一种大葱离体雌核发育诱导单倍体植株的方法与流程

本发明涉及一种大葱离体雌核发育诱导单倍体植株的方法，属于育种技术领域。

背景技术

大葱(alliumfistulosuml.)是典型的异花授粉作物，育成优良的自交系至少需要6-10年的时间，而通过单倍体途径在较短时间内就可以选育出整齐一致的纯系，同时由于不存在等位基因位点的显隐性作用，一些由隐性基因决定的性状便可以得到充分表现，这样在筛选育种材料时能大大降低误选频率，明显提高选择效果。此外，单倍体培养可以快速获得双单倍体群体，利用突变技术来创造有用变异已被实践证明是一种非常有潜力的育种方法，而在离体培养中，双单倍体技术则是促进突变技术应用的更有效的方法，至今全世界在150多种植物中已选出近2000个优良突变品种在生产中推广应用。

关于未受精子房和胚珠离体培养的研究，最早的工作始于二十世纪五十年代，直到七十年代末，在这方面的研究才出现了成功的报道。sannoeum通过大麦未受精子房在离体条件下培养获得了单倍体再生植株，并首次釆用了“雌核发育”(gynogenesis)这一名词来说明在离体条件下由未受精胚囊产生单倍体植株的现象(sannoeumlh.invitroinductionofgynogenssisinhigherplants[j].proceedingsoftheconferenceonbroadeninggenetic,1978,24:327～329)。从此，许多国内外学者开始对各种植物的离体雌核发育展开研究。颜昌敬与赵庆华在进行水稻叶鞘与枝梗愈伤组织诱导再生植株的研究时，也由子房培养获得了小植株(颜昌敬、赵庆华.水稻叶鞘和枝梗愈伤组织的植株再生[j].科学通报,1979,20:943-947.)。借助单倍体技术我国已成功育成水稻品种近百个、小麦品种十多个，玉米、大白菜、油菜品种多个，以及甜椒、烟草和果树等作物新品种，总计种植面积超过200万公顷，是世界上借助单倍体技术育成品种最多、应用最广的国家。

目前，关于大葱离体雌核诱导单倍体的研究还未见报道，本发明提供了一种大葱离体雌核发育诱导单倍体植株的方法。本方法的实施将为大葱雌核发育诱导单倍体再生体系的建立提供理论依据，为大葱杂交种选育、分子标记研究、遗传图谱构建等奠定基础。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明提供了一种大葱离体雌核发育诱导单倍体植株的方法。该方法选取直径为2.0～2.5mm的未开放花蕾作为材料，移至4℃的冰箱中进行3d的低温预处理，处理结束后将子房接种到诱导培养基中(ms培养基中添加1.0mg·l^-12,4-d和1.5mg·l^-16-ba)中进一步诱导成为胚状体，其雌核发育胚诱导率可达10％。

本发明的技术方案是：一种大葱离体雌核发育诱导单倍体植株的方法，其特征是，

1)从开花前2-3d的大葱花蕾中选取直径为2.0～2.5mm的未开放花蕾作为材料；

2)将材料移至4℃的冰箱中，进行3d的低温预处理，之后剪去花柄并消毒，然后接种在单倍体诱导培养基中于培养室内培养；单倍体诱导培养基为：1.0mg·l^-12,4-d+1.5mg·l^-16-ba的ms培养基；

3)植株再生：花蕾在单倍体诱导培养基中诱导成为胚状体，待芽生长至大于1cm后转入含有30g·l^-1蔗糖的1/2ms培养基中发育成完整植株；

4)植株生长至两叶一心后，打开瓶盖驯化培养3-5d，取出，在培养室培养成活后定植于温室中。

其中步骤2)的培养条件为：温度(24±2)℃，光照25μmol·m^-2·s^-1，15h·d^-1的培养室中。

所述步骤2)的单倍体诱导培养基中添加100g·l^-1蔗糖和7g·l^-1植物凝胶，然后将其ph值调整至5.8，并于高压灭菌锅121℃灭菌20min。用直径90mm的培养皿分装培养基，parafilm石蜡膜封口，每皿接种花蕾20个。

本发明的有益效果是：该方法选取直径为2.0～2.5mm的未开放花蕾作为材料，移至4℃的冰箱中进行3d的低温预处理，处理结束后将子房接种到诱导培养基中(ms培养基中添加1.0mg·l^-12,4-d和1.5mg·l^-16-ba)中进一步诱导成为胚状体，其雌核发育胚诱导率可达10％。由单倍体加倍获得的双单倍体是重要性状的遗传分析、分子标记及数量性状研究的理想材料，此研究为大葱遗传育种奠定了基础。

附图说明

图1为大葱花蕾在ms培养基中长出花药；

图2为大葱雌核发育成胚；

图3为大葱正常二倍体染色体；

图4为大葱单倍体染色体。

具体实施方式

1材料与方法

1.1材料的种植和选取

大葱杂交种鲁葱杂5号于7月初播种于露地，同年10月初将葱苗定植于温室大棚中，次年3月中旬抽薹后，从开花前2-3d的大葱花蕾中选取直径为2.0～2.5mm的未开放花蕾作为试材。

1.2材料的处理和培养

将试材移至4℃的冰箱中，进行3d的低温预处理，之后剪去花柄，在超净工作台上用75％的酒精溶液表面消毒处理30s，再用有效浓度5％(体积比)的naclo溶液消毒15min，然后用无菌水冲洗3遍，最后用灭菌滤纸吸干表面水分，分别接种在添加了1.0mg·l^-12,4-d+1.5mg·l^-16-ba的ms培养基中和添加了1.0mg·l^-12,4-d+1.0mg·l^-16-ba的b5培养基中；放入培养条件为温度(24±2)℃，光照25μmol·m^-2·s^-1，15h·d^-1的培养室中。

所有诱导培养基均添加100g·l^-1蔗糖和7g·l^-1植物凝胶，然后将其ph值调整至5.8，并于高压灭菌锅121℃灭菌20min。用直径90mm的培养皿分装培养基，parafilm石蜡膜封口，每皿接种花蕾20个。

胚状体诱导率(％)＝有胚状体发生的外植体数/接种外植体总数×100。

1.3植株再生

花蕾在单倍体诱导培养基中诱导成为胚状体，待芽生长至大于1cm后转入无植物生长调节剂，含有30g·l^-1蔗糖的1/2ms培养基中发育成完整植株。植株生长至两叶一心后，打开瓶盖驯化培养3-5d，用镊子小心地将幼苗取出用自来水冲洗干净，移栽到装有高温灭菌蛭石的营养钵中，在培养室培养成活后定植于温室中。

1.4倍性鉴定

染色体计数法：每株取2～3mm长的新生幼嫩根尖进行染色体鉴定，经卡诺液固定过夜后，使用70％的酒精在4℃冰箱中保存备用。切取的根尖部分用1％的醋酸洋红染色，覆上盖玻片，用实验镊子一端垂直轻轻敲片，使染色体散开。在显微镜下观察，选取染色体分散较好的体细胞拍照，统计染色体数。

2结果与分析

2.1花蕾在诱导培养基中的发育过程

接种在添加不同外源激素浓度培养基中的花蕾2d后陆续开放，伸出花丝(图1)，5～6d后花药败育，15d左右子房开始逐渐膨大，珠被表面开始发白发亮。大约50天后，从子房中长出雌核发育的胚(图2)，之后胚逐渐增多，直到5个月后很少再出现成胚。

2.2不同含量外源激素和花蕾大小对离体雌核诱导单倍体的影响

将直径为2.0～2.5mm的未开放花蕾在超净工作台上用75％的酒精溶液表面消毒处理30s，再用有效浓度5％(体积比)的naclo溶液消毒15min，然后用无菌水冲洗3遍，最后用灭菌滤纸吸干表面水分，分别接种在添加有不同含量外源激素2,4-d(2,4－二氯苯氧乙酸)和6-ba(6－苄基腺嘌呤)中的ms培养基和b5培养基中；放入培养条件为温度(24±2)℃，光照25μmol·m^-2·s^-1，15h·d^-1的培养室中，每皿接种20个(图1)，5个月后统计出胚率。由表1-2可以看出：b5培养基的外源激素最优添加量为1.0mg·l^-12,4-d+1.0mg·l^-16-ba；ms培养基的最优添加量为1.0mg·l^-12,4-d+1.5mg·l^-16-ba。

同时将直径为2.5～3.5mm的未开放花蕾代替直径为2.0～2.5mm的未开放花蕾进行上述实验，其结果也如表1-2所示。从表1-2可以看出：在培养基b5(1.0mg·l^-12,4-d+1.0mg·l^-16-ba)和ms(1.0mg·l^-12,4-d+1.5mg·l^-16-ba)中，直径为2.0～2.5mm的未开放花蕾诱导出的胚状体个数明显高于直径为2.5～3.5mm的未开放花蕾胚状体诱导个数。所以进行大葱离体雌核诱导单倍体时，要注重对花蕾大小的选择，这样可提高再生植株的诱导频率。

表1b5培养基中添加不同激素配比对大葱离体雌核诱导单倍体的影响

注：每个处理接种400个花蕾，即一个处理就是做20个培养皿。

2.3不同预处理对大葱雌核发育的影响

2.3.1低温预处理

将开花前2-3d的直径为2～2.5mm大葱花蕾移至4℃的冰箱中，进行0(ck)、2、3、4、5d不同天数的低温预处理，处理结束后将子房接种到诱导培养基中。具体操作步骤如下：将大葱未开放花蕾，剪去花柄，在超净工作台上用75％的酒精溶液表面消毒处理30s，转入有效浓度2％(体积比)的次氯酸钠溶液消毒15min，然后用无菌水冲洗3～5遍，最后用灭菌滤纸吸干表面水分，接种在加有浓度为1.0mg·l^-1的6-ba和1.5mg·l^-1的2,4-d的b5培养基中。之后统计诱导率，以确定适宜的低温预处理条件。

2.3.2短期热激处理

将开花前2-3d的直径为2～2.5mm大葱花蕾，剪去花柄，在超净工作台上用75％的酒精溶液表面消毒处理30s，转入有效浓度2％(体积比)的次氯酸钠溶液消毒15min，然后用无菌水冲洗3～5遍，最后用灭菌滤纸吸干表面水分，接种在加有浓度为1.0mg·l^-1的6-ba和1.5mg·l^-1的2,4-d的b5培养基中。将培养皿置于35℃的恒温培养箱进行0(ck)、12、24、36、48h的短期热激处理，之后移至光照组培室继续进行培养。之后统计出愈率及褐化率，以确定适宜的热激处理条件。

培养条件：温度(25±2)℃，光照30μmol·m^-2·s^-1，16h·d^-1。

所有诱导培养基均添加100g·l^-1蔗糖和7g·l^-1琼脂，用naoh溶液调至ph5.8，并于高压自动灭菌锅121℃灭菌20min。培养基用直径90mm的培养皿9+1分装，每皿约30ml，parafilm膜封口。每皿接种花蕾20个。

5个月后统计成胚数和成胚率，结果如表2所示。

表3不同预处理对大葱雌核发育的影响(b5培养基)

注：每个处理接种400个花蕾，即一个处理就是做20个培养皿。

从表3可以看出：对大葱雌核发育的最佳处理方式为：3d的低温预处理(4℃冰箱)。

2.4优化条件下，b5和ms对离体雌核诱导单倍体的诱导率的影响

将开花前2-3d的鲁葱杂5号大葱花蕾移至4℃的冰箱中，进行3d的低温预处理，处理结束后将子房接种到添加有1.0mg·l^-12,4-d和1.0mg·l^-16-ba的b5培养基和添加有1.0mg·l^-12,4-d和1.5mg·l^-16-bams诱导培养基中在进行对比试验，其结果如表4所示。由表4可以看出，在添加了外源激素1.0mg·l^-12,4-d和1.0mg·l^-16-ba的b5培养基中，其雌核发育胚总诱导率可达8％。在ms培养基中添加1.0mg·l^-12,4-d和1.5mg·l^-16-ba时，其雌核发育胚总诱导率最高，可达10％，表明这两种培养基比较适合大葱离体雌核发育诱导成胚，其中ms培养基更适合大葱离体雌核诱导单倍体。

表4不同培养基对大葱雌核发育的影响

2.5植株再生及倍性鉴定

将胚状体转移到没添加外源激素的含有30g·l^-1蔗糖的b5培养基中，发育成完整植株。然后将其驯化移栽成活率达到100％。

以正常二倍体(2n＝2x＝16，图3)大葱为对照，对试验所得再生植株进行根尖细胞染色体数进行分析，发现再生植株的根尖染色体细胞含有8条染色体(n＝x＝8，图4)，即为单倍体植株。

3讨论与结论

本项研究以大葱未开放花蕾为外植体成功获得了单倍体植株。接种时供体材料取样时间不同，胚囊的发育阶段不同。从表1-2可以看出，不同的胚囊发育阶段胚状体的诱导率差异很大。当花蕾直径为2.0～2.5mm时，比花蕾直径为2.5～3.5mm单倍体成功率明显高。

大葱离体雌核诱导单倍体试验成功与否，培养基和外源激素的添加起着至关重要的作用。本实验主要采用了b5和ms基本培养基添加不同浓度的2,4-d和6-ba进行培养，筛选出的适宜培养基为ms+1.0mg·l^-12,4-d+1.5mg·l^-16-ba以及b5+1.0mg·l^-12,4-d+1.0mg·l^-16-ba，这两种培养基能有效地刺激离体雌核的发育，其中ms+1.0mg·l^-12,4-d+1.5mg·l^-16-ba的诱导效果更好。

大葱的预处理方式也关系到大葱离体雌核诱导单倍体试验成功与否，经过实验证明：对大葱雌核发育的最佳处理方式为：3d的低温预处理(4℃冰箱)。