本发明涉及细胞领域，特别涉及细胞冻存组合物及其应用。
背景技术
细胞冻存是将细胞放在低温环境，减少细胞代谢，以便长期储存的一种技术。细胞冻存是细胞保存的主要方法之一，起到了细胞保种的作用。
利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。除此之外，还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。细胞冻存时向培养基中加入保护剂，可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。采用"慢冻快融"的方法能较好地保证细胞存活。标准冷冻速度开始为-1到-2℃/min，当温度低于-25℃时可加速，到-80℃之后可直接投入液氮内(-196℃)。
细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。
冻存保护剂是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质(常为溶液)。细胞悬液中加入冷冻保护剂可保护细胞免受溶液损伤和冰晶损伤。冷冻保护剂同溶液中的水分子结合，发生水合作用，弱化水的结晶过程使溶液的粘性增加从而减少冰晶的形成，同时冷冻保护剂可以通过在细胞内外维持一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质的损伤。
冷冻保护剂根据其是否穿透细胞膜可分为渗透性和非渗透性两类。渗透性冷冻保护剂：可以渗透到细胞内，一般是一些小分子物质，主要包括甘油、dmso、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等；非渗透性冷冻保护剂：不能渗透到细胞内，一般是写大分子物质，主要包括聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羟乙基淀粉等。
现有的技术多是使用dmso或者甘油等作为冻存的保护剂，但是复苏后细胞的存活率并不是很好，通常情况下，在50％左右。因此，提供一种复苏后细胞的存活率较高的细胞冻存液具有重要的现实意义。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供一种细胞冻存组合物及其应用。本发明提供的细胞冻存液使用抗冻蛋白、dmso、蔗糖、人白蛋白、葡萄糖和勃脉力a，可以显著的提高存活率，达到80％以上，这在干细胞、神经细胞等稀少细胞的保存上有很重要的意义，同时也降低了细胞复苏后细胞培养的成本，缩短了细胞培养的周期。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了抗冻蛋白在制备冻存液中的应用。
抗冻蛋白afps(antifreezeproteins)：一类具有提高生物抗冻能力的蛋白质类化合物的总称。现已发现五种，包括抗冻糖蛋白、抗冻蛋白ⅰ、抗冻蛋白ⅱ、抗冻蛋白ⅲ、抗冻蛋白ⅳ。
最初是从南极与北极地区的海洋鱼类血清中发现一种能与冰晶相结合的特异性蛋白质，它能阻止体液内冰核的形成与生长，维持体液的非冰冻状态。在这些地区生活的鱼类全都具有合成这类蛋白的能力，以适应低温的生活条件。研究最多的可能是生活在南极洋面的perchlikenotothenioids的体内抗冻蛋白，发现这一蛋白基因与鱼的胰蛋白酶原基因中90％以上的核苷酸碱基序列相同或许说明这两者有相近的进化关系。现在相继在昆虫、植物(如冬黑麦、沙冬青、唐古特红景天叶等)体内也发现有类似功能的抗冻蛋白。鱼类的afp基因的转化植物已获成功；与植物中类似afp基因在微生物体内克隆也获得成功。推测植物抗冻分子生物学和培植农业上抗冻新品种的前景必定是光明的。
抗冻蛋白吸附在冰晶表面，通过eafc3效应抑制其生长.机制的模型为:一般晶体的生长垂直于晶体的表面，假如杂质分子吸附于冰生长通途的表面，那么需要在外加一推动力(冰点下降)，促使冰在杂质间生长.由于曲率增大，使边缘的表面积也增加。因表面张力的影响，增加表面积将使体系的平衡状态发生改变，从而冰点降低。通过对抗冻植物抗冻活性的研究，认为抗冻植物形成了一种特殊的控制胞外冰晶形成的机制，即抗冻蛋白和冰核聚物质的协同作用。在植物体内，热滞效应并不明显，而冰重结晶抑制效应显著。
现有的商用zenoaq公司的细胞冻存液cellbanker，也可以提高细胞的存活率，但是与之相比的话，抗冻蛋白价格低廉，大规模使用时更加便宜。抗冻蛋白的来源很多，包括鱼类、昆虫、植物和细菌等。我们使用的是植物来源的抗冻蛋白，理论上，其他的来源的抗冻蛋白是可以替代我们的抗冻蛋白的。
在本发明的一些具体实施方案中，所述冻存液为细胞冻存液或微生物冻存液。
本发明还提供了细胞冻存组合物，包括抗冻蛋白、dmso、蔗糖、人白蛋白、葡萄糖和勃脉力a。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的细胞冻存组合物包括以下组分：
在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的细胞冻存组合物包括以下组分：
在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的细胞冻存组合物包括以下组分：
在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的细胞冻存组合物包括以下组分：
在本发明的一些具体实施方案中，缓冲液为pbs缓冲液；培养基为细胞基础培养基；所述细胞培养基包括rpmi1640、dmem、dmem/f12、a-mem或l-15。
具体的，pbs：1l配方ph7.4：磷酸二氢钾(kh2po4)：0.27g；
磷酸氢二钠(na2hpo4)：1.42g；
氯化钠(nacl)：8g；
氯化钾(kcl)0.2g；
加去离子水约800ml充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调ph至7.4，最后定容到1l。
本发明还提供了所述的细胞冻存组合物在细胞冻存中的应用。
在本发明的一些具体实施方案中，细胞在所述细胞冻存组合物中的最终密度为5×106/ml～1×107/ml。
在本发明的一些具体实施方案中，所述冻存为：当温度不低于-20℃时，降温速率为-2～-3℃/min；当温度低于-20℃时，降温速率为-10℃～-15℃/min；当温度为-100℃时，浸入液氮；或
置于-20℃冰箱2h，然后置于-70℃过夜后移入液氮保存。
本发明还提供了所述的细胞冻存组合物的使用方法，取细胞与所述的细胞冻存组合物混合后冻存，细胞在所述细胞冻存组合物中的最终密度为5×106/ml～1×107/ml。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的细胞冻存组合物的使用方法中所述冻存为：当温度不低于-20℃时，降温速率为-2～-3℃/min；当温度低于-20℃时，降温速率为-10℃～-15℃/min；当温度为-100℃时，浸入液氮；或
置于-20℃冰箱2h，然后置于-70℃过夜后移入液氮保存。
本发明还提供了一种细胞的冻存方法，取细胞与所述的细胞冻存组合物混合后冻存，细胞在所述细胞冻存组合物中的最终密度为5×106/ml～1×107/ml。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的细胞冻存组合物的冻存方法，所述冻存为：当温度不低于-20℃时，降温速率为-2～-3℃/min；当温度低于-20℃时，降温速率为-10℃～-15℃/min；当温度为-100℃时，浸入液氮；或
置于-20℃冰箱2h，然后置于-70℃过夜后移入液氮保存。
本发明在细胞冻存液中使用抗冻蛋白、dmso、蔗糖、人白蛋白、葡萄糖和勃脉力a，显著的提高了细胞的存活率，达到96％以上，这在干细胞、神经细胞等稀少细胞的保存上有很重要的意义，同时也降低了细胞复苏后细胞培养的成本，缩短了细胞培养的周期。
具体实施方式
本发明公开了一种细胞冻存组合物及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的细胞冻存组合物及其应用中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
(一)细胞冻存：
冻存液配方：
1.配制细胞冻存培养液，使用配方是dmem+20％fbs+10％dmso+50ug/ml抗冻蛋白(冬小麦植物提取)
2.取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用pbs清洗。
3.去除pbs，加入适量胰蛋白酶(覆盖培养皿表面)把单层生长的细胞消化下来；
4.离心1000rpm，5min；
5.去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；
6.将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5ml；
7.在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；
8.冻存：当温度不低于-20℃时，降温速率为-2℃/min；当温度低于-20℃时，降温速率为-10℃/min；当温度为-100℃时，浸入液氮；或
置于-20℃冰箱2h，然后置于-70℃过夜后移入液氮保存。
(二)细胞复苏
1.从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
2.从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；
3.离心，1000rpm，5min；
4.弃去上清液，加入含10％小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；
5.次日更换一次培养液，继续培养。
实施例2
(一)细胞冻存：
冻存液配方：
1.配制细胞冻存培养液，使用配方是dmem+20％fbs+10％dmso+50ug/ml抗冻蛋白(冬小麦植物提取)
2.取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用pbs清洗。
3.去除pbs，加入适量胰蛋白酶(覆盖培养皿表面)把单层生长的细胞消化下来；
4.离心1000rpm，5min；
5.去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；
6.将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5ml；
7.在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；
8.冻存：当温度不低于-20℃时，降温速率为-3℃/min；当温度低于-20℃时，降温速率为-15℃/min；当温度为-100℃时，浸入液氮；或置于-20℃冰箱2h，然后置于-70℃过夜后移入液氮保存。
(二)细胞复苏
1.从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
2.从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；
3.离心，1000rpm，5min；
4.弃去上清液，加入含10％小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；
5.次日更换一次培养液，继续培养。
实施例3
(一)细胞冻存：
冻存液配方：
1.配制细胞冻存培养液，使用配方是dmem+20％fbs+10％dmso+50ug/ml抗冻蛋白(冬小麦植物提取)
2.取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用pbs清洗。
3.去除pbs，加入适量胰蛋白酶(覆盖培养皿表面)把单层生长的细胞消化下来；
4.离心1000rpm，5min；
5.去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；
6.将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5ml；
7.在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；
8.冻存：当温度不低于-20℃时，降温速率为-3℃/min；当温度低于-20℃时，降温速率为-13℃/min；当温度为-100℃时，浸入液氮；或
置于-20℃冰箱2h，然后置于-70℃过夜后移入液氮保存。
(二)细胞复苏
1.从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
2.从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；
3.离心，1000rpm，5min；
4.弃去上清液，加入含10％小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；
5.次日更换一次培养液，继续培养。
实施例4
(一)细胞冻存：
冻存液配方：
1.配制细胞冻存培养液，使用配方是dmem+20％fbs+10％dmso+50ug/ml抗冻蛋白(冬小麦植物提取)
2.取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用pbs清洗。
3.去除pbs，加入适量胰蛋白酶(覆盖培养皿表面)把单层生长的细胞消化下来；
4.离心1000rpm，5min；
5.去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；
6.将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5ml；
7.在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；
8.冻存：当温度不低于-20℃时，降温速率为-2℃/min；当温度低于-20℃时，降温速率为-12℃/min；当温度为-100℃时，浸入液氮；或
置于-20℃冰箱2h，然后置于-70℃过夜后移入液氮保存。
(二)细胞复苏
1.从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
2.从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；
3.离心，1000rpm，5min；
4.弃去上清液，加入含10％小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；
5.次日更换一次培养液，继续培养。
实施例5
(一)细胞冻存：
冻存液配方：
1.配制细胞冻存培养液，使用配方是dmem+20％fbs+10％dmso+50ug/ml抗冻蛋白(冬小麦植物提取)
2.取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用pbs清洗。
3.去除pbs，加入适量胰蛋白酶(覆盖培养皿表面)把单层生长的细胞消化下来；
4.离心1000rpm，5min；
5.去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；
6.将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5ml；
7.在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；
8.冻存：当温度不低于-20℃时，降温速率为-2℃/min；当温度低于-20℃时，降温速率为-11℃℃/min；当温度为-100℃时，浸入液氮；或
置于-20℃冰箱2h，然后置于-70℃过夜后移入液氮保存。
(二)细胞复苏
1.从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
2.从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；
3.离心，1000rpm，5min；
4.弃去上清液，加入含10％小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；
5.次日更换一次培养液，继续培养。
实施例6
(一)细胞冻存：
冻存液配方：
1.配制细胞冻存培养液，使用配方是dmem+20％fbs+10％dmso+50ug/ml抗冻蛋白(冬小麦植物提取)
2.取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用pbs清洗。
3.去除pbs，加入适量胰蛋白酶(覆盖培养皿表面)把单层生长的细胞消化下来；
4.离心1000rpm，5min；
5.去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；
6.将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5ml；
7.在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；
8.冻存：当温度不低于-20℃时，降温速率为-3℃/min；当温度低于-20℃时，降温速率为-14℃/min；当温度为-100℃时，浸入液氮；或
置于-20℃冰箱2h，然后置于-70℃过夜后移入液氮保存。
(二)细胞复苏
1.从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
2.从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；
3.离心，1000rpm，5min；
4.弃去上清液，加入含10％小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；
5.次日更换一次培养液，继续培养。
实施例7
(一)细胞冻存：
冻存液配方：
1.配制细胞冻存培养液，使用配方是dmem+20％fbs+10％dmso+50ug/ml抗冻蛋白(冬小麦植物提取)
2.取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用pbs清洗。
3.去除pbs，加入适量胰蛋白酶(覆盖培养皿表面)把单层生长的细胞消化下来；
4.离心1000rpm，5min；
5.去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；
6.将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5ml；
7.在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；
8.冻存：当温度不低于-20℃时，降温速率为-3℃/min；当温度低于-20℃时，降温速率为-15℃/min；当温度为-100℃时，浸入液氮；或
置于-20℃冰箱2h，然后置于-70℃过夜后移入液氮保存。
(二)细胞复苏
1.从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
2.从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；
3.离心，1000rpm，5min；
4.弃去上清液，加入含10％小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；
5.次日更换一次培养液，继续培养。
实施例8
(一)细胞冻存：
冻存液配方：
1.配制细胞冻存培养液，使用配方是dmem+20％fbs+10％dmso+50ug/ml抗冻蛋白(冬小麦植物提取)
2.取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用pbs清洗。
3.去除pbs，加入适量胰蛋白酶(覆盖培养皿表面)把单层生长的细胞消化下来；
4.离心1000rpm，5min；
5.去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；
6.将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5ml；
7.在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；
8.冻存：当温度不低于-20℃时，降温速率为-2℃/min；当温度低于-20℃时，降温速率为-10℃℃/min；当温度为-100℃时，浸入液氮；或
置于-20℃冰箱2h，然后置于-70℃过夜后移入液氮保存。
(二)细胞复苏
1.从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
2.从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；
3.离心，1000rpm，5min；
4.弃去上清液，加入含10％小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；
5.次日更换一次培养液，继续培养。
实施例9
台盼蓝染色计数的操作步骤：
1、4％台盼蓝母液：称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml，用滤纸过滤，4度保存。使用时。用pbs稀释至0.4％。
2、胰酶消化贴壁细胞，制备单细胞悬液，并作适当稀释。
3、染色：细胞悬液与0.4％台盼蓝溶液以9:1混合混匀。
4、计数：在三分钟内，分别计数活细胞和死细胞。
5、镜下观察，死细胞被染成明显的蓝色，而活细胞拒染呈无色透明状。
6、统计细胞活力：活细胞率(％)＝活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100％。
实验分组：
实验组：实施例1～8制得的细胞冻存液；
对照组1：zenoaq公司cellbanker1；
对照组2：实验室常用的冻存液(配方是dmem/f12+10％dmso+10％胎牛血清)；
对照组3：20％dmso+60％羟乙基淀粉+余量的勃脉力a；
对照组4：
以实施例1～8的方法复苏后，使用台盘蓝染色计算细胞的存活率，结果如表1所示：
表1
注：*示与对照组1相比具有显著差异(p＜0.05)；**示与对照组1相比具有极显著差异(p＜0.01)；
#示与对照组2相比具有显著差异(p＜0.05)；##示与对照组2相比具有极显著差异(p＜0.01)；
△与对照组3相比具有显著差异(p＜0.05)；△△示与对照组3相比具有极显著差异(p＜0.01)；
□与对照组4相比具有显著差异(p＜0.05)；□□示与对照组4相比具有极显著差异(p＜0.01)。
结果分析：本发明实施例1～8提供的冻存液在细胞存活率上比对照组2～4的冻存液的效果相比极显著提高(p＜0.01)，与对照组1的冻存液的效果相比显著提高(p＜0.05)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。