一种银杏胚乳诱导胚性愈伤组织的方法与流程

本发明涉及银杏组培技术领域，具体涉及一种银杏胚乳诱导胚性愈伤组织的方法。

背景技术

银杏(ginkgobilobal.)是从侏罗纪存活下来的孑遗植物，被称为“活化石”。银杏叶中的次生代谢产物具有抗氧化、治疗心血管疾病等作用，具有的高度商业价值和科研价值，使其成为集科学研究、医药保健、观赏、生态防护、材用于一体的热点研究树种之一。良种是工业原料林高产优质的基础，体细胞胚培养技术是快速、省力、规模化繁育林木良种的最有效无性繁殖技术，目前火炬松、杂交马褂木等林木成熟的体细胞胚发生技术体系已经建立，实现了林木新品种的规模化繁育。但银杏目前主要的繁育技术仍然是种子、扦插和嫁接繁殖，还没有完全建立繁殖快、规模大、频率高的体细胞再生体系，而诱导具有高度胚性发生能力的愈伤组织是建立银杏体细胞胚培养体系的关键一步。另外银杏种子成熟时(9月份)胚还没有完全形成，而银杏的胚乳从授粉后就开始生长，比胚发育周期早而长，是研究银杏胚性愈伤诱导很好的材料。

技术实现要素：

发明目的：针对目前银杏体细胞发生体系还没有完全建立，不能够用体细胞胚发生途径进行银杏无性快速繁殖，这严重阻碍了银杏良种的繁育、推广的进程，更严重地阻碍了遗传转化技术在银杏上的开展，也影响了银杏工业原料林的快速发展。本发明的目的是提出一种银杏胚乳诱导胚性愈伤组织的方法，采用组织培养的方法对银杏胚乳进行诱导，建立银杏胚乳胚性愈伤组织的诱导技术体系，为银杏体细胞胚发生、发育研究提供材料，同时也为银杏体细胞胚的大量繁育提供技术支持，具有重要的实际意义。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种银杏胚乳诱导胚性愈伤组织的方法，包括以下步骤：

1)选取银杏果实，进行去污、去果皮、种子清洗、种子消毒处理，备用；

2)从已消毒过的银杏种子里取出胚乳，切取1-2mm厚胚乳表皮切片接种在愈伤组织诱导培养基上进行培养，胚乳带表皮面朝上；胚乳切片培养10d后表皮开始褐化，15d后胚乳切片周围接触培养基的褐化处开始长出绿色颗粒突起，即为愈伤组织；

其中，愈伤组织诱导培养基为：ms+1.5mg/lnaa+1.0mg/l6-ba+0.25g/lmes+0.2g/l谷氨酸，或ms+1.5mg/lnaa+1mg/l6-ba；

3)初代培养30d后，将带愈伤组织的胚乳切片转接到原新鲜培养基上继代一次，再培养30d；此时愈伤组织体积会继续增加到2～2.5cm³；

4)将愈伤组织从原胚乳切片上取下，转接到胚性愈伤组织诱导培养基中，培养30d，再继代一次后，就会发现胚乳愈伤组织中带有黄白色、圆球状、椭圆状的胚性愈伤组织；

其中，胚性愈伤组织诱导培养基为ms+1.5mg/lnaa+1.0mg/l6-ba+0.25g/lmes+0.2g/l谷氨酸，或ms+1.5mg/lnaa+1mg/l6-ba，或ms+1.0mg/lnaa+1.0mg/lkt。

2、根据权利要求1所述的银杏胚乳诱导胚性愈伤组织的方法，其特征在于：步骤1)中，果实采集时期为：6月上旬，8月下旬或9月中旬。

步骤1)中，去污、去果皮的方法为：用高枝剪剪取30～40年生银杏树带果实的枝条，摘取果实后，用肥皂水将果实清洗并浸泡10min，并用软毛刷刷去表面污渍，再用流水冲洗2h后，用刀片剥开果实，取出带壳种子，备用。

步骤1)中，种子清洗的方法为：取带硬壳的种子用肥皂水清洗并浸泡5min，并用软毛刷刷去表面污渍，再用流水冲洗半小时后，备用。

步骤1)中，种子的消毒为：带硬壳的种子或整个果实(6月份果实的果皮与种子没有完全分离，取整个带果皮的银杏果实进行消毒)在超净工作台上先用70％酒精对种子(果实)浸泡60s，再用无菌水冲洗2-3次，然后用84消毒液与无菌水1∶1的混合液浸泡20min，期间不断搅拌，再用无菌水清洗3-4次，无菌滤纸吸干表面水分待用。

步骤2)中，胚乳切片接种方式为：先用剥壳夹夹住种子，用镊子取出种子，将去除种皮的胚乳横放在已过灭菌的滤纸上，用无菌手术刀片沿表皮横切1-2mm后的薄片，将其平放在培养基上，胚乳带表皮面朝上。

步骤3)中，胚乳切片继代的方法为：将边缘带有绿色突起愈伤组织的胚乳切片一起转接到新鲜的培养基上，带表皮面朝上。

步骤4)中，愈伤组织转接的方法为：用无菌刀片从带胚乳切片上的愈伤组织轻轻切下，每块愈伤组织大约0.5cm³，接种到新鲜的培养基上进行胚性愈伤组织的诱导。

所述的银杏胚乳胚性愈伤组织的诱导方法，在培养基中均添加4％蔗糖、0.6％琼脂，ph5.8。

所述的银杏胚乳胚性愈伤组织的诱导方法，培养温度为25±2℃，光照时间14h·d^-1，光照强度55μmolm^-2s^-1。

有益效果：与现有技术相比，本发明的银杏胚乳胚性愈伤组织的诱导方法，采用植物组织培养的方法对银杏胚乳进行诱导，建立银杏胚性愈伤组织的诱导技术体系。该方法愈伤组织诱导率达81.5～100％以上，胚性愈伤组织诱导率达45～75％以上，为胚乳体细胞胚发生、发育研究提供研究材料，同时也为银杏体细胞胚的诱导技术提供参考，解决银杏目前在良种无性系繁育与推广、遗传转化技术上存在的瓶颈，具有重要推广应用和理论研究价值。

附图说明

图1是8月下旬银杏果实、种子图；

图2是8月银杏胚乳切片培养及胚乳切片诱导的愈伤组织图；

图3是8月下旬银杏胚乳切片诱导的胚性愈伤组织图；

图4是9月中旬银杏果实、种子图；

图5是9月中旬银杏胚乳切片诱导的愈伤组织图；

图6是9月中旬银杏胚乳切片诱导的胚性愈伤组织图；

图7是6月银杏果实、种子图；

图8是6月份胚乳切片接种、胚乳愈伤组织诱导图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

一种银杏胚乳诱导胚性愈伤组织的方法，包括以下步骤：

1)银杏果实的采摘与预处理：8月下旬用高枝剪剪取30～40年生银杏树带果实的枝条，摘取果实后，用刀片剥开果实，取出带壳种子，备用(见图1)。

2)种子的处理与消毒：将带硬壳的种子用肥皂水清洗并浸泡5min，并用软毛刷刷去表面污渍，再用流水冲洗半小时后，将带硬壳的种子在超净工作台上用70％酒精对种子浸泡60s，再用无菌水冲洗2-3次，然后用84消毒液与无菌水1∶1的混合液浸泡20min，期间不断搅拌，再用无菌水清洗3-4次，无菌滤纸吸干表面水分待用。

3)胚乳外植体的接种与初代培养：从已消毒过的银杏种子里取出胚乳，切取1-2mm厚胚乳表皮切片接种在ms+1.5mg/lnaa+1.0mg/l6-ba+0.25g/lmes+0.2g/l谷氨酸的愈伤组织诱导培养基上进行培养，胚乳带表皮面朝上。胚乳切片培养10d后表皮开始褐化(图2a)，15d后胚乳切片周围接触培养基的褐化处开始长出绿色颗粒突起，即为愈伤组织(图2b)，以后愈伤组织体积逐渐加大(图2c)，愈伤组织诱导率达87.5％。

4)愈伤组织的继代增殖：初代培养30d后，将带愈伤组织的胚乳切片转接到ms+1.5mg/lnaa+1.0mg/l6-ba+0.25g/lmes+0.2g/l谷氨酸的培养基上继代一次，再培养30d，此时愈伤组织体积会继续增加到2cm³左右(图2d)。

5)胚性愈伤组织的诱导：将愈伤组织从原胚乳切片上取下，转接到ms+1.5mg/lnaa+1.0mg/l6-ba+0.25g/lmes+0.2g/l谷氨酸的胚性愈伤组织诱导培养基中，培养30d后再继代一次，可见胚乳愈伤组织中带有黄白色、圆球状、椭圆状的胚性愈伤组织(图3箭头方向)，胚性愈伤组织诱导率达75％。

步骤2)、步骤3)、步骤4)所述的培养基中均含4％蔗糖、0.6％琼脂，ph5.8左右，培养室温度为25±2℃，光照时间14h.d^-1，光照强度55μmolm^-2s^-1。

实施例2

一种银杏胚乳胚性愈伤组织的诱导方法，包括以下步骤：

1)银杏果实的采摘与预处理：8月下旬用高枝剪剪取30～40年生银杏树带果实的枝条，摘取果实后，用刀片剥开果实，取出带壳种子，备用(见图1)。

2)种子的处理与消毒：将带硬壳的种子用肥皂水清洗并浸泡5min，并用软毛刷刷去表面污渍，再用流水冲洗半小时后，将带硬壳的种子在超净工作台上用70％酒精对种子浸泡60s，再用无菌水冲洗2-3次，然后用84消毒液与无菌水1∶1的混合液浸泡20min，期间不断搅拌，再用无菌水清洗3-4次，无菌滤纸吸干表面水分待用。

3)胚乳外植体的接种与初代培养：从已消毒过的银杏种子里取出胚乳，切取1-2mm厚胚乳表皮切片接种在ms+1.5mg/lnaa+1.0mg/l6-ba愈伤组织诱导培养基上进行培养，胚乳带表皮面朝上。胚乳切片培养10d后表皮开始褐化，15d后胚乳切片周围接触培养基的褐化处开始长出绿色颗粒突起，即为愈伤组织，以后愈伤组织体积逐渐加大，愈伤组织诱导率达81.5％。

4)愈伤组织的继代增殖：初代培养30d后，将带愈伤组织的胚乳切片转接到ms+1.5mg/lnaa+1.0mg/l6-ba上继代一次，再培养30d。此时愈伤组织体积会继续增加到2cm³左右。

5)胚性愈伤组织的诱导：将愈伤组织从原胚乳切片上取下，转接到ms+1.5mg/lnaa+1mg/l6-ba的胚性愈伤组织诱导培养基中，培养30d后，可见胚乳愈伤组织中带有黄白色、圆球状、椭圆状的胚性愈伤组织，胚性愈伤组织诱导率达65％。

步骤2)、步骤3)、步骤4)所述的培养基中均含4％蔗糖、0.6％琼脂，ph5.8左右，培养室温度为25±2℃，光照时间14h.d^-1，光照强度55μmolm^-2s^-1。

实施例3

一种银杏胚乳诱导胚性愈伤组织的方法，包括以下步骤：

1)银杏果实的采摘与预处理：9月中旬取30～40年生银杏树带果实的枝条，摘取果实后，用刀片剥开果实，取出带壳种子，备用(见图4)。

2)种子的处理与消毒：将带硬壳的种子用肥皂水清洗并浸泡5min，并用软毛刷刷去表面污渍，再用流水冲洗半小时后，将带硬壳的种子在超净工作台上用70％酒精对种子浸泡60s，再用无菌水冲洗2-3次，然后用84消毒液与无菌水1∶1的混合液浸泡20min，期间不断搅拌，再用无菌水清洗3-4次，无菌滤纸吸干表面水分待用。

3)胚乳外植体的接种与初代培养：用夹子将硬壳夹开，剥去硬壳，从已消毒过的银杏种壳里取出胚乳，切取1-2mm厚胚乳表皮切片接种在ms+1.5mg/lnaa+1.0mg/l6-ba+0.25g/lmes+0.2g/l谷氨酸的愈伤组织诱导培养基上进行培养，胚乳带表皮面朝上。胚乳切片培养10d后表皮开始褐化，15d后胚乳切片周围接触培养基的褐化处开始长出绿色颗粒突起，即为愈伤组织(图5a)，以后愈伤组织体积逐渐加大(图5b)，愈伤组织诱导率达85％。

4)愈伤组织的继代增殖：初代培养30d后，将带愈伤组织的胚乳切片转接到ms+1.5mg/lnaa+1.0mg/l6-ba+0.25g/lmes+0.2g/l谷氨酸上继代一次，再培养30d。此时愈伤组织体积会继续增加到2cm³左右。

5)胚性愈伤组织的诱导：将愈伤组织从原胚乳切片上取下，转接到ms+1.0mg/lnaa+1.5mg/lkt的胚性愈伤组织诱导培养基中，培养30d后，可见胚乳愈伤组织中带有黄白色、圆球状、椭圆状的胚性愈伤组织(图6)，胚性愈伤组织诱导率达50％。

步骤2)、步骤3)、步骤4)所述的培养基中均含4％蔗糖、0.6％琼脂，ph5.8左右，培养室温度为25±2℃，光照时间14h.d^-1，光照强度55μmolm^-2s^-1。

实施例4

一种银杏胚乳诱导胚性愈伤组织的方法，包括以下步骤：

1)银杏果实的采摘与预处理：6月中旬剪取30～40年生银杏树带果实的枝条，摘取果实后，用肥皂水将果实清洗并浸泡10min，并用软毛刷刷去表面污渍，再用流水冲洗2h(见图7)。

2)银杏果实的消毒：将整个果实在超净工作台上先用70％酒精对种子(果实)浸泡60s，再用无菌水冲洗2-3次，然后用84消毒液与无菌水1∶1的混合液浸泡20min，期间不断搅拌，再用无菌水清洗3-4次，无菌滤纸吸干表面水分待用。

3)胚乳剥取：在超净工作台下，用无菌刀片先将果实的外果皮剥除，用无菌镊子将内部的种子(种皮还没有硬化)取出放置在已灭菌的滤纸上，切取1-2mm厚胚乳表皮切片接种在ms+1.5mg/lnaa+1.0mg/l6-ba或dcr+1.5mg/lnaa+0.5mg/l6-ba愈伤组织诱导培养基上进行培养，胚乳切片平放在培养基上，带表皮面朝上。胚乳切片培养10d后表皮周围开始裂开，15d后胚乳切片整个开始膨化，产生疏松状的愈伤组织(图8)，以后愈伤组织体积逐渐加大，30天后愈伤组织诱导率达100％。

4)愈伤组织的继代增殖：初代培养30d后，将带愈伤组织的胚乳切片转接到ms+1.5mg/lnaa+1.0mg/l6-ba上继代一次，再培养30d。此时愈伤组织体积会继续增加到3.5cm³左右，但该愈伤组织疏松状易褐化。

5)胚性愈伤组织的诱导：将愈伤组织从原胚乳切片上取下，转接到ms+1.0mg/lnaa+1.0mg/lkt的胚性愈伤组织诱导培养基中，培养30d后，可见胚乳愈伤组织中带有黄白色、圆球状、椭圆状的胚性愈伤组织，胚性愈伤组织诱导率达45％。

步骤2)、步骤3)、步骤4)所述的培养基中均含4％蔗糖、0.6％琼脂，ph5.8左右，培养室温度为25±2℃，光照时间14h.d^-1，光照强度55μmolm^-2s^-1。