本发明涉及植株培育技术领域，尤其是涉及川贝母多倍体脱毒苗的培养方法。
背景技术
川贝母为百合科草本植物，主要分布在四川、云南、甘肃、贵州等地，在治疗咳嗽、平喘、化痰等方面具有非常显著的效果。现代研究表明，总生物碱是其主要有效成分，《中国药典》(2010版)中收载的6种不同基源种的川贝母所含生物碱成分主要为贝母素甲、贝母素乙、贝母辛和西贝母碱。随着市场对川贝母的需求日益增长，野生川贝母被滥采滥挖导致资源匮乏，加之环境污染严重，且川贝母生长周期过长，目前川贝母已远远不能满足市场对其的需求。因此如何有效解决川贝母资源短缺的问题已变得十分迫切。川贝母植物的繁殖常采用以种子进行的有性生殖和以鳞茎进行的无性繁殖两种方式。但不论是采用种子还是鳞茎进行的繁殖，对于多年生的川贝母植物都会因各种环境因素而染上病毒，而植物一旦被侵染病毒后，就会产生畸形，并会严重抑制其生长，从而最终造成川贝母药材的品质和产量大大地下降。更为严重的是所感染的病毒不仅可在植物器官中长期生存，还可随植物的器官一代代传递下去，从而使感染了病毒的植物品种会出现明显地退化，甚至因感染严重而濒临灭绝。多倍体植物具有植物器官“巨大化”特点，同时多倍体植物因基因数目增多和基因活性及酶的差异性增强，因此其生态适应性和对逆境的抗耐性较高。将川贝母植物的脱毒苗培育技术和多倍体诱导技术进行有机结合，能培育出品质优良、生长速度快、有效组分含量高和抗逆性强的川贝母多倍体脱毒苗。
现有技术如授权公告号为cn103598100b的中国发明专利，公开了一种川贝母多倍体脱毒苗的培养方法，该方法选用经预处理后的不定根的生长点区域细胞诱导出多倍体愈伤组织，再将多倍体愈伤组织经鳞茎芽的诱导培养、鳞茎芽的生根培养及炼苗与移栽步骤来获得川贝母多倍体脱毒苗，创新性的建立了一整套川贝母多倍体脱毒苗的培养方法；该方法脱毒效果好、培养成本低，为川贝母优良品种的快速培育提供了一条新途径。但是该羊栖菜多糖的纯度均较低，色泽较差。但是该培养方法用诱导培养基对川贝母组织的渗透作用稍弱，使得多倍体的诱导率不太理想。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种能够培育出品质优良、生长速度快、有效组分含量高和抗逆性强的川贝母多倍体脱毒苗，成本低、诱导速率和诱导率高、培育周期短，得到质量较高的川贝母多倍体脱毒苗的川贝母多倍体脱毒苗的培养方法。
本发明针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：
川贝母多倍体脱毒苗的培养方法，包括愈伤组织的诱导、多倍体的诱导和培养、脱毒处理、多倍体脱毒愈伤组织的培养、鳞茎芽的诱导、多倍体鳞茎芽的生根培养、炼苗和移栽，其具体步骤为：
愈伤组织的诱导：将川贝母无菌鳞茎切成0.7-1.0cm见方的小块，接种到含1.5-2.5mg/l6-苄氨基腺嘌呤、0.2-0.4mg/l萘乙酸、25-35g/l蔗糖的ms愈伤组织诱导培养基中，在温度为20-25℃、光照强度为800-1200lux、光照时间为10-15h/d的条件下培养28-32d，备用，培养基中外源激素的加入能提高愈伤组织的诱导率高，可获得大量的川贝母愈伤组织，具有环境容易控制、重复性强、工作效率高、诱导率高的优势；
多倍体的诱导和培养：在超净工作台上，将川贝母愈伤组织切成0.7-1.0cm见方的小块，放入含有20-25g/l甘露醇、0.05-0.1mg/l吲哚丁酸、0.05-0.1mg/l细胞分裂素、0.05-0.1g/l秋水仙素、25-35g/l蔗糖、5-10g/l琼脂的ms诱导培养基中，在15-25℃下浸泡45-50h，然后用无菌水冲洗2-4次，再转入不含甘露醇和秋水仙素的ms诱导培养基中，在温度为20-25℃、光照强度为800-1200lux、光照时间为5-7h/d的条件下培养至川贝母鳞茎的基部有形状粗大的不定根产生，备用，上述ms诱导培养基在秋水仙素的含量低特别低的条件下也能特异性的与植物细胞中的微管蛋白结合，使纺锤丝合成受阻，导致复制后的染色体无法被拉向两级，干扰了正常的细胞分裂过程使染色体都留在同一细胞核中，形成染色体加倍的细胞，最终形成非嵌合体多倍体不定根，大大降低秋水仙素的用量和秋水仙素对愈伤组织的毒害，提高不定根数量的同时也能降低培养成本，此外该培养基对愈伤组织的渗透性强，增大了秋水仙素分子与微管蛋白二聚体结合的机会，使得多倍体的诱导率高，可达到95%以上；
脱毒处理：将不定根从根基部切下后接入含0.3-0.5mg/l6-苄氨基腺嘌呤、0.08-0.12l/l甘油的ms培养基中，在温度为35-40℃、无光照的条件下脱毒处理18-22d，即得多倍体脱毒不定根，该步骤采用高温作为多倍体川贝母脱毒的处理方法，脱毒的效果好；
多倍体脱毒愈伤组织的培养：在超净工作台上切取根尖生长点处0.3-0.5mm区域的细胞，将其接入ph值为5.5-6.0的愈伤组织诱导培养基中，在温度为20-25℃、光照强度为800-1200lux、光照时间为5-7h/d的条件下培养20-25d，即得多倍体脱毒愈伤组织，该步骤采用高温作为多倍体川贝母脱毒的前期处理方法，脱毒的效果好，并且其愈伤组织也较易形成，同时培养基中外源激素的加入能提高愈伤组织的诱导率高，具有环境容易控制、重复性强、工作效率高、诱导率高、所得愈伤组织的数量多的优势；
鳞茎芽的诱导：将病毒检测合格的多倍体愈伤组织接入添加2-4mg/l6-苄氨基腺嘌呤、0.15-0.25mg/l吲哚乙酸的多倍体鳞茎芽诱导ms培养基中，在温度为20-25℃、光照强度为800-1200lux、光照时间为15-17h/d的条件下培养20-25d，即得川贝母多倍体鳞茎芽，该步骤中多倍体鳞茎芽诱导ms培养基能使细胞分裂加快，促进对愈伤组织的诱导，使得芽增殖快且生长效果佳；
多倍体鳞茎芽的生根培养：在超净台上切取生长1.8-2.5cm的多倍体鳞茎芽作为无根苗，将其转入含萘乙酸、吲哚丁酸、光甾醇、蔗糖、氨基葡萄糖和琼脂的1/2ms生根培养基中诱导生根培养25-28d，即得川贝母多倍体脱毒苗，该步骤用培养基中光甾醇和氨基葡萄糖的特殊存在能够增大培养基中各有效成分间的增益作用，为多倍体鳞茎芽的生长和增殖提供充足的营养成分，保证细胞分裂的顺利进行，提高川贝母多倍体脱毒苗的发育质量和稳定性，同时光甾醇和氨基葡萄糖更易于进入细胞内部而被多倍体鳞茎芽吸收利用，先为多倍体鳞茎芽提供充足的碳氮而进行光合作用，提高多倍体鳞茎芽的生长速度和增殖倍数，缩短生根培养需要的时间，得到质量较高的川贝母多倍体脱毒苗；该步骤能够诱导鳞茎芽产生不定根，然后促进不定根的细胞分裂及伸长，使得长出的根生长状况良好，提高了移栽苗的生根率及苗移栽之后的存活率；
炼苗和移栽：选取长出两条以上不定根的川贝母多倍体脱毒苗，在室内炼苗3-5d后从培养瓶中取出，洗去不定根上的培养基，移栽至消毒后的松软土壤中生长，川贝母多倍体脱毒苗的存活率为90%以上，该培养方法将川贝母植物的脱毒苗培育技术与多倍体诱导技术进行有机结合，能够培育出品质优良、生长速度快、有效组分含量高和抗逆性强的川贝母多倍体脱毒苗，缩短了川贝母的生长周期，大大提高了川贝母的生产质量，且培养得到的川贝母中生物碱的含量高。
作为优选，多倍体的诱导和培养步骤用甘露醇中含有6.4-7.8%的l-甘露醇。该特殊甘露醇的使用一方面可维持薄壁细胞的稳定，避免破裂，且促进薄壁细胞再生细胞壁并继续分裂，能够保证薄壁细胞的成活率，提高诱导成功率和所得多倍体愈伤组织的数量，另一方面还能引起基因组的核苷酸碱基序列改变，形成可与引物杂交的新位点，使后续得到的多倍体脱毒苗在抗逆性及光合能力方面更优于其二倍体植株，且能提高ms诱导培养基对细胞的渗透性强，提高多倍体的诱导速率和诱导率。
作为优选，多倍体鳞茎芽的生根培养步骤用1/2ms生根培养基中含0.15-0.25mg/l萘乙酸、0.15-0.25mg/l吲哚丁酸、18-22mg/l光甾醇、10-20g/l蔗糖、23-29mg/l氨基葡萄糖和4-5g/l琼脂。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明培养方法将川贝母植物的脱毒苗培育技术与多倍体诱导技术进行有机结合，能够培育出品质优良、生长速度快、有效组分含量高和抗逆性强的川贝母多倍体脱毒苗，缩短了川贝母的生长周期，大大提高了川贝母的生产质量，且培养得到的川贝母中生物碱的含量高；本发明多倍体的诱导用诱导培养基中大大降低秋水仙素的用量和秋水仙素对愈伤组织的毒害，提高不定根数量的同时也能降低培养成本，此外该培养基对愈伤组织的渗透性强，增大了秋水仙素分子与微管蛋白二聚体结合的机会，使得多倍体的诱导率高，可达到95%以上；该多倍体的诱导用纯化培养基为多倍体鳞茎芽的生长和增殖提供充足的营养成分，提高川贝母多倍体脱毒苗的发育质量和稳定性，先为多倍体鳞茎芽提供充足的碳氮而进行光合作用，提高多倍体鳞茎芽的生长速度和增殖倍数，得到质量较高的川贝母多倍体脱毒苗。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
川贝母多倍体脱毒苗的培养方法，包括愈伤组织的诱导、多倍体的诱导和培养、脱毒处理、多倍体脱毒愈伤组织的培养、鳞茎芽的诱导、多倍体鳞茎芽的生根培养、炼苗和移栽，其具体步骤为：
1）愈伤组织的诱导：将川贝母无菌鳞茎切成1.0cm见方的小块，接种到含2.5mg/l6-苄氨基腺嘌呤、0.4mg/l萘乙酸、35g/l蔗糖的ms愈伤组织诱导培养基中，在温度为25℃、光照强度为1200lux、光照时间为15h/d的条件下培养32d，备用，培养基中外源激素的加入能提高愈伤组织的诱导率高，可获得大量的川贝母愈伤组织，具有环境容易控制、重复性强、工作效率高、诱导率高的优势；
2）多倍体的诱导和培养：在超净工作台上，将川贝母愈伤组织切成1.0cm见方的小块，放入含有25g/l甘露醇、0.1mg/l吲哚丁酸、0.1mg/l细胞分裂素、0.1g/l秋水仙素、35g/l蔗糖、10g/l琼脂的ms诱导培养基中，在25℃下浸泡50h，然后用无菌水冲洗4次，再转入不含甘露醇和秋水仙素的ms诱导培养基中，在温度为25℃、光照强度为1200lux、光照时间为7h/d的条件下培养至川贝母鳞茎的基部有形状粗大的不定根产生，备用，上述ms诱导培养基在秋水仙素的含量低特别低的条件下也能特异性的与植物细胞中的微管蛋白结合，使纺锤丝合成受阻，导致复制后的染色体无法被拉向两级，干扰了正常的细胞分裂过程使染色体都留在同一细胞核中，形成染色体加倍的细胞，最终形成非嵌合体多倍体不定根，大大降低秋水仙素的用量和秋水仙素对愈伤组织的毒害，提高不定根数量的同时也能降低培养成本，此外该培养基对愈伤组织的渗透性强，增大了秋水仙素分子与微管蛋白二聚体结合的机会，使得多倍体的诱导率高，可达到96.7%；
3）脱毒处理：将不定根从根基部切下后接入含0.5mg/l6-苄氨基腺嘌呤、0.12l/l甘油的ms培养基中，在温度为40℃、无光照的条件下脱毒处理22d，即得多倍体脱毒不定根，该步骤采用高温作为多倍体川贝母脱毒的处理方法，脱毒的效果好；
4）多倍体脱毒愈伤组织的培养：在超净工作台上切取根尖生长点处0.5mm区域的细胞，将其接入ph值为6.0的愈伤组织诱导培养基中，在温度为25℃、光照强度为1200lux、光照时间为7h/d的条件下培养25d，即得多倍体脱毒愈伤组织，该步骤采用高温作为多倍体川贝母脱毒的前期处理方法，脱毒的效果好，并且其愈伤组织也较易形成，同时培养基中外源激素的加入能提高愈伤组织的诱导率高，具有环境容易控制、重复性强、工作效率高、诱导率高、所得愈伤组织的数量多的优势；
5）鳞茎芽的诱导：将病毒检测合格的多倍体愈伤组织接入添加4mg/l6-苄氨基腺嘌呤、0.25mg/l吲哚乙酸的多倍体鳞茎芽诱导ms培养基中，在温度为25℃、光照强度为1200lux、光照时间为17h/d的条件下培养25d，即得川贝母多倍体鳞茎芽，该步骤中多倍体鳞茎芽诱导ms培养基能使细胞分裂加快，促进对愈伤组织的诱导，使得芽增殖快且生长效果佳；
6）多倍体鳞茎芽的生根培养：在超净台上切取生长2.5cm的多倍体鳞茎芽作为无根苗，将其转入含萘乙酸、吲哚丁酸、光甾醇、蔗糖、氨基葡萄糖和琼脂的1/2ms生根培养基中诱导生根培养28d，即得川贝母多倍体脱毒苗，该步骤用培养基中光甾醇和氨基葡萄糖的特殊存在能够增大培养基中各有效成分间的增益作用，为多倍体鳞茎芽的生长和增殖提供充足的营养成分，保证细胞分裂的顺利进行，提高川贝母多倍体脱毒苗的发育质量和稳定性，同时光甾醇和氨基葡萄糖更易于进入细胞内部而被多倍体鳞茎芽吸收利用，先为多倍体鳞茎芽提供充足的碳氮而进行光合作用，提高多倍体鳞茎芽的生长速度和增殖倍数，缩短生根培养需要的时间，得到质量较高的川贝母多倍体脱毒苗；该步骤能够诱导鳞茎芽产生不定根，然后促进不定根的细胞分裂及伸长，使得长出的根生长状况良好，提高了移栽苗的生根率及苗移栽之后的存活率；
7）炼苗和移栽：选取长出两条以上不定根的川贝母多倍体脱毒苗，在室内炼苗5d后从培养瓶中取出，洗去不定根上的培养基，移栽至消毒后的松软土壤中生长，川贝母多倍体脱毒苗的存活率为90.7%，该培养方法将川贝母植物的脱毒苗培育技术与多倍体诱导技术进行有机结合，能够培育出品质优良、生长速度快、有效组分含量高和抗逆性强的川贝母多倍体脱毒苗，缩短了川贝母的生长周期，大大提高了川贝母的生产质量，且培养得到的川贝母中生物碱的含量高。
多倍体的诱导和培养步骤用甘露醇中含有7.8%的l-甘露醇。该特殊甘露醇的使用一方面可维持薄壁细胞的稳定，避免破裂，且促进薄壁细胞再生细胞壁并继续分裂，能够保证薄壁细胞的成活率，提高诱导成功率和所得多倍体愈伤组织的数量，另一方面还能引起基因组的核苷酸碱基序列改变，形成可与引物杂交的新位点，使后续得到的多倍体脱毒苗在抗逆性及光合能力方面更优于其二倍体植株，且能提高ms诱导培养基对细胞的渗透性强，提高多倍体的诱导速率和诱导率。
多倍体鳞茎芽的生根培养步骤用1/2ms生根培养基中含0.25mg/l萘乙酸、0.25mg/l吲哚丁酸、22mg/l光甾醇、20g/l蔗糖、29mg/l氨基葡萄糖和5g/l琼脂。
实施例2：
川贝母多倍体脱毒苗的培养方法，其具体步骤为：
1）愈伤组织的诱导：将川贝母无菌鳞茎切成0.8cm见方的小块，接种到含2.0mg/l6-苄氨基腺嘌呤、0.3mg/l萘乙酸、30g/l蔗糖的ms愈伤组织诱导培养基中，在温度为22℃、光照强度为1000lux、光照时间为12h/d的条件下培养30d，备用；
2）多倍体的诱导和培养：在超净工作台上，将川贝母愈伤组织切成0.8cm见方的小块，放入含有22.5g/l甘露醇、0.08mg/l吲哚丁酸、0.08mg/l细胞分裂素、0.07g/l秋水仙素、30g/l蔗糖、8g/l琼脂的ms诱导培养基中，其中甘露醇中含有7.1%的l-甘露醇，在20℃下浸泡48h，然后用无菌水冲洗3次，再转入不含甘露醇和秋水仙素的ms诱导培养基中，在温度为22℃、光照强度为1000lux、光照时间为6h/d的条件下培养至川贝母鳞茎的基部有形状粗大的不定根产生，备用，多倍体的诱导率高可达到98.1%；
3）脱毒处理：将不定根从根基部切下后接入含0.4mg/l6-苄氨基腺嘌呤、0.1l/l甘油的ms培养基中，在温度为38℃、无光照的条件下脱毒处理20d，即得多倍体脱毒不定根；
4）多倍体脱毒愈伤组织的培养：在超净工作台上切取根尖生长点处0.4mm区域的细胞，将其接入ph值为5.8的愈伤组织诱导培养基中，在温度为22℃、光照强度为1000lux、光照时间为6h/d的条件下培养22d，即得多倍体脱毒愈伤组织；
5）鳞茎芽的诱导：将病毒检测合格的多倍体愈伤组织接入添加3mg/l6-苄氨基腺嘌呤、0.2mg/l吲哚乙酸的多倍体鳞茎芽诱导ms培养基中，在温度为22℃、光照强度为1000lux、光照时间为16h/d的条件下培养22d，即得川贝母多倍体鳞茎芽；
6）多倍体鳞茎芽的生根培养：在超净台上切取生长2.2cm的多倍体鳞茎芽作为无根苗，将其转入含0.2mg/l萘乙酸、0.2mg/l吲哚丁酸、20mg/l光甾醇、15g/l蔗糖、26mg/l氨基葡萄糖和4.5g/l琼脂的1/2ms生根培养基中诱导生根培养26d，即得川贝母多倍体脱毒苗；
7）炼苗和移栽：选取长出两条以上不定根的川贝母多倍体脱毒苗，在室内炼苗4d后从培养瓶中取出，洗去不定根上的培养基，移栽至消毒后的松软土壤中生长，川贝母多倍体脱毒苗的存活率为93.1%。
实施例3：
川贝母多倍体脱毒苗的培养方法，其具体步骤为：
1）愈伤组织的诱导：将川贝母无菌鳞茎切成0.7cm见方的小块，接种到含1.5mg/l6-苄氨基腺嘌呤、0.2mg/l萘乙酸、25g/l蔗糖的ms愈伤组织诱导培养基中，在温度为20℃、光照强度为800lux、光照时间为10h/d的条件下培养28d，备用；
2）多倍体的诱导和培养：在超净工作台上，将川贝母愈伤组织切成0.7cm见方的小块，放入含有20g/l甘露醇、0.05mg/l吲哚丁酸、0.05mg/l细胞分裂素、0.05g/l秋水仙素、25g/l蔗糖、5g/l琼脂的ms诱导培养基中，其中甘露醇中含有6.4%的l-甘露醇，在15℃下浸泡45h，然后用无菌水冲洗2次，再转入不含甘露醇和秋水仙素的ms诱导培养基中，在温度为20℃、光照强度为800lux、光照时间为5h/d的条件下培养至川贝母鳞茎的基部有形状粗大的不定根产生，备用，多倍体的诱导率高可达到97.7%；
3）脱毒处理：将不定根从根基部切下后接入含0.3mg/l6-苄氨基腺嘌呤、0.08l/l甘油的ms培养基中，在温度为35℃、无光照的条件下脱毒处理18d，即得多倍体脱毒不定根；
4）多倍体脱毒愈伤组织的培养：在超净工作台上切取根尖生长点处0.3mm区域的细胞，将其接入ph值为5.5的愈伤组织诱导培养基中，在温度为20℃、光照强度为800lux、光照时间为5h/d的条件下培养20d，即得多倍体脱毒愈伤组织；
5）鳞茎芽的诱导：将病毒检测合格的多倍体愈伤组织接入添加2mg/l6-苄氨基腺嘌呤、0.15mg/l吲哚乙酸的多倍体鳞茎芽诱导ms培养基中，在温度为20℃、光照强度为800lux、光照时间为15h/d的条件下培养20d，即得川贝母多倍体鳞茎芽；
6）多倍体鳞茎芽的生根培养：在超净台上切取生长1.8cm的多倍体鳞茎芽作为无根苗，将其转入含0.15mg/l萘乙酸、0.15mg/l吲哚丁酸、18mg/l光甾醇、10g/l蔗糖、23mg/l氨基葡萄糖和4g/l琼脂的1/2ms生根培养基中诱导生根培养25d，即得川贝母多倍体脱毒苗；
7）炼苗和移栽：选取长出两条以上不定根的川贝母多倍体脱毒苗，在室内炼苗3d后从培养瓶中取出，洗去不定根上的培养基，移栽至消毒后的松软土壤中生长，川贝母多倍体脱毒苗的存活率为92.0%。
对比例1：
多倍体的诱导和培养步骤中甘露醇中不含有l-甘露醇，其余部分和实施例2完全一致，多倍体的诱导率为90.8%。说明甘露醇中l-甘露醇的存在能够提高诱导成功率。
对比例2：
多倍体鳞茎芽的生根培养步骤用培养基中不含光甾醇、氨基葡萄糖，其余部分和实施例2完全一致。该对比例德大的川贝母多倍体脱毒苗的成活率为85.7%，远低于实施例2，这说明光甾醇和氨基葡萄糖的特殊存能得到质量较高的川贝母多倍体脱毒苗。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。