管结扎法：早在1978年有学者选用猕猴，通过眶外侧壁切开、烧灼结扎视网膜中央静脉，造成血流中断、远端血流回流受阻。该方法操作复杂，破坏性较大，实验动物受创严重，术后易并发感染，动物死亡率高，现已淘汰。透热法，即玻璃体内电凝视网膜静脉法：选用家猪为模型动物，将二极管探针于角巩膜缘后3-4mm处插入玻璃体腔中，电凝上方视网膜静脉，直至血流中断、凝滞。此方法亦属于侵入性手术，实验动物创伤较大，术后易发生感染、眼压升高等并发症。凝血酶静脉滴注法：选用家兔，通过玻璃体手术，将凝血酶直接滴注于视网膜静脉管壁，6小时后可见血栓形成阻塞血管。该方法阻塞血管耗时长，且易随血流运行造成其他部位血管的阻塞。玻璃体腔注入内皮素-1法：选用家兔，将内皮素-1注入玻璃体，造成视网膜血管收缩、管腔缩小直至完全闭塞。该方法中内皮素-1注入剂量不定，造成血管短暂性痉挛或是彻底闭塞不定，且对视网膜血管的作用为非选择性，阻塞部位无法控制。激光光凝法：选用棕色挪威(bn)大鼠或sd大鼠，激光照射视网膜血管，激光产生的热能使血管阻塞。该方法阻塞效果短暂，实验动物多在术后3天左右出现血管再通。光化学反应法：选用bn大鼠或sd大鼠、无色素/有色素兔、小型猪等动物，采用激光联合光敏剂，如氯化硫磺酸肽菁、孟加拉玫瑰红，造成视网膜静脉阻塞。该方法可造成视网膜出血、视网膜脱离等并发症，术后3-5天即可见血管再通。有学者通过阻塞视网膜静脉制备视网膜水肿模型：选用sd大鼠，静脉注射光敏剂erythrosinb联合532nm激光持续照射视网膜8分钟，术后可立即出现血管损伤及视网膜厚度增加，但术后5天视网膜厚度恢复至术前，14天发生视网膜明显萎缩，无法提供长效视网膜水肿的动物模型，且长时间的激光照射增加对视网膜其他部位的损伤。

因此，需要建立一种视网膜水肿的动物模型，制备方法要求简单、低创、起效快、维持时间长。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，我们通过研究发现，577nm激光照射联合光敏剂孟加拉玫瑰红的合理应用，可阻塞鼠视网膜静脉造成视网膜水肿。该方法简单、低创，术毕光学相干断层扫描血流成像(octa)与光学相干断层扫描(oct)检查即可见视网膜水肿，且可维持长达2周。

因此，本发明的目的是提供一种新型建立视网膜水肿动物模型的方法。本发明采用577nm激光照射联合孟加拉玫瑰红的合理应用，使用光学相干断层扫描血流成像(octa)与光学相干断层扫描(oct)技术观察视网膜形态、血流及厚度。本发明致力于建立一种简单易行、动物损伤小、水肿起效快，维持时间长的造模方法。本发明建立的视网膜水肿动物模型，可以很好的满足相关的实验要求。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明的第一个方面，提供一种577nm激光照射联合光敏剂孟加拉玫瑰红在建立视网膜水肿动物模型中的应用方法。

本发明的第二个方面，提供一种视网膜水肿动物模型的建立方法，该方法包括：

(1)将孟加拉玫瑰红溶液注射至实验动物的尾静脉；以及

(2)采用577nm激光照射该实验动物的视网膜静脉，从而得到所述的动物模型。

本发明的第三个方面，提供一种观察模型动物视网膜水肿的方法，该方法包括：采用光学相干断层扫描血流成像(octa)与光学相干断层扫描(oct)技术，从而观察模型动物视网膜形态、血流及厚度。

本发明与现有技术相比，具有如下优点：

实验动物创伤小，属于非侵入性手术，且无术后感染等并发症；准确阻塞目标血管，对视网膜血管具有高度选择性，无其他部位损伤；快速阻塞目标血管，实施过程中即可观察到远端静脉回流受阻，近端静脉缺血变细；快速起效，术毕即可观察到视网膜水肿，水肿可维持长达2周，为相关实验的观察提供充足时间。采用octa/oct技术观察视网膜水肿，简单、无创、可重复性好。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1.octa显示模型动物视网膜静脉激光照射示意图，目标血管为灰色标注(白色箭头所示)。

图2.本发明实施例1中，使用octa技术angioretina8.00mm模式拍摄正常bn大鼠表层视网膜血管形态(a)、视网膜形态(b)、视网膜血流(c)以及视网膜厚度断层扫描结果(d)。

图3.本发明实施例1中，a组大鼠激光照射后立即使用octa技术angioretina8.00mm模式拍摄视网膜。本图列举为激光照射视网膜静脉4个分支。

图4.本发明实施例1中，a组大鼠的术前、术后1天、2周、3周oct检查结果。

图5.本发明实施例1中，b组大鼠的术前、术后1天、2周、3周oct检查结果。

图6.本发明实施例1中，c组大鼠的术前、术后1天、2周、3周oct检查结果。

图7.本发明实施例1中，d组大鼠的术前、术后1天、1周、2周oct检查结果。

图8.本发明实施例2中，a组小鼠的术前、术后1天、2周、3周视网膜组织病理学结果(he染色，200×)。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

本发明中，pd是指视盘直径(papillarydiameter),作为视网膜表面的测量标尺。

正如背景技术所介绍的，现有技术中建立视网膜水肿动物模型存在一定的不足，为了解决如上的技术问题，本发明提出一种新的视网膜水肿动物模型的建立方法。

在本发明的一个实施方案中，涉及一种577nm激光照射联合光敏剂孟加拉玫瑰红在建立视网膜水肿动物模型中的应用。

在本发明的一个实施方案中，涉及一种视网膜水肿动物模型的建立方法，该方法包括：

(1)将孟加拉玫瑰红溶液注射至实验动物的尾静脉；以及

(2)采用577nm激光照射该实验动物的视网膜静脉，从而得到所述的动物模型。

在本发明的一个实施方案中，所述的孟加拉玫瑰红溶液的配制方法包括：避光条件下，称量孟加拉玫瑰红粉末，将其溶解于生理盐水，充分混匀，制成孟加拉玫瑰红溶液；经无菌滤膜过滤得到待用孟加拉玫瑰红溶液。

优选的，所述无菌滤膜的孔径为0.22μm；配制完成后，4℃避光保存备用。

在本发明的一个实施方案中，实验动物为bn大鼠或c57bl/6小鼠。

优选的，所述bn大鼠，雌性，7-8周龄，体重140-160g，以及所述c57bl/6小鼠，雌性，6-8周龄，体重18-22g。实验前均经裂隙灯显微镜、octa/oct检查，排除实验动物双眼屈光间质及视网膜的异常。

在本发明的一个实施方案中，实验动物腹腔注射10％(w/w)水合氯醛，麻醉妥后，鼠尾静脉注射孟加拉玫瑰红溶液。

在本发明的一个实施方案中，鼠尾静脉注射孟加拉玫瑰红溶液30-60秒后，即可进行577nm激光照射视网膜静脉。

本发明遵循低能量、小光斑、长曝光时间、重复激光照射的原则。在本发明的一个实施方案中，所述577nm激光照射参数为：光斑直径为50-60μm，曝光时间为0.3秒，激光能量为60-80mw。经过实验验证，采用该激光照射条件能够获得效果最佳的视网膜水肿动物模型。

在本发明的一个实施方案中，激光照射实验动物的视网膜静脉的具体方法包括：充分散瞳后，距离视乳头1-3pd范围内确定目标静脉(图1)，由近及远，对长约1-2pd的静脉进行激光照射，直至镜下观察到远端静脉回流受阻，近端静脉缺血变细。本发明使用小光斑、低能量、长曝光时间、重复激光照射，刺激所照射血管内血栓形成，阻塞血管。术毕即可观察到视网膜增厚，术后1天视网膜出现弥漫性增厚。

在本发明的一个实施方案中，选择2-3支视网膜静脉进行激光照射，其视网膜水肿效果最佳。

在本发明的一个实施方案中，视网膜水肿动物模型建立的关键是阻塞视网膜静脉，在裂隙灯显微镜下观察到静脉血栓形成。随之使用octa/oct技术持续观察视网膜形态、血流、以及视网膜厚度。在不同时间点处死动物，取出眼球，包埋切片，he染色，观察视网膜组织学变化。在视网膜静脉阻塞后，octa/oct检查可立即观察到视网膜增厚，术后1天视网膜呈现弥漫性增厚，维持2周。组织学检查证实octa/oct检查结果。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例中，主要仪器：法国光太577nm半导体激光；

主要试剂：孟加拉玫瑰红粉末购自美国sigma公司；复方托吡卡胺滴眼液、盐酸奥布卡因滴眼液、左氧氟沙星滴眼液均购自日本参天制药株式会社；生理盐水与10％(w/w)水合氯醛。

实施例1：使用bn大鼠建立视网膜水肿模型

步骤1：孟加拉玫瑰红溶液的配制

在避光条件下，精密称量孟加拉玫瑰红粉末50mg，置于1.5ml棕色ep管中，加入1.0ml生理盐水，充分混匀。0.22μm无菌过滤器过滤3次后，制得的孟加拉玫瑰红溶液(50mg/ml)，4℃保存备用。

步骤2：bn大鼠准备

雌性bn大鼠4只，7-8周龄，体重平均150g，10％(w/w)水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔注射。麻醉妥后，复方托吡卡胺滴眼液充分散瞳，裂隙灯、octa/oct检查，记录(图2)。固定大鼠，尾部75％酒精充分消毒。50mg/ml孟加拉玫瑰红溶液(0.1ml/100g)室温静置10分钟后行鼠尾静脉注射，注射完毕再次消毒，防止感染。盐酸奥布卡因滴眼液行眼表面麻醉。注射孟加拉玫瑰红溶液30-60秒后，即可开始激光照射。

步骤3:577nm激光照射视网膜静脉

4只bn大鼠均取右眼作为模型建立眼，左眼为对照眼。分别命名为a、b、c、d大鼠。在裂隙灯显微镜下可清晰观察到大鼠视网膜血管，在距离视盘1-3pd范围内选择目标静脉。遵循低能量、小光斑、长曝光时间、重复激光照射的原则。设置激光参数：光斑直径50-60μm，曝光时间0.3秒，激光能量60-80mw。a鼠选择视网膜静脉4个分支：上、下、左、右；b鼠选择3个分支；c鼠选择2个分支；d鼠选择1个分支。距离视盘由近及远重复多次激光照射，封闭静脉1-2pd长度，直至在裂隙灯显微镜下观察到远端静脉回流受阻，近端静脉缺血变细，形成视网膜静脉阻塞。术毕给予左氧氟沙星滴眼液点眼。

步骤4：观察模型动物视网膜水肿状况

裂隙灯显微镜下观察到视网膜静脉阻塞后，立即行octa检查(图3)。激光术后每天裂隙灯观察术眼前节，使用octa/oct技术观察视网膜，直至视网膜水肿消退。记录并比较每组大鼠的双眼情况以及不同组大鼠模型眼情况。

步骤5：结果分析

每组bn大鼠阻塞血管数量不同，视网膜反应不同。a鼠视网膜静脉阻塞后即可观察到视网膜血流信号中断或缺失，视网膜水肿、增厚，术后1天视网膜弥漫性增厚、神经上皮脱离，术后2周较术后1天视网膜明显增厚，轻度神经上皮脱离，术后3周视网膜水肿减轻、结构紊乱(图4)。b、c鼠术后1天视网膜弥漫性水肿，术后2周仍可见视网膜弥漫性水肿，术后3周视网膜水肿消退、明显薄变(图5，图6)。d鼠术后1天视网膜弥漫性增厚，术后1周视网膜水肿明显减轻，术后2周视网膜水肿完全消退，轻度薄变(图7)。

总结：采用577nm激光联合光敏剂孟加拉玫瑰红，激光采用低能量、小光斑、长曝光时间，选择2-3支静脉，重复照射，水肿形成效果最佳，维持时间长达2周，且对视网膜损害小，符合对视网膜水肿动物模型的要求。因视网膜相关研究常使用的实验动物包括bn大鼠和c57bl/6小鼠，故选择c57bl/6小鼠验证。

实施例2：使用c57bl/6小鼠建立视网膜水肿模型

步骤1：孟加拉玫瑰红溶液的配制

在避光条件下，精密称量孟加拉玫瑰红粉末25mg，置于1.5ml棕色ep管中，加入1.0ml生理盐水，充分混匀。0.22μm无菌过滤器过滤3次后，制得孟加拉玫瑰红溶液(25mg/ml)，4℃保存备用。

步骤2：c57bl/6小鼠准备

雌性c57bl/6小鼠15只，6-8周龄，体重平均20g，10％(w/w)水合氯醛(1ml/100g)腹腔注射，麻醉妥后，复方托吡卡胺滴眼液充分散瞳，裂隙灯、octa以及oct检查，记录。固定小鼠，尾部75％酒精充分消毒。25mg/ml孟加拉玫瑰溶液(0.5ml/100g)室温静置10分钟后行鼠尾静脉注射，注射完毕再次酒精消毒，防止感染。盐酸奥布卡因滴眼液行表面麻醉。注射孟加拉玫瑰红溶液30-60秒后，即可开始激光照射。

步骤3:577nm激光照射视网膜静脉

15只小鼠随机分成a、b、c三组，每组5只。三组小鼠均取右眼作为模型建立眼，左眼为对照眼。分别命名为a、b、c组小鼠。在裂隙灯显微镜下可清晰观察到小鼠视网膜血管，管径较大鼠血管细。遵循低能量、小光斑、长曝光时间，重复激光照射的原则，设置激光参数：光斑直径50μm，曝光时间0.3秒，激光能量为60mw。在距离视盘1-3pd范围内选择目标静脉。a组小鼠选择3支静脉，b组小鼠选择2支静脉，c组小鼠选择1支静脉。距离视盘由近及远重复激光照射静脉1-2pd长度，直至在裂隙灯显微镜下观察到远端静脉回流受阻，近端静脉缺血变细，形成视网膜静脉阻塞。术毕给予左氧氟沙星滴眼液点眼。

步骤4：观察模型动物视网膜水肿状况

裂隙灯显微镜下观察视网膜静脉阻塞后，立即行octa检查。激光术后每天裂隙灯观察术眼前节，使用oct技术观察视网膜厚度，直至视网膜水肿消退。在激光术前、术后1天、1周、2周和3周分别取小鼠眼球，包埋切片，he染色，观察视网膜结构变化。

步骤5：结果分析

每组小鼠阻塞血管数量不同，视网膜反应不同。oct检查结果显示视网膜水肿程度及维持时间：a组＞b组＞c组。

每组小鼠分别在激光术前、术后1天、1周、2周和3周取小鼠眼球，包埋切片，he染色，结果显示视网膜各层结构发生改变，尤以内丛状层、内核层变化明显。各组小鼠视网膜组织结构变化结果符合oct观察所得结果。以a组小鼠为例：术后1天视网膜内丛状层增厚、内核层细胞肿胀，术后2周仍可见视网膜内丛状层增厚、内核层细胞结构紊乱，术后3周视网膜内丛状层水肿消退，内核层轻度薄变(图8)

总结：实施例2中c57bl/6小鼠结果验证实施例1中bn大鼠结果。遵循低能量、小光斑、长曝光时间、重复激光照射的原则，应用577nm激光联合光敏剂孟加拉玫瑰红，阻塞2-3支视网膜静脉，水肿形成效果最佳，维持时间长达2周，对视网膜损害小，符合对视网膜水肿动物模型的要求。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。