本发明属于植物繁殖
技术领域：
，具体涉及一种从商陆愈伤组织诱导丛生芽的方法。
背景技术：
商陆(phytolaccaacinosaroxb)为商陆科商陆属多年生宿根草本植物，是一种传统的药用植物，此外，商陆还具有富集土壤中多种金属离子的作用，商陆还被用于环境修复，利用商陆矿质营养遗传资源对改善作物营养特性和土壤修复具有重要意义，商陆还可以用于病虫害防治和印染业等多个领域。由于商陆在医药、农业和环保等领域具有重要的应用前景和研究价值，通过商陆组织培养技术大量快速地获取商陆的无性繁殖体系成为研究和应用开发中的现实问题。然而，由于商陆组织富含次生代谢产物，在商陆组织培养中诱导产生的愈伤组织易褐化，从愈伤组织诱导产生丛生芽一直是商陆组织培养快速繁殖的难题。在现有技术中，只有从带顶芽或腋芽的外植体才能诱导出不定芽，或者是从带顶芽的愈伤组织转接到芽分化培养基后才有丛生芽的分化，而不带顶芽或腋芽的愈伤组织均未发现有芽的分化，即使该愈伤组织是由顶芽为外植体诱导产生。因此，现有技术不仅限制了商陆组织培养中外植体的选择范围，也限制了商陆组织培养繁殖系数的进一步扩大。综上，尚需开发一种新的方法，克服不能从商陆愈伤组织诱导出丛生芽这一技术障碍，从而扩大商陆组织培养中外植体的选择范围和进一步增加繁殖系数。技术实现要素：为解决现有技术中，不带芽的愈伤组织不能分化出丛生芽的问题，本发明提供了一种从商陆愈伤组织诱导丛生芽的方法。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种从商陆愈伤组织诱导丛生芽的方法，包括以下步骤：(1)于诱导培养基中添加商陆顶芽提取物，得到芽分化培养基；(2)将愈伤组织接种于步骤(1)的芽分化培养基中进行诱导培养；步骤(1)所述芽分化培养基中，商陆顶芽提取物的浓度为25～75g/l，步骤(2)所述诱导培养的温度为20～25℃，光照强度为1500～2000lx，光暗周期为14h/10h。进一步优选地，步骤(1)所述芽分化培养基中，商陆顶芽提取物的浓度为50g/l。优选地，所述方法进一步包括在步骤(1)之前，通过无菌的硝酸纤维素膜，对商陆顶芽提取物进行过滤消毒，再加入到已高压湿热灭菌后温度降低到50℃以下，但仍未凝固的培养基中混匀。优选地，所述诱导培养基为添加了植物生长调节剂的ms培养基，所述的植物生长调节剂包括以终浓度计的组分：6-ba1.0～3.0mg/l，naa0.1～0.5mg/l。进一步优选地，所述诱导培养基为添加了植物生长调节剂的ms培养基，所述的植物生长调节剂包括以终浓度计的组分：6-ba2.0mg/l，naa0.25mg/l。优选地，所述芽分化培养基的ph为5.8。优选地，所述商陆顶芽提取物的提取步骤包括：先将商陆顶芽以自来水冲洗干净，再以蒸馏水洗2-3次，然后将商陆顶芽在甲醇中冰浴研磨，浸提离心后取上清液。进一步优选地，所述商陆顶芽提取物的提取步骤进一步包括：(1)将商陆顶芽在预冷的甲醇中冰浴研磨，于4℃冷藏箱中浸提后3000g离心10min，得到上清液a和残渣a；(2)将残渣a于预冷的甲醇中漩涡振荡后离心，得上清液b和残渣b；(3)将残渣b重复步骤(2)，得上清液c和残渣c；(4)合并上清液a、b和c，真空冷冻离心浓缩除去甲醇后，加入醋酸铵复溶后27000g离心20min，得上清液d并纯化。进一步优选地，所述冰浴研磨的环境为弱光环境。进一步优选地，所述甲醇的浓度为70～90(wt)％。进一步优选地，所述浸提时间为10～20h。进一步优选地，所述漩涡振荡的时间为3～10min。进一步优选地，所述醋酸铵的浓度为0.05～0.2mol/l。更进一步优选地，所述醋酸铵的浓度为0.1mol/l。步骤(4)所述的纯化方法为：上清液d经过预处理的聚乙烯聚吡咯烷酮(pvpp)柱，以25ml0.01mol/l醋酸铵洗脱，从pvpp柱流出的洗脱液就是商陆顶芽提取物。pvpp的预处理工艺为：30gpvpp+300ml蒸馏水，于烧杯中摇动5min，再静置分层15min，将上层小颗粒吸去丢弃于废烧杯中，共吸收140ml，以蒸馏水恢复原有的体积，再摇动5min，静置分层15min，再将上层小颗粒吸去丢弃，记录吸去的量，最后以ph8.0、0.1mol/l醋酸铵进行悬浮，上、下层比例为1:1，以parafilm封口膜盖住杯口，于4℃冰箱中保存备用。本发明的有益效果1、本发明所提供的一种从商陆愈伤组织诱导丛生芽的方法，简单易行，可操作性强，其中以叶柄愈伤组织(即以叶柄作为外植体诱导获得的愈伤组织)诱导丛生芽的诱导率可达到62％，以叶片愈伤组织(即以叶片作为外植体诱导获得的愈伤组织)诱导丛生芽的诱导率可达到69％，以茎段愈伤组织(即以茎段作为外植体诱导获得的愈伤组织)诱导丛生芽的诱导率可达到67％，以茎节愈伤组织(即以茎节作为外植体诱导获得的愈伤组织)诱导丛生芽的诱导率可达到73％，以顶芽愈伤组织(即以顶芽作为外植体诱导获得的愈伤组织)诱导丛生芽的诱导率可达到78％，有利于商陆植株的快速繁殖以及通过继代培养大量扩增愈伤组织，再以愈伤组织接种到芽分化培养基中诱导产生大量丛生芽，可以大幅提升扩繁系数；2、通过本发明方法诱导产生丛生芽，扩大了外植体的选择范围，如叶片、茎段、叶柄、顶芽、茎节等，从而扩大了商陆组织培养的应用范围，为商陆作为优良的矿质营养遗传资源的进一步研究奠定了基础；3、采用本发明方法诱导丛生芽，扩繁系数大，应用价值大。具体实施方式以下是本发明的具体实施例，并结合实施例对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。实施例1本实施例提供了商陆顶芽提取物的提取方法，具体为：(1)弱光环境下，剪取若干个商陆顶芽(长0.5～2cm)，称取50g，先以自来水冲洗干净，再以蒸馏水洗2-3次，将商陆顶芽在70～90(wt)％的预冷的甲醇中冰浴研磨，于4℃冷藏箱中浸提10～20h后3000g离心10min，得到上清液a和残渣a；(2)将残渣a于70～90(wt)％的预冷的甲醇中漩涡振荡3～10min后离心，得上清液b和残渣b；(3)将残渣b重复步骤(2)，得上清液c和残渣c；(4)合并上清液a、b和c，加入醋酸铵复溶后27000g离心20min，得上清液d并纯化，醋酸铵的浓度为0.05～0.2mol/l。步骤(4)的纯化方法为：上清液d经过预处理的聚乙烯聚吡咯烷酮(pvpp)柱，以25ml0.01mol/l醋酸铵洗脱，从pvpp柱流出的洗脱液就是商陆顶芽提取物。pvpp的预处理工艺为：30gpvpp+300ml蒸馏水，于烧杯中摇动5min，再静置分层15min，将上层小颗粒吸去丢弃于废烧杯中，共吸收140ml，以蒸馏水恢复原有的体积，再摇动5min，静置分层15min，再将上层小颗粒吸去丢弃，记录吸去的量，最后以ph8.0、0.1mol/l醋酸铵进行悬浮，上、下层比例为1:1，以parafilm封口膜盖住杯口，于4℃冰箱中保存备用。实施例2本实施例提供了芽分化培养基的制备方法，具体为：通过无菌的硝酸纤维素膜，对商陆顶芽提取物进行过滤消毒，再加入到已高压湿热灭菌后温度降低到50℃以下，但仍未凝固的培养基中混匀。商陆顶芽提取物的浓度为25～75g/l。实施例3本实施例提供了一种从商陆愈伤组织诱导丛生芽的方法，包括以下步骤：(1)于诱导培养基中添加商陆顶芽提取物，得到芽分化培养基；(2)将叶片诱导的愈伤组织接种于步骤(1)的芽分化培养基中进行诱导培养；步骤(1)的诱导培养基为添加了植物生长调节剂的ms培养基，植物生长调节剂包括以终浓度计的组分6-ba2.0mg/l和naa0.25mg/l。芽分化培养基的ph为5.8。商陆顶芽提取物的浓度为25g/l。诱导培养的温度为23℃。实施例4本实施例提供了一种从商陆愈伤组织诱导丛生芽的方法，包括以下步骤：(1)于诱导培养基中添加商陆顶芽提取物，得到芽分化培养基；(2)将叶片诱导的愈伤组织接种于步骤(1)的芽分化培养基中进行诱导培养；步骤(1)的诱导培养基为添加了植物生长调节剂的ms培养基，植物生长调节剂包括以终浓度计的组分6-ba2.0mg/l和naa0.25mg/l。芽分化培养基的ph为5.8。商陆顶芽提取物的浓度为75g/l。诱导培养的温度为23℃。实施例5本实施例提供了一种从商陆愈伤组织诱导丛生芽的方法，包括以下步骤：(1)于诱导培养基中添加商陆顶芽提取物，得到芽分化培养基；(2)将叶片诱导的愈伤组织接种于步骤(1)的芽分化培养基中进行诱导培养；步骤(1)的诱导培养基为添加了植物生长调节剂的ms培养基，植物生长调节剂包括以终浓度计的组分6-ba2.0mg/l和naa0.25mg/l。芽分化培养基的ph为5.8。商陆顶芽提取物的浓度为50g/l。诱导培养的温度为23℃。实施例6本实施例提供了一种从商陆愈伤组织诱导丛生芽的方法，包括以下步骤：(1)于诱导培养基中添加商陆顶芽提取物，得到芽分化培养基；(2)将茎段诱导的愈伤组织接种于步骤(1)的芽分化培养基中进行诱导培养；步骤(1)的诱导培养基为添加了植物生长调节剂的ms培养基，植物生长调节剂包括以终浓度计的组分6-ba2.0mg/l和naa0.25mg/l。芽分化培养基的ph为5.8。商陆顶芽提取物的浓度为50g/l。诱导培养的温度为23℃。实施例7本实施例提供了一种从商陆愈伤组织诱导丛生芽的方法，包括以下步骤：(1)于诱导培养基中添加商陆顶芽提取物，得到芽分化培养基；(2)将叶柄诱导的愈伤组织接种于步骤(1)的芽分化培养基中进行诱导培养；步骤(1)的诱导培养基为添加了植物生长调节剂的ms培养基，植物生长调节剂包括以终浓度计的组分6-ba2.0mg/l和naa0.25mg/l。芽分化培养基的ph为5.8。商陆顶芽提取物的浓度为50g/l。诱导培养的温度为23℃。实施例8本实施例提供了一种从商陆愈伤组织诱导丛生芽的方法，包括以下步骤：(1)于诱导培养基中添加商陆顶芽提取物，得到芽分化培养基；(2)将茎节诱导的愈伤组织接种于步骤(1)的芽分化培养基中进行诱导培养；步骤(1)的诱导培养基为添加了植物生长调节剂的ms培养基，植物生长调节剂包括以终浓度计的组分6-ba2.0mg/l和naa0.25mg/l。芽分化培养基的ph为5.8。商陆顶芽提取物的浓度为50g/l。诱导培养的温度为23℃。实施例9本实施例提供了一种从商陆愈伤组织诱导丛生芽的方法，包括以下步骤：(1)于诱导培养基中添加商陆顶芽提取物，得到芽分化培养基；(2)将顶芽诱导的愈伤组织(除去顶芽)接种于步骤(1)的芽分化培养基中进行诱导培养；步骤(1)的诱导培养基为添加了植物生长调节剂的ms培养基，植物生长调节剂包括以终浓度计的组分6-ba2.0mg/l和naa0.25mg/l。芽分化培养基的ph为5.8。商陆顶芽提取物的浓度为50g/l。诱导培养的温度为23℃。实施例10本实施例提供了一种从商陆愈伤组织诱导丛生芽的方法，包括以下步骤：(1)于诱导培养基中添加商陆顶芽提取物，得到芽分化培养基；(2)将顶芽诱导的愈伤组织(保留顶芽)接种于步骤(1)的芽分化培养基中进行诱导培养；步骤(1)的诱导培养基为添加了植物生长调节剂的ms培养基，植物生长调节剂包括以终浓度计的组分6-ba2.0mg/l和naa0.25mg/l。芽分化培养基的ph为5.8。商陆顶芽提取物的浓度为50g/l。诱导培养的温度为23℃。对比例1在本对比例中，选取以叶片为外植体诱导的愈伤组织接种于未添加商陆顶芽提取物的芽分化培养基中进行诱导培养，芽分化培养基为添加了植物生长调节剂的ms培养基，植物生长调节剂包括以终浓度计的组分6-ba2.0mg/l和naa0.25mg/l。芽分化培养基的ph为5.8。诱导培养的温度为23℃。对比例2在本对比例中，选取以茎段为外植体诱导的愈伤组织接种于未添加商陆顶芽提取物的芽分化培养基中进行诱导培养，芽分化培养基为添加了植物生长调节剂的ms培养基，植物生长调节剂包括以终浓度计的组分6-ba2.0mg/l和naa0.25mg/l。芽分化培养基的ph为5.8。诱导培养的温度为23℃。对比例3在本对比例中，选取以叶柄为外植体诱导的愈伤组织接种于未添加商陆顶芽提取物的芽分化培养基中进行诱导培养，芽分化培养基为添加了植物生长调节剂的ms培养基，植物生长调节剂包括以终浓度计的组分6-ba2.0mg/l和naa0.25mg/l。芽分化培养基的ph为5.8。诱导培养的温度为23℃。对比例4在本对比例中，选取以茎节为外植体诱导的愈伤组织接种于未添加商陆顶芽提取物的芽分化培养基中进行诱导培养，芽分化培养基为添加了植物生长调节剂的ms培养基，植物生长调节剂包括以终浓度计的组分6-ba2.0mg/l和naa0.25mg/l。芽分化培养基的ph为5.8。诱导培养的温度为23℃。对比例5在本对比例中，选取以顶芽为外植体诱导的愈伤组织(除去顶芽)，接种于未添加商陆顶芽提取物的芽分化培养基中进行诱导培养，芽分化培养基为添加了植物生长调节剂的ms培养基，植物生长调节剂包括以终浓度计的组分6-ba2.0mg/l和naa0.25mg/l。芽分化培养基的ph为5.8。诱导培养的温度为23℃。对比例6在本对比例中，选取以顶芽为外植体诱导的愈伤组织(保留顶芽)，接种于未添加商陆顶芽提取物的芽分化培养基中进行诱导培养，芽分化培养基为添加了植物生长调节剂的ms培养基，植物生长调节剂包括以终浓度计的组分6-ba2.0mg/l和naa0.25mg/l。芽分化培养基的ph为5.8。诱导培养的温度为23℃。检测例本检测例统计了培养20d后，实施例3～10和对比例1～6的丛生芽诱导率，结果如表1所示。其中，丛生芽诱导率(％)＝芽分化的愈伤组织个数/接种愈伤组织总数×100％。表1编号丛生芽诱导率(％)实施例355实施例464实施例569实施例667实施例762实施例873实施例978实施例1086对比例10对比例20对比例30对比例40对比例50对比例698当前第1页12