本发明属于菌种保存技术领域，具体涉及一种长期保存高虫草素蛹虫草菌种的方法。
背景技术
蛹虫草又名北虫草、北冬虫夏草等，属于子囊菌门、肉座菌目、虫草菌科、虫草属真菌，是一种食药用虫草。蛹虫草富含虫草素、虫草酸及喷司他丁等具有抗癌、抗菌、抗疲劳及提高免疫等多种生物活性成分，其药用价值与冬虫夏草相似，有些成分甚至优于传统的冬虫夏草，因而已广泛作为冬虫夏草的替代品应用于药用及食用菌领域。随着人们对虫草产品的药用及保健等价值认识的不断深入，对蛹虫草资源及产品的需求也日益增加。
近年来，由于过度人工采挖，导致蛹虫草野生资源严重匮乏；而在人工规模化生产过程中，也经常出现因菌种遗传背景不清而引起菌种退化和变异严重等现象，造成子实体畸形、产量减少及品质下降等问题，制约着虫草产业的发展与升级。微生物菌种保藏主要是通过延缓菌种的新陈代谢等，避免继代培养过程中的菌种变异和污染，甚至死亡等问题的发生，保障菌种具有正常及稳定的生长特性及活力。
目前蛹虫草菌种保藏中存在的主要问题是：保藏周期较短(一般为3～6个月)，菌种活力低(随着保藏时间延长，子实体形成能力降低甚至无法形成子实体，易出现退化型菌株)。因此，很有必要开发出一种新的长期保存高虫草素蛹虫草菌种的方法，以延长菌种保藏周期，提高菌种活力。
技术实现要素：
本发明提供了一种长期保存高虫草素蛹虫草菌种的方法，解决了现有技术中蛹虫草菌种保藏周期较短，菌种活力低的问题。
本发明提供了一种长期保存高虫草素蛹虫草菌种的方法，包括以下步骤：
步骤1，培养基的制备
步骤1.1，按重量份称取以下各组分：青鲜素0.5～1份、龙舌兰提取物30～50份、羧甲基纤维素钠5～10份、三乙醇胺3～5份、水50～80份、pda培养基400～500份；
步骤1.2，将步骤1.1中称取的青鲜素溶于步骤1.1称取的三乙醇胺中，得到青鲜素的三乙醇胺溶液；
步骤1.3，将步骤1.1中称取的羧甲基纤维素钠溶于步骤1.1称取的水中，得到水凝胶；
步骤1.4，将步骤1.1中称取的龙舌兰提取物、pda培养基、步骤1.2中青鲜素的三乙醇胺溶液以及步骤1.3中的水凝胶混合均匀，得到蛹虫草菌种培养基；
将蛹虫草菌种培养基高温灭菌后趁热分装于试管内，凝固成蛹虫草菌种斜面培养基；
步骤2，菌种培养
在无菌条件下，将蛹虫草菌种接种到步骤1.4中得到的蛹虫草菌种斜面培养基上，先暗培养3～5d，然后进行光培养10～15d，培养结束得到蛹虫草菌种培养物；
步骤3，培养物脱水
在无菌条件下，将蛹虫草菌种培养物脱水至体积为原来的60～70％，得到脱水蛹虫草菌种培养物；
步骤4，菌种保存
往装有脱水蛹虫草菌种培养物的试管中注入灭菌好的石蜡油，使石蜡油淹没脱水蛹虫草菌种培养物1cm以上，再用灭菌好的石蜡封口后置于于4℃下保存。
优选的，所述龙舌兰提取物的制备方法如下：
取干燥的龙舌兰研磨成粉，然后往龙舌兰粉中加入相当于龙舌兰粉重量10倍的乙醇溶液，于50℃下超声提取60min，提取完毕后过滤，收集滤液，将滤液浓缩至相对密度为1.2～1.3，即得到所述龙舌兰提取物。
优选的，每升所述pda培养基由以下组分组成：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g，余量为水。
优选的，所述步骤2中，暗培养的培养温度为23～25℃。
优选的，所述步骤2中，光培养的培养温度为23～25℃，光照强度为100～200lux。
优选的，所述步骤3中，蛹虫草菌种培养物在-35～-20℃的无菌冷冻干燥机中脱水至体积为原来的50～60％。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明配制专用培养基用于蛹虫草菌种的培养、保存，培养基中的青鲜素、龙舌兰提取物配合使用可以抑制蛹虫草菌种的生长，从而延长其保存寿命，羧甲基纤维素钠能够很好的保水，使保存的蛹虫草菌种长期处于最佳状态，提高了菌种活性，同时也使蛹虫草菌种中虫草素含量基本不受影响，菌种保藏完毕后取出，可以迅速长出正常的菌丝体，进一步延长了保存期。
本发明操作简单、成本低，能够很好的保存蛹虫草菌种，经过本发明方法保存的蛹虫草菌种，保存期能达到4年以上，远远高于常规方法。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。
下述各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可在市场上购买得到。
实施例1
一种长期保存高虫草素蛹虫草菌种的方法，包括以下步骤：
步骤1，培养基的制备
步骤1.1，按重量份称取以下各组分：青鲜素0.5份、龙舌兰提取物50份、羧甲基纤维素钠10份、三乙醇胺5份、水80份、pda培养基400份；
步骤1.2，将步骤1.1中称取的青鲜素溶于步骤1.1称取的三乙醇胺中，得到青鲜素的三乙醇胺溶液；
步骤1.3，将步骤1.1中称取的羧甲基纤维素钠溶于步骤1.1称取的水中，得到水凝胶；
步骤1.4，将步骤1.1中称取的龙舌兰提取物、pda培养基、步骤1.2中青鲜素的三乙醇胺溶液以及步骤1.3中的水凝胶混合均匀，得到蛹虫草菌种培养基；
将蛹虫草菌种培养基高温灭菌后趁热分装于试管内，凝固成蛹虫草菌种斜面培养基；
步骤2，菌种培养
在无菌条件下，将虫草素含量为1.12g/100g的蛹虫草菌种接种到步骤1.4中得到的蛹虫草菌种斜面培养基上，先在23～25℃下暗培养3d，然后在23～25℃、光照强度为200lux的条件下光培养15d，培养结束得到蛹虫草菌种培养物；
步骤3，培养物脱水
在无菌条件下，将蛹虫草菌种培养物在-20℃的无菌冷冻干燥机中脱水至体积为原来的60％，得到脱水蛹虫草菌种培养物；
步骤4，菌种保存
往装有脱水蛹虫草菌种培养物的试管中注入灭菌好的石蜡油，使石蜡油淹没脱水蛹虫草菌种培养物1cm以上，再用灭菌好的石蜡封口后置于于4℃下保存，保存时间为4年，保存完毕后，检测到蛹虫草菌种中虫草素的含量为1.08g/100g，与保存前相比，基本没有变化；
保存4年后，将步骤4保存的脱水蛹虫草菌种培养物取出，无菌条件下移植到pda培养基上，2天后即可萌发长出正常的菌丝体。
实施例2
一种长期保存高虫草素蛹虫草菌种的方法，包括以下步骤：
步骤1，培养基的制备
步骤1.1，按重量份称取以下各组分：青鲜素0.8份、龙舌兰提取物40份、羧甲基纤维素钠8份、三乙醇胺4份、水60份、pda培养基450份；
步骤1.2，将步骤1.1中称取的青鲜素溶于步骤1.1称取的三乙醇胺中，得到青鲜素的三乙醇胺溶液；
步骤1.3，将步骤1.1中称取的羧甲基纤维素钠溶于步骤1.1称取的水中，得到水凝胶；
步骤1.4，将步骤1.1中称取的龙舌兰提取物、pda培养基、步骤1.2中青鲜素的三乙醇胺溶液以及步骤1.3中的水凝胶混合均匀，得到蛹虫草菌种培养基；
将蛹虫草菌种培养基高温灭菌后趁热分装于试管内，凝固成蛹虫草菌种斜面培养基；
步骤2，菌种培养
在无菌条件下，将虫草素含量为1.26g/100g的蛹虫草菌种接种到步骤1.4中得到的蛹虫草菌种斜面培养基上，先在23～25℃下暗培养5d，然后在23～25℃、光照强度为150lux的条件下光培养10d，培养结束得到蛹虫草菌种培养物；
步骤3，培养物脱水
在无菌条件下，将蛹虫草菌种培养物在-25℃的无菌冷冻干燥机中脱水至体积为原来的55％，得到脱水蛹虫草菌种培养物；
步骤4，菌种保存
往装有脱水蛹虫草菌种培养物的试管中注入灭菌好的石蜡油，使石蜡油淹没脱水蛹虫草菌种培养物1cm以上，再用灭菌好的石蜡封口后置于于4℃下保存，保存时间为4.5年；保存完毕后，检测到蛹虫草菌种中虫草素的含量为1.28g/100g，与保存前相比，基本没有变化；
保存4.5年后，将步骤4保存的脱水蛹虫草菌种培养物取出，无菌条件下移植到pda培养基上，2天后即可萌发长出正常的菌丝体。
实施例3
一种长期保存高虫草素蛹虫草菌种的方法，包括以下步骤：
步骤1，培养基的制备
步骤1.1，按重量份称取以下各组分：青鲜素1份、龙舌兰提取物30份、羧甲基纤维素钠5份、三乙醇胺3份、水50份、pda培养基500份；
步骤1.2，将步骤1.1中称取的青鲜素溶于步骤1.1称取的三乙醇胺中，得到青鲜素的三乙醇胺溶液；
步骤1.3，将步骤1.1中称取的羧甲基纤维素钠溶于步骤1.1称取的水中，得到水凝胶；
步骤1.4，将步骤1.1中称取的龙舌兰提取物、pda培养基、步骤1.2中青鲜素的三乙醇胺溶液以及步骤1.3中的水凝胶混合均匀，得到蛹虫草菌种培养基；
将蛹虫草菌种培养基高温灭菌后趁热分装于试管内，凝固成蛹虫草菌种斜面培养基；
步骤2，菌种培养
在无菌条件下，将虫草素含量为1.15g/100g的蛹虫草菌种接种到步骤1.4中得到的蛹虫草菌种斜面培养基上，先在23～25℃下暗培养4d，然后在23～25℃、光照强度为100lux的条件下光培养12d，培养结束得到蛹虫草菌种培养物；
步骤3，培养物脱水
在无菌条件下，将蛹虫草菌种培养物在-35℃的无菌冷冻干燥机中脱水至体积为原来的50％，得到脱水蛹虫草菌种培养物；
步骤4，菌种保存
往装有脱水蛹虫草菌种培养物的试管中注入灭菌好的石蜡油，使石蜡油淹没脱水蛹虫草菌种培养物1cm以上，再用灭菌好的石蜡封口后置于于4℃下保存，保存时间为4年；保存完毕后，检测到蛹虫草菌种中虫草素的含量为1.18g/100g，与保存前相比，基本没有变化；
保存4年后，将步骤4保存的脱水蛹虫草菌种培养物取出，无菌条件下移植到pda培养基上，2天后即可萌发长出正常的菌丝体。
需要说明的是，龙舌兰提取物的制备方法如下：
取干燥的龙舌兰研磨成粉，然后往龙舌兰粉中加入相当于龙舌兰粉重量10倍的乙醇溶液，于50℃下超声提取60min，提取完毕后过滤，收集滤液，将滤液浓缩至相对密度为1.2～1.3，即得到所述龙舌兰提取物。
进一步需要说明的是，每升pda培养基由以下组分组成：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g，余量为水。
为了进一步说明效果，本发明还设置了对比例，具体如下。
对比例1
一种长期保存高虫草素蛹虫草菌种的方法，包括以下步骤：
步骤1，菌种培养
在无菌条件下，将蛹虫草菌种接种到pda斜面培养基上，先在23～25℃下暗培养3d，然后在23～25℃、光照强度为200lux的条件下光培养15d，培养结束得到蛹虫草菌种培养物；
步骤2，培养物脱水
在无菌条件下，将虫草素含量为1.12g/100g的蛹虫草菌种培养物在-20℃的无菌冷冻干燥机中脱水至体积为原来的60％，得到脱水蛹虫草菌种培养物；
步骤3，菌种保存
往装有脱水蛹虫草菌种培养物的试管中注入灭菌好的石蜡油，使石蜡油淹没脱水蛹虫草菌种培养物1cm以上，再用灭菌好的石蜡封口后置于于4℃下保存，保存时间为2.5年；保存完毕后，检测到蛹虫草菌种中虫草素的含量为0.96g/100g，与保存前相比，变化不大；
保存2.5年后，将步骤4保存的脱水蛹虫草菌种培养物取出，无菌条件下移植到pda培养基上，5天后才可萌发长出正常的菌丝体。
对比例2
一种长期保存高虫草素蛹虫草菌种的方法，包括以下步骤：
步骤1，培养基的制备
步骤1.1，按重量份称取以下各组分：羧甲基纤维素钠10份、水80份、pda培养基400份；
步骤1.2，将步骤1.1中称取的羧甲基纤维素钠溶于步骤1.1称取的水中，得到水凝胶；
步骤1.3，将步骤1.1中称取的pda培养基与步骤1.2中的水凝胶混合均匀，得到蛹虫草菌种培养基；
将蛹虫草菌种培养基高温灭菌后趁热分装于试管内，凝固成蛹虫草菌种斜面培养基；
步骤2，菌种培养
在无菌条件下，将蛹虫草菌种接种到步骤1.3中得到的蛹虫草菌种斜面培养基上，先在23～25℃下暗培养3d，然后在23～25℃、光照强度为200lux的条件下光培养15d，培养结束得到蛹虫草菌种培养物；
步骤3，培养物脱水
在无菌条件下，将虫草素含量为1.12g/100g的蛹虫草菌种培养物在-20℃的无菌冷冻干燥机中脱水至体积为原来的60％，得到脱水蛹虫草菌种培养物；
步骤4，菌种保存
往装有脱水蛹虫草菌种培养物的试管中注入灭菌好的石蜡油，使石蜡油淹没脱水蛹虫草菌种培养物1cm以上，再用灭菌好的石蜡封口后置于于4℃下保存，保存时间为2.8年；保存完毕后，检测到蛹虫草菌种中虫草素的含量为1.01g/100g，与保存前相比，基本没有变化；
保存2.8年后，将步骤4保存的脱水蛹虫草菌种培养物取出，无菌条件下移植到pda培养基上，5天后才可萌发长出正常的菌丝体。
对比例3
一种长期保存高虫草素蛹虫草菌种的方法，包括以下步骤：
步骤1，培养基的制备
步骤1.1，按重量份称取以下各组分：青鲜素0.5份、龙舌兰提取物50份、三乙醇胺5份、pda培养基400份；
步骤1.2，将步骤1.1中称取的青鲜素溶于步骤1.1称取的三乙醇胺中，得到青鲜素的三乙醇胺溶液；
步骤1.3，将步骤1.1中称取的龙舌兰提取物、pda培养基以及步骤1.2中青鲜素的三乙醇胺溶液混合均匀，得到蛹虫草菌种培养基；
将蛹虫草菌种培养基高温灭菌后趁热分装于试管内，凝固成蛹虫草菌种斜面培养基；
步骤2，菌种培养
在无菌条件下，将蛹虫草菌种接种到步骤1.3中得到的蛹虫草菌种斜面培养基上，先在23～25℃下暗培养3d，然后在23～25℃、光照强度为200lux的条件下光培养15d，培养结束得到蛹虫草菌种培养物；
步骤3，培养物脱水
在无菌条件下，将虫草素含量为1.12g/100g的蛹虫草菌种培养物在-20℃的无菌冷冻干燥机中脱水至体积为原来的60％，得到脱水蛹虫草菌种培养物；
步骤4，菌种保存
往装有脱水蛹虫草菌种培养物的试管中注入灭菌好的石蜡油，使石蜡油淹没脱水蛹虫草菌种培养物1cm以上，再用灭菌好的石蜡封口后置于于4℃下保存，保存时间为3.5年；保存完毕后，检测到蛹虫草菌种中虫草素的含量为1.13g/100g，与保存前相比，基本没有变化；
保存2.5年后，将步骤4保存的脱水蛹虫草菌种培养物取出，无菌条件下移植到pda培养基上，4天后才可萌发长出正常的菌丝体。
从实施例1～3和对比例1～3的对比数据可知，实施例1～3中蛹虫草菌种均能保存4年以上，远远长于对比例1～3的，经分析，原因如下：
对比例1中采样常规pda培养基培养蛹虫草菌种，即培养基中不含任何抑制菌种生长的成分，因此，其保存时间只有2.5年。
对比例2中培养基与实施例1相比，配方中少了青鲜素和龙舌兰提取物，青鲜素是一种常规的生长抑制剂，能够很好的抑制植物生长，对抑制蛹虫草菌种生长的效果不显著，但是其和龙舌兰提取物配合使用时，能够很好的延缓蛹虫草菌种的生长，从而延长其保存期。
对比例3中培养基与实施例1相比，配方中少了羧甲基纤维素钠，羧甲基纤维素钠是一种性能优越的保水剂，能够使保存的蛹虫草菌种长时间的处于最佳状态，避免失水速度过快而变质。
综上可知，本发明配制的专用培养基用于蛹虫草菌种的培养、保存，培养基中的青鲜素、龙舌兰提取物配合使用可以抑制蛹虫草菌种的生长，从而延长其保存寿命，羧甲基纤维素钠能够很好的保水，使保存的蛹虫草菌种长期处于最佳状态，提高了菌种活性，菌种保藏完毕后取出，可以迅速长出正常的菌丝体，进一步延长了保存期。
需要说明的是，本发明说明书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与实施例1～3相同，为了防止赘述，本发明的描述了优选的实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。