本发明涉及遗传育种技术领域，具体为一种使马铃薯自交亲和的方法。
背景技术
马铃薯营养全面，是世界最重要的块茎类粮食作物，在解决全球粮食危机方面发挥着重要的作用。然而，两个结构性障碍一直制约着马铃薯产业的可持续发展：1)栽培马铃薯主要是同源四倍体，遗传分析非常复杂，导致育种周期长；2)四倍体马铃薯利用薯块进行无性繁殖，存在繁殖系数低(1:10)、用种成本高和易携带病虫害等缺点。在这种情况下，不同国家的科学家均呼吁在二倍体水平上进行马铃薯的再驯化，将马铃薯驯化成种子繁殖的作物。相较于四倍体，二倍体马铃薯的遗传比较简单，而且种子繁殖的系数比较高(1:5000)，储运方便，且基本不携带病虫害。其实，二倍体马铃薯在自然界是广泛存在的。最新的分类学研究将马铃薯分为4个栽培种和107个野生种，其中70％的种为二倍体。充分挖掘这些二倍体资源中的遗传变异，将极大推动马铃薯的遗传改良。
但是，绝大部分二倍体马铃薯都是自交不亲和的，严重限制了自交系的选育。二倍体马铃薯的自交不亲和属于配子体型自交不亲和，是由一个高多态性的s位点控制的。长期以来，科研人员一直在寻找能够自交亲和的二倍体马铃薯。1998年，日本科研人员hosaka报道了能够自交亲和的野生马铃薯品系solanumchacoensechc525-3，其含有一个抑制自交不亲和基因sli(s-locusinhibitor)，因此可以导致自交亲和。但是，sli基因来于野生马铃薯，将其导入到栽培种中经常会导致很多不良性状，如匍匐茎过长(大于1米)，有毒物质茄碱含量较高等。而且这些不良性状是由多基因控制的，在实际育种工作中很难将其淘汰。因此，本领域丞待解决的问题是如何能够克服二倍体马铃薯自交不亲和的难题。
技术实现要素：
为了解决上述二倍体马铃薯自交不亲和的技术问题，本发明提供了一种使马铃薯自交亲和的方法，该方法包括如下步骤：(1)筛选出马铃薯自交亲和材料，该材料记为pg6359，通过转录组测序方法克隆pg6359中的s-rnase基因；
(2)步骤(1)中克隆出的所述s-rnase基因得到两条s-rnase基因全长序列，分别记为ss11、ss12，ss11的基因序列如seqno.1所示,ss12的基因序列如seqno.2所示,将所述材料pg6359进行人工自交授粉后，选择子代中基因型为ss11ss11的材料作为母本，该母本记为材料a，一份自交不亲和的材料作为父本，该父本材料记为材料b，通过杂交获得f1代，将f1代进行基因型检测确定f1代个体里面含有ss11基因，将该f1代自花授粉后检测出f1个体是自交亲和的。
采用花期人工自花授粉对二倍体马铃薯资源进行筛选，最终获得的能够自交亲和的材料pg6359，因为自交不亲和是由s位点的s-rnase基因控制的，因此我们首先检测了pg6359的s-rnase基因是否发生突变。在不同马铃薯材料之间，s-rnase基因的多态性非常高，氨基酸相似性在32.9％－94.5％之间，通过同源克隆的方法很难获得s-rnase基因的全长序列。而且，s-rnase基因是在花柱中特异高表达的，因此我们通过转录组测序的方法成功克隆了pg6359中的s-rnase基因。所述s位点的s-rnase基因是指柱头里特异表达的核酸酶，能够降解相同s基因型花粉管里面的核糖体rna，从而抑制花粉管在柱头里面的延伸，导致自交不亲和。
进一步的，所述步骤(1)中转录组测序方法包括首先利用pg6359的花柱提取rna，并利用illuminahiseqxten平台进行了转录组测序，获得了2gb的测序数据；然后利用trinity软件对转录组数据进行了denovo拼接，并用rsem软件计算每个转录本的表达量；然后利用马铃薯参考基因组中已知的s-rnase蛋白序列进行blast，选择比对可靠性e值小于1e-5，表达量fpkm值大于200的序列作为s-rnase基因的候选序列；最后，根据比对结果，设计扩增引物，用于扩增pg6359中的s-rnase基因全长序列，并利用qpcr对表达量进行确认。
进一步的，所述步骤(2)中以f1单株为母本，以自交不亲和材料b为父本，进行回交；然后将获得bc1代材料进行基因型检测获得含有ss11基因的个体做母本，继续与自交不亲和材料b进行回交；经过多代回交之后，再进行一代自交，即可以获得遗传背景为b但是自交亲和的新材料。所述bc1代是指回交第一代。
采用本发明方法在pg6359中共获得了两条s-rnase全长序列。根据rsem计算，ss11的表达量为59.42，ss12的表达量为5214.98，相差100倍。利用qpcr进行验证，ss12的表达量是ss11的400倍。因为s-rnase基因具有核酸酶的活性，能够降解相同s基因型花粉里的核糖体rna，从而抑制花粉管的延伸。本发明发现的ss11的表达量比较低，可能无法发挥抑制花粉管延伸的作用。进而，我们对pg6359进行人工自交授粉，获得了大量的自交后代。最终发现自交后代单株的基因型有ss11ss12、ss11ss11，没有发现ss12ss12基因型。这说明由于柱头中的ss12基因正常表达，含有ss12的花粉管受到抑制无法延伸，而低表达的ss11基因无法拒绝含有ss11基因型的花粉，从而导致自交亲和。通过杂交可以将pg6359里面的ss11基因导入到其它自交不亲和的材料，将自交不亲和的材料变成自交亲和的材料。
进一步的，所述扩增引物上游引物序列如seqno.3所示，所述扩增引物下游引物序列如seqno.4所示。
本发明采用上述技术方案具有以下有益效果，能够克服二倍体马铃薯的自交不亲和，该发明无需引入任何野生马铃薯片段，因而避免了连锁累赘，为快速创制马铃薯自交系提供基础。
具体实施方式
实施例一：本发明公开的一种使马铃薯自交亲和的方法，包括如下步骤：
(1)通过对200多份二倍体马铃薯进行花期人工自花授粉，筛选出1份自交亲和的材料，该材料记为pg6359，通过转录组测序方法克隆pg6359中的s-rnase基因；
(2)步骤(1)中克隆出的所述s-rnase基因得到两条s-rnase基因全长序列，分别记为ss11、ss12，ss11的基因序列如seqidno.1所示,ss12的基因序列如seqidno.2所示,将所述材料pg6359进行人工自交授粉后，选择子代中基因型为ss11ss11的材料作为母本，该母本记为材料a，一份自交不亲和的材料作为父本，该父本材料记为材料b，通过杂交获得f1代，将f1代进行基因型检测确定f1代个体里面含有ss11基因，将该f1代自花授粉后确定所有f1个体是自交亲和的。
我们在pg6359中共获得了两条s-rnase全长序列。根据rsem计算，ss11的表达量为59.42，ss12的表达量为5214.98，相差100倍。利用qpcr进行验证，ss12的表达量是ss11的400倍。因为s-rnase基因具有核酸酶的活性，能够降解相同s基因型花粉里的核糖体rna，从而抑制花粉管的延伸。本发明发现的ss11的表达量比较低，可能无法发挥抑制花粉管延伸的作用。为了验证该假设，我们对pg6359进行人工自交授粉，获得了大量的自交后代。对201个自交后代进行s基因型检测发现，105个单株的基因型为ss11ss12，96个单株的基因型为ss11ss11，没有发现ss12ss12基因型。这说明由于柱头中的ss12基因正常表达，含有ss12的花粉管受到抑制无法延伸，而低表达的ss11基因无法拒绝含有ss11基因型的花粉，从而导致自交亲和。因为pg6359所有的后代中均含有表达量较低的ss11基因，理论上都应该是自交亲和的。通过对后代进行自花授粉后发现，除个别材料由于没开花或者花粉活力不好以外，其余材料都是自交亲和的。
本实施例中无特殊说明的操作手法均为现有技术，故不在此过多解释。
实施例二：本发明公开的一种使马铃薯自交亲和的方法，包括如下步骤：
(1)筛选出马铃薯自交亲和材料，该材料记为pg6359，通过转录组测序方法克隆pg6359中的s-rnase基因；
(2)步骤(1)中克隆出的所述s-rnase基因得到两条s-rnase基因全长序列，分别记为ss11、ss12，ss11的基因序列如seqidno.1所示,ss12的基因序列如seqidno.2所示,将所述材料pg6359进行人工自交授粉后，选择子代中基因型为ss11ss11的材料作为母本，该母本记为材料a，一份自交不亲和的材料作为父本，该父本材料记为材料b，通过杂交获得f1代，将f1代进行基因型检测确定f1代个体里面含有ss11基因，将该f1代自花授粉后检测出f1个体是自交亲和的。
具体地，所述步骤(1)中转录组测序方法包括首先利用pg6359的花柱提取rna，并利用illuminahiseqxten平台进行了转录组测序，获得了2gb的测序数据；然后利用trinity软件对转录组数据进行了denovo拼接，并用rsem软件计算每个转录本的表达量；然后利用马铃薯参考基因组中已知的s-rnase蛋白序列进行blast，选择比对可靠性e值小于1e-5，表达量fpkm值大于200的序列作为s-rnase基因的候选序列；设计扩增引物，用于扩增pg6359中的s-rnase基因全长序列，并利用qpcr对表达量进行确认。
进一步的，所述步骤(2)中以f1单株为母本，以自交不亲和材料b为父本，进行回交；然后将获得bc1代材料进行基因型检测获得含有ss11基因的个体做母本，继续与自交不亲和材料b进行回交；经过多代回交之后，再进行一代自交，即可以获得遗传背景为b但是自交亲和的新材料。
本发明在pg6359中共获得了两条s-rnase全长序列。根据rsem计算，ss11的表达量为58.42，ss12的表达量为5814.98，相差100倍。利用qpcr进行验证，ss12的表达量是ss11的400倍。这里要说明的是ss11、ss12的表达量数据是平行多次得到的，采用rsem计算、qpcr进行验证可以准确地确定出ss11的表达量确实为低水平，又由于而低表达的ss11基因无法拒绝含有ss11基因型的花粉，从而导致自交亲和。
进一步的，所述扩增引物上游引物序列如seqno.3所示，该基因序列中从左至右为5’端到3’端，所述扩增引物下游引物序列如seqno.4所示，该基因序列中从左至右为5’端到3’端。所筛选出来的扩增引物特异性强，能够很好的、完整的将s-rnase基因全长序列扩增出来。
本实施例中无特殊说明的操作手法均为现有技术，故不在此过多解释。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>中国农业科学院农业基因组研究所
<120>一种使马铃薯自交亲和的方法
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>645
<212>dna
<213>s-rnase基因中ss11的基因序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)
<400>1
atgtttagagctcaccttacgttaggtttcttcattctgctttgtgttttttctcacgtt60
catgggacttttgaccaattgcaactggttttaagatggcctacatccttttgcattggg120
aaaaattgcgagagaactccaaaaaactttacaatccatgggctttggccggatagcgtg180
ggtggagaactgaattactgtgatggcaaagctaagtatactagggtcaaggatgaagca240
tttgataagaggaataagcactggcctgacttgttactaagcgatgctgataatctgaaa300
aaccaaggtttctgggtacatgaatacagaaagcatggatcgtgttgtaaaaatctcttc360
aatgaaaaacaatactttgatttagcattggttttaaaagacaggtttgatcttctgacg420
actttcagaaatcacggaattgttcctgaatcatctcatactgttcataaaattgaaaaa480
actattaggtcagttactggggttcttcctaatctctcttgcactaaaaatatggatctt540
ttggagatagggatatgtttcaaccgagacgcaagtaatatgattgattgtccaaggcct600
aagacgtgcagccctggcgaaaataatctgattgcatttccatga645
<210>2
<211>645
<212>dna
<213>s-rnase基因中ss22的基因序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)
<400>2
atgtttaaaccacaagtcacatcagcactcttcattgtactttttctttctcccacttat60
gggaatttcgatcaattgcaactggtattgacatggccagcatcattttgccacgccaat120
aattgtaagcggatagctccaaaaaactttacgattcacgggctttggccggataaagag180
ggaacactgctgcagaactgcaagccattacctacgtatatacatttcgcggataagatg240
ctcaatgatcttgacaaaaactggattcaattgaagtatccagaacgttttgctcgaaag300
gaacaacctttatggctatatcaatatctaaagcatggatcctgttgtcagaaagtttac360
gatcaaaacacgtattttagtctagctttgcgcttaaaagacaggtttgatcttctgaga420
actctccaattacatcgaattgttcctggatcaagttatacatttaaagaaatctttgat480
gccgtcaagacagttagtcaaacagatcctgacgtcaagtgtacaaaaggagcacaggaa540
ctatatgagataggcatatgtttcaccccaaatgcagatagtctgattccttgtcgtcaa600
agtgaaacatgtgacaaatcgaaagaaatcttttttcgtagatga645
<210>3
<211>22
<212>dna
<213>扩增pg6359中的s-rnase基因全长序列的上游引物(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)
<400>3
ggaagaaaggaaatgaagtgag22
<210>4
<211>20
<212>dna
<213>扩增pg6359中的s-rnase基因全长序列的下游引物(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)
<400>4
aattacagcaaggggagggg20