本发明属于植物繁育及细胞工程技术领域，具体是一种矾根叶柄不定芽高频再生的组织培养诱导方法。
背景技术：
矾根(heucheramicrantha)又名珊瑚铃，虎耳草科矾根属，常绿多年生耐寒草本花卉。矾根叶色繁多，可分为绿色系、金色系、橙色系、红色系、紫色系、混色及花叶系等，被称为“上帝打翻了调色盘”。因其色彩丰富，耐寒性好，是家庭园艺市场热销植物产品；在园林中多用于林下花镜、地被、庭院内自然式花丛或花境应用等；也是广泛用于室内外植物墙的材料。
目前矾根主要依靠分株和扦插两种途径繁育，速度慢，人工成本较高。对于新优品种，受种苗数量的制约，采用分株和扦插繁育效率低下，难以满足市场对矾根数量的需求。
在矾根的繁育过程中，有采用带腋芽茎段为外植体，将腋芽处抽生的嫩芽进行增殖培养，并实现了工厂化生产，此方法仅是利用植物组织培养技术进行矾根的快速繁殖，并不属于植株再生体系的范畴。
植物组织培养目前已是生物科学中一项重要的技术，它对提高植物育种或遗传转化效率有重要的科学意义。矾根作为观赏花卉引进我国数年，在繁殖、培育、应用形式等方面取得了一定的研究进展，但在外植体诱导器官发生方面的研究是空白，这也成为矾根转基因育种滞后和制约发展的瓶颈。所以，建立一套成熟、稳定、高效的矾根再生体系，对矾根的转基因育种具有重要意义。
技术实现要素：
本发明是要解决新优矾根品种通过常规繁育方式效率低下以及构建矾根转基因育种技术平台，提供一种矾根叶柄不定芽高频再生的组织培养诱导方法。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
本发明的矾根叶柄不定芽高频再生的组织培养诱导方法，以矾根叶柄为外植体材料进行的不定芽诱导、增殖，不定芽诱导培养基为：wpm+1.5-2.5mg/l6-ba+0.5-1mg/lzt+0.01-0.05mg/lnaa+0.1-0.5mg/lagn03，不定芽增殖培养基为：wpm+0.5mg/l6-ba+0.05mg/lnaa；不定芽诱导先进行暗培养，然后转入光暗交替循环，培养温度为25±2℃，至长出簇状不定芽。
所述方法的具体步骤包括：矾根叶柄外植体经预处理后，于诱导培养基上先进行暗培养，然后转入光暗交替循环，将诱导的不定芽转接于不定芽增殖培养基中进行不定芽的增大和增殖。
所述预处理的具体方法为：全年取材，选取幼嫩叶柄，剪去叶片，先用饱和洗衣粉溶液浸泡30分钟，每隔10min搅动一次，然后用流水冲洗净洗衣粉泡沫，再用异噻唑啉酮和尼泊金酯钠混合溶液浸泡10min，并置于磁力搅拌器上进行旋转搅动，接着用无菌水冲洗3-5次，然后移至超净工作台中，用75％的乙醇水溶液(质量浓度)浸泡1次，时间为10s，再用1‰的hgcl2水溶液(质量浓度)浸泡3-8min，浸泡期间不断震动，然后用无菌水冲洗3-5次，备用。
所述诱导产生的不定芽用于增殖及植株再生，操作方法为：当不定芽密集成簇状时，将不定芽从外植体上切割下来，转接到wpm+0.5mg/l6-ba+0.05mg/lnaa进行生长发育，生长高度至3-4cm时，分割成单株或丛(3-5株)接种于生根培养基：1/2wpm+0.3mg/lnaa+0.2mg/liba，诱导出根系，即实现植株再生。
所述不定芽诱导培养基的调配包括以下步骤：
(1)将wpm中的基本组成成分、6-ba、naa、蔗糖及琼脂混合后煮沸；
(2)去离子水定容，用1mol/lnaoh或hcl调节ph值5.4-5.8；
(3)琼脂糖溶液分装至玻璃瓶；
(4)0.1mpa、121℃灭菌20min；
(5)降温至50-55℃，在操作台中操作，加入zt和agn03，分装至无菌培养瓶中即为不定芽诱导培养基。
暗培养条件，所述的不定芽诱导先进行暗培养时间为7d；所述的光暗交替循环培养的周期为8h/16h；所述的光照强度为2000lx。
培养基中，所述的zt，是一种人工合成的、高效的植物生长调节剂，其作用类似细胞分裂素，能促进不定芽发生；所述的naa，是一种用于植物组织培养的生长调节剂；6-ba为植物细胞分裂素，iba为植物生长素；所述的agn03为化学试剂水溶液，能抑制乙烯的产生，促进不定芽发生。
本发明的一种矾根叶柄不定芽高频再生的组织培养诱导方法，具有如下显著优点：
1.本发明操作步骤简单，外植体为幼嫩叶柄，母本需求量少，取材不会破坏母本植株，不影响母本植株正常生长且数量多。
2.本发明通过采用wpm培养基配方，选用不同激素及浓度进行配伍，同时添加agn03，提高了叶柄丛生芽诱导效率，提高了增殖系数，效率高。对于母本数量极少的稀有品种，通过叶柄再生方法，可以在短期内获得大量试管苗。
3.本发明建立的矾根叶柄不定芽高频再生的组织培养诱导方法将为遗传育种和工厂化育苗提供理论依据和技术支撑，方法操作简单，植株再生效率高。
具体实施方式
实施例1：
(1)以20d日龄的矾根叶柄为外植体材料，经预处理后，于超净工作台中切割成0.5-3.0cm的叶柄段，接种于不定芽诱导培养基中培养30-40d左右，不定芽诱导培养基为：wpm+1.5mg/l6-ba+0.5mg/lzt+0.01mg/lnaa+0.1mg/lagn03。
(2)将诱导培养后产生的不定芽转接于不定芽增殖培养基中进行不定芽的增殖增大，不定芽增殖培养基为：wpm+0.5mg/l6-ba+0.05mg/lnaa+0.1mg/lagn03。
(3)当不定芽生长高度为3-4cm时，分割成单株或丛(3-5株)接种于生根培养基：1/2wpm+0.3mg/lnaa+0.2mg/liba，诱导出根系，即实现植株再生。
不定芽诱导先进行暗培养，时间为7d。
增殖和生根培养为光暗交替培养，光暗交替循环培养的周期为8h/16h，光照强度2000lx，温度25±2℃。
结果显示，通过本实施例进行矾根不定芽的诱导，叶柄的不定芽诱导率为72.3％。
实施例2：
(1)以30d日龄的矾根叶柄为外植体材料，经预处理后，于超净工作台中切割成0.5-3.0cm的叶柄段，接种于不定芽诱导培养基中培养30-40d左右，不定芽诱导培养基为：wpm+2.0mg/l6-ba+1.0mg/lzt+0.01mg/lnaa+0.3mg/lagn03。
(2)将诱导培养后产生的不定芽转接于不定芽增殖培养基中进行不定芽的增殖增大，不定芽增殖培养基为：wpm+0.5mg/l6-ba+0.05mg/lnaa+0.1mg/lagn03。
(3)当不定芽生长高度为3-4cm时，分割成单株或丛(3-5株)接种于生根培养基：1/2wpm+0.3mg/lnaa+0.2mg/liba，诱导出根系，即实现植株再生。
不定芽诱导先进行暗培养，时间为7d。
增殖和生根培养为光暗交替培养，光暗交替循环培养的周期为8h/16h，光照强度2000lx，温度25±2℃。
结果显示，通过本实施例进行矾根不定芽的诱导，叶柄的不定芽诱导率为100％。
实施例3：
(1)以30d日龄的矾根叶柄为外植体材料，经预处理后，于超净工作台中切割成0.5-3.0cm的叶柄段，接种于不定芽诱导培养基中培养30-40d左右，不定芽诱导培养基为：wpm+2.0mg/l6-ba+1.0mg/lzt+0.01mg/lnaa+0.1mg/lagn03。
(2)将诱导培养后产生的不定芽转接于不定芽增殖培养基中进行不定芽的增殖增大，不定芽增殖培养基为：wpm+0.5mg/l6-ba+0.05mg/lnaa+0.1mg/lagn03。
(3)当不定芽生长高度为3-4cm时，分割成单株或丛(3-5株)接种于生根培养基：1/2wpm+0.3mg/lnaa+0.2mg/liba，诱导出根系，即实现植株再生。
不定芽诱导先进行暗培养，时间为7d。
增殖和生根培养为光暗交替培养，光暗交替循环培养的周期为8h/16h，光照强度2000lx，温度25±2℃。
结果显示，通过本实施例进行矾根不定芽的诱导，叶柄的不定芽诱导率为85.3％。
实施例4：
(1)以40d日龄的矾根叶柄为外植体材料，经预处理后，于超净工作台中切割成0.5-3.0cm的叶柄段，接种于不定芽诱导培养基中培养30-40d左右，不定芽诱导培养基为：wpm+2.0mg/l6-ba+1.0mg/lzt+0.01mg/lnaa+0.3mg/lagn03。
(2)将诱导培养后产生的不定芽转接于不定芽增殖培养基中进行不定芽的增殖增大，不定芽增殖培养基为：wpm+0.5mg/l6-ba+0.05mg/lnaa+0.1mg/lagn03。
(3)当不定芽生长高度为3-4cm时，分割成单株或丛(3-5株)接种于生根培养基：1/2wpm+0.3mg/lnaa+0.2mg/liba，诱导出根系，即实现植株再生。
不定芽诱导先进行暗培养，时间为7d。
增殖和生根培养为光暗交替培养，光暗交替循环培养的周期为8h/16h，光照强度2000lx，温度25±2℃。
结果显示，通过本实施例进行矾根不定芽的诱导，叶柄的不定芽诱导率为78.3％。
实施例5：
(1)以40d日龄的矾根叶柄为外植体材料，经预处理后，于超净工作台中切割成0.5-3.0cm的叶柄段，接种于不定芽诱导培养基中培养30-40d左右，不定芽诱导培养基为：wpm+2.0mg/l6-ba+1.0mg/lzt+0.01mg/lnaa+0.5mg/lagn03。
(2)将诱导培养后产生的不定芽转接于不定芽增殖培养基中进行不定芽的增殖增大，不定芽增殖培养基为：wpm+0.5mg/l6-ba+0.05mg/lnaa+0.1mg/lagn03。
(3)当不定芽生长高度为3-4cm时，分割成单株或丛(3-5株)接种于生根培养基：1/2wpm+0.3mg/lnaa+0.2mg/liba，诱导出根系，即实现植株再生。
不定芽诱导先进行暗培养，时间为7d。
增殖和生根培养为光暗交替培养，光暗交替循环培养的周期为8h/16h，光照强度2000lx，温度25±2℃。
结果显示，通过本实施例进行矾根不定芽的诱导，叶柄的不定芽诱导率为85.9％。
实施例6：
(1)以50d日龄的矾根叶柄为外植体材料，经预处理后，于超净工作台中切割成0.5-3.0cm的叶柄段，接种于不定芽诱导培养基中培养30-40d左右，不定芽诱导培养基为：wpm+2.5mg/l6-ba+1.0mg/lzt+0.01mg/lnaa+0.5mg/lagn03。
(2)将诱导培养后产生的不定芽转接于不定芽增殖培养基中进行不定芽的增殖增大，不定芽增殖培养基为：wpm+0.5mg/l6-ba+0.05mg/lnaa+0.1mg/lagn03。
(3)当不定芽生长高度为3-4cm时，分割成单株或丛(3-5株)接种于生根培养基：1/2wpm+0.3mg/lnaa+0.2mg/liba，诱导出根系，即实现植株再生。
不定芽诱导先进行暗培养，时间为7d。
增殖和生根培养为光暗交替培养，光暗交替循环培养的周期为8h/16h，光照强度2000lx，温度25±2℃。
结果显示，通过本实施例进行矾根不定芽的诱导，叶柄的不定芽诱导率为65.3％。
通过以上实施例得出，不同叶龄的叶柄均有50％以上的诱导再生率，其中实施例2矾根叶柄不定芽的诱导效率最高，达到100％。此种方法可以大大提高矾根组培培养效率，为矾根转基因育种提供了技术平台。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均包含在本发明的保护范围之内。