一种基于聚乳酸-羟基乙酸共聚物包载氟啶胺的纳米粒子的制备方法与流程

本发明属于纳米材料农学领域。本发明涉及一种缓释型纳米农药基于plga包载广谱杀菌剂氟啶胺的制备方法及应用。

技术背景

农药在防治病虫灾害保持粮食产量上发挥重要作用，但大量农药流入周围环境会导致生态系统破坏和食物污染。纳米缓释技术具有广阔的应用前景，可以提高农药的水分散性及其在叶片表面的渗透能力，并降低由于光照等环境因素引起的药物的催化降解，由于载体的包封使药物可以持续释放因此具有缓释性能并延长了药物的持效期。

聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolicacid)，plga)聚合物由于其低毒性，可生物降解性和持续释放能力而被广泛用作各种有效药物分子的载体，如小分子化合物和核苷酸。美国食品和药物管理局(fda)已批准其安全性在人体中具有良好的生物降解性和生物相容性，目前在农药中的应用报道甚少。

氟啶胺[3-氯-n-(3-氯-5-三氟甲基-2-吡啶基)-α，α，α-三氟-2,6-二硝基-甲苯胺]是一种吡啶胺类广谱杀菌剂(fluazinam,flu)，对于真菌毒性基于非偶联的氧化磷酸化作用，防治由灰葡萄胞引起的病害，对交链孢属、葡萄孢属、疫霉属、核盘菌属和黑垦菌属菌非常有效，但其不溶于水，在光照下较易分解，在农业中应用受到一定的限制。

膜乳化技术(shirasuporousglassmembrane,spg)是近年来发展的一种新型的乳化方法，具有乳化条件温和消耗能量少等优点，膜乳化法可以更好地控制粒径，减小粒径分布并实现批量生产。目前还没有在纳米农药复合体系制备中的应用报道。

技术实现要素：

一种缓释型纳米农药基于plga包载广谱杀菌剂氟啶胺的制备方法，包括以下步骤：

(1)将氟啶胺flu和plga溶于作为分散相的二氯甲烷中，氟啶胺flu在二氯甲烷中的浓度优选为1-30mg/ml，然后更优选4mg/ml。

(2)通过将pva或sds完全溶解在去离子水中来制备连续相；pva或sds在去离子水中的浓度为0.5-2％，然后pva更优选浓度为1％,sds更优选浓度为0.5％。

(3)将步骤(1)分散相倒入spg膜中；然后调节压力(优选100-400kpa)将分散相分散在连续搅拌的步骤(2)中的连续相中混合搅拌完全乳化产生乳液，其中乳液中pva或sds与plga的质量比为(5-20):1，然后更优选质量比pva：plga为20:1和，sds:plga为10:1(4)在步骤(3)完全乳化后，将乳液继续搅拌24小时以蒸发乳滴中的二氯甲烷；

(5)将步骤(4)蒸发二氯甲烷后固化的氟啶胺plga微球离心，然后冻干收集，得到flu-plga-pva或flu-plga-sds颗粒；优选的flu和plga的质量比优选为(1-3):10，更优选2:10；

所述plga负载氟啶胺的制备方法，flu-plga-pva粒径控制在600-1900nm(表面活性剂pva)和flu-plga-sds粒径300-1100nm(表面活性剂sds)。

本发明的优点：

本研究制备的缓释型纳米农药粒子flu-plga-pva和flu-plga-sds具有合适的理化性质，良好的水分散性和稳定性，缓释持效期长，制备方法简单，重复性高。由于氟啶胺纳米农药的粒径更小，可以解决传统农药水分散性差，有效利用率低和环境污染等问题，可以使杀菌剂氟啶胺持续释放到叶片上，减少农药的喷洒次数，在叶面上具有更好的润湿效果，由于载体的保护作用可以减少氟啶胺的光解提高农药的有效利用率。

附图说明

图1是plga包载氟啶胺纳米粒子的扫描电镜图像(a)flu-plgapva纳米粒子(b)flu-plgasds纳米粒子

图2是plga包载氟啶胺纳米粒子的统计尺寸分布直方图(a)flu-plgapva纳米粒子(b)flu-plgapva纳米粒子

图3是在紫外光下的plga包载氟啶胺纳米粒子(表面活性剂sds，pva)的光降解曲线，以氟啶胺市售药物作为对照；

图4是plga包载氟啶胺纳米粒子在不同储存温度下的稳定性图像。

图5是plga包载氟啶胺纳米粒子在黄瓜叶片表面接触角的图像，以氟啶胺市售药物作为对照flu-plga(sds)(a)flu-plganps(pva)(b)氟啶胺乳油制剂(c)去离子水(d)；

图6是plga包载氟啶胺纳米粒子在第4天和第8天对立枯丝核菌的杀菌效果(药物中氟啶胺的实际浓度12.5ug/ml)，去离子水为阴性对照，以氟啶胺市售药物作为阳性对照。

图7是不同浓度pva的plga包载氟啶胺纳米粒子的累计释放曲线(pva浓度0.5％，1％，2％)。

图8是不同浓度sds的plga包载氟啶胺纳米粒子的累计释放曲线(sds浓度0.5％，1％，2％)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

实施例1：

将一定量20mg的氟啶胺和100mgplga溶于作为分散相的5ml二氯甲烷中。通过将2gpva或1gsds完全溶解在200ml去离子水中来制备连续相。将分散相6ml溶有氟啶胺和plga的二氯甲烷溶液倒入spg膜乳化剂中。然后调节压力250kpa以将分散相分散在连续搅拌的pva溶液(或sds溶液)中。在产生足够的乳液200ml后(其中乳液中plga和pva的质量比1:20，plga和sds的的质量比1:10)，将乳液搅拌24小时以蒸发乳滴中的二氯甲烷。将固化的氟啶胺plga微球离心，用蒸馏水洗涤三次，然后冻干收集。优选的flu与plga的质量比为1:5。

使用扫描电子显微镜观察纳米粒子的形态(图1)，并对粒径进行检测，粒度分布的直方图见图2。结果图1sem图像显示纳米粒子呈均匀分布的球形并具有较小尺寸，图2显示了纳米颗粒的平均粒径约为612.80nmflu-plganps(pva)和314.13nmflu-plganps(sds)。

实施flu-plga纳米粒子的光解性能和热稳定的测定(图3和图4)。从氟啶胺的残留量评估不同照射时间的光解行为，并将市售氟啶胺制剂用作对照，室温25℃，结果如图3所示，flu-plga纳米药物与氟啶胺市售制剂相比具有更好的光学稳定性。图4所示flu-plga纳米药物在4℃、25℃稳定，在54℃下仅有少量分解，在三种不同的温度下都具有较好的稳定性。

以氟啶胺市售制剂和去离子水为阳性对照，测量了flu-plga纳米粒子在黄瓜植物叶片上的接触角(图5)：摘取在室温下生长的黄瓜植物叶片并用去离子水洗涤去除叶表杂质，干燥后固定于载玻片上，用接触角仪器测量叶片上的纳米药滴的接触角。将flu-plga纳米药物(1mg/ml，2ul)的水分散液滴滴加到叶表面上，捕获叶片表面液滴的图像并得到的接触角度数，重复测量6次取平均值，选择去离子水和氟啶胺市售制剂作为对照。结果显示flu-plga纳米药物与氟啶胺市售制剂、去离子水相比具有更小的接触角，表明flu-plga纳米药物具有更好的叶面润湿性。

以立枯丝核菌(rhizoctoniasolani)作为靶向菌，测定纳米药物对真菌生长的抑制作用(图6)结果所示，flu-plga纳米药物与氟啶胺市售制剂相比具有更好的抑菌效果。利用菌丝的生长速率法评估纳米药物的抑菌效果，将质量为3.623mg的flu-plga(pva)4.310mg的flu-plga(sds)纳米药物溶于20mlpda培养基中并梯度稀释制备实际含药浓度为25ug/ml,12.5ug/ml,6.25ug/ml的pda含药培养皿，打取直径为5mm的立枯丝核菌饼并倒置到不同浓度的含药培养皿中心，培养皿置于28℃的培养箱中培养。在第4天和第8天时取出各培养皿并测量直径，选择不含药的培养皿与氟啶胺市售制剂作为对照,优选的实际含药浓度为12.5ug/ml的flu-plga(pva、sds)纳米药物具有良好的抑菌效果。

实施例2：

将10mg，20mg,30mg的氟啶胺分别和三份100mgplga溶于作为分散相的5ml二氯甲烷中。然后，通过将2gpva或1gsds完全溶解在200ml去离子水中来制备连续相。随后，将分散相倒入spg膜乳化剂中。然后调节压力250pa以将分散相分散在连续搅拌的pva溶液(或sds溶液)中；在产生200ml乳液后(乳液中plga和pva的质量比1:20，plga和sds的的质量比1:10)，将乳液搅拌24小时以蒸发乳滴中的二氯甲烷。最后，将固化的氟啶胺plga微球离心，用蒸馏水洗涤三次，然后冻干收集。不同投药量对flu-plga纳米粒子的载药量与形貌的影响见表1。结果显示出药物投入量为20mg的纳米粒子具有较高的载药量且不产生结晶分散性较好，载药量为13.8％flu-plganps(pva)和11.6％flu-plganps(sds)。以此投药量的纳米药物进行缓释实验同时以市售的氟啶胺制剂作为对照。结果如图7所示flu-plga相对于市售药剂具有更好的缓释性能。

表1不同投药量对flu-plga纳米粒子的载药量与形貌的影响

(a)pva浓度对纳米粒子性质的影响(b)sds浓度对纳米粒子性质的影响(a)(a)pva

(b)sds

实施例3：

将20mg的氟啶胺和100mgplga溶于作为分散相的5ml二氯甲烷中。然后，通过将1g，2g,3gpva完全溶解在200ml去离子水中来制备连续相,即pva浓度为0.5％，1％，1.5％。随后将分散相倒入spg膜乳化剂中。然后调节压力250pa以将分散相分散在连续搅拌的pva溶液中。在产生200ml乳液后，将乳液搅拌24小时以蒸发乳滴中的二氯甲烷。最后，将固化的氟啶胺plga微球离心，洗涤，冻干收集。对flu-plga纳米粒子的累计释放率进行测定(见图8)分别将15mgflu-plga(pva、sds)纳米颗粒均匀混悬于5ml乙醇：水1：1的混合溶液中，将悬浮液转移至透析袋中，将透析袋密封于95ml以乙醇：水1:1混合溶液作为释放介质的烧杯中，将烧杯置于37℃，100rpm的恒温摇床中培养。在特定的时间间隔吸取5ml透析袋外溶液加入等体积的新鲜释放介质。通过高效液相色谱法(hplc)进行检测，检测条件，流动相甲醇：水＝85:15，进样体积v＝10ul,检测波长240nm,，柱温30℃，保留时间约6min。结果表明乳化剂浓度为1％pva所制备出的纳米粒子，与其他两种浓度的pva纳米粒子相比表现出较高的释放率。

实施例4：

将20mg的氟啶胺和100mgplga溶于作为分散相的5ml二氯甲烷中。然后，通过将1g，2g，3gsds完全溶解在去200ml离子水中来制备连续相，即sds浓度为0.5％，1％，1.5％。随后，将分散相倒入spg膜乳化剂中。然后调节压力250pa以将分散相分散在连续搅拌的sds溶液中。在产生足够200ml的乳液后，将乳液搅拌24小时以蒸发乳滴中的二氯甲烷。最后，将固化的氟啶胺plga微球离心，洗涤，冻干收集。分别将15mgflu-plga(pva、sds)纳米颗粒均匀混悬于5ml乙醇：水1：1的混合溶液中，将悬浮液转移至透析袋中，将透析袋密封于95ml以乙醇：水1:1混合溶液作为释放介质的烧杯中。将烧杯置于37℃，100rpm的恒温摇床中培养。在特定的时间间隔吸取5ml透析袋外溶液并补加等体积的新鲜释放介质。通过高效液相色谱法(hplc)进行测量，检测条件，流动相甲醇：水＝85:15，进样体积v＝10ul,检测波长240nm,，柱温30℃，保留时间约6min。结果表明浓度为0.5％sds所制备出的纳米粒子，与其他两种浓度的sds纳米粒子相比表现出较高的释放率。