一种防治抗性鳞翅目害虫的方法与流程

本发明涉及一种防治抗性鳞翅目害虫的方法，属于植物保护和农药学领域。

背景技术：

茚虫威(indoxacarb)是由美国杜邦公司开发、第一个商品化的二嗪类杀虫剂。茚虫威化学名称为7-氯-2，3，4a，5-四氢-2-[甲氧基羰基(4-三氟甲氧基苯基)氨基甲酰基]茚并[1，2-e][1，3，4]恶二嗪-4a-羧酸甲酯，是一种新型na⁺通道抑制剂，与目前其他类杀虫剂作用机制不同。wing等(1998)利用高效液相色谱和质谱分析技术研究了¹⁴c标记的茚虫威在鳞翅目昆虫体内的代谢活性，结果发现，茚虫威被昆虫摄入后，在脂肪体特别是中肠中迅速代谢为杀虫活性更强的n-去甲氧羰基代谢物(dcjw)。gondhalekar等(2016)也运用液相色谱和质谱分析技术分析了茚虫威在德国小蠊内的基于水解酶的生化反应，茚虫威可以在虫体内转化成毒性更强的代谢产物(dcjw)。李富根等(2014)利用液相色谱-三重四级杆串联质谱分析技测定了小菜蛾对茚虫威的活化代谢活性的差异。发现茚虫威在小菜蛾体内很容易发生水解反应，而这个活化代谢过程需要酯酶或酰胺酶的催化。神经生理学研究表明，茚虫威在昆虫体内代谢为dcjw，不可逆阻断钠离子通道，从而导致靶标昆虫运动失调、停止取食、麻痹并死亡。由于茚虫威在昆虫体的作用机制独特，对鳞翅目害虫具有卓越的杀虫活性，且对非靶标生物安全，是替代有机磷类和拟除虫菊酯类杀虫剂防治鳞翅目害虫的理想品种。常被用于防治十字花科蔬菜上的鳞翅目害虫，棉铃虫，稻纵卷叶螟，以及作为卫生杀虫剂，用于防治蜚蠊等。

甲氧虫酰肼是继抑食肼、虫酰肼之后，一种高效的酰肼类杀虫剂，并先后在美国和中国获得正式登记。它的杀虫机理独特、对靶标生物的选择性好，对环境比较安全，对鳞翅目害虫比同类产品效果更好，毒力更强，活性谱更广，是害虫综合防治的优选药剂，主要被用于杀灭蔬菜、果树、粮食作物和经济作物上的鳞翅目害虫。

负交互抗性(negativelycorrelatedcross-resistance)与交互抗性相反，对某种药剂有抗性的害虫种群，对另外一种药剂反而敏感性加大，称负交互抗性。例如一种萝卜蝇对滴滴涕具有抗性，但对苯硫脲(ptu)却变得十分敏感。日本学者报道，对氰戊菊酯有抗性的褐飞虱(nilaparvatalugens)对马拉硫磷变得更加敏感，氰戊菊酯对马拉硫磷抗性稻叶蝉的毒力较敏感种群高4.3倍。这些负交互抗性的例子对于害虫抗性治理有重大意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对棉铃虫等鳞翅目害虫对茚虫威或甲氧虫酰肼产生抗性后的抗性治理技术的开发应用，解决棉铃虫等鳞翅目害虫的防治问题。通过茚虫威和甲氧虫酰肼负交互抗性的研究，开发一种经济高效的鳞翅目害虫抗药性治理的方法。

室内敏感种群棉铃虫经茚虫威抗性选育，获得抗性倍数为4.4倍的茚虫威抗性选育种群。敏感种群棉铃虫经甲氧虫酰肼抗性选育，获得抗性倍数为4.9倍的甲氧虫酰肼抗性选育种群。根据交互抗性原理，以室内敏感种群、茚虫威抗性选育种群、甲氧虫酰肼抗性选育种群为试虫，测定药剂间的交互抗性情况，结果表明：茚虫威抗性种群棉铃虫提高了对甲氧虫酰肼的敏感度，即甲氧虫酰肼对茚虫威抗性棉铃虫的毒力高于敏感种群。同样，茚虫威对甲氧虫酰肼抗性种群棉铃虫的毒力亦高于敏感种群。室内测定结果表明：茚虫威和甲氧虫酰肼存在负交互抗性。

本发明通过从邯郸、廊坊、沂水、安丘和保定5个棉花产区采集棉铃虫，采用浸叶法测定了不同地理种群棉铃虫对茚虫威和甲氧虫酰肼的抗药性，结果表明，茚虫威对邯郸、廊坊、保定、安丘和沂水种群棉铃虫的lc50分别是：176.9、39.8、13.1、5.0和10.2mg/l。与室内敏感种群相比，邯郸种群和廊坊种群对茚虫威的抗性倍数分别是28.4和6.4倍，为中等和低水平抗性。保定种群、安丘种群和沂水种群目前对茚虫威抗性倍数＜3，尚处于敏感阶段。甲氧虫酰肼对邯郸、廊坊、保定、安丘和沂水种群棉铃虫的lc50分别是：128.2、560.7、2526.4、776.3和1343.6mg/l。保定种群、沂水种群和安丘种群对甲氧虫酰肼的抗性倍数分别为33.8、18.0和10.4倍，为中等抗性水平；廊坊种群对甲氧虫酰肼的抗性倍数为7.5倍，为低水平抗性；邯郸种群对甲氧虫酰肼的抗性倍数仅为1.7倍，为敏感阶段。对茚虫威抗性水平最高的邯郸种群棉铃虫对甲氧虫酰肼最敏感，而对甲氧虫酰肼抗性水平较高的棉铃虫种群(如保定、沂水、安丘)对茚虫威却很敏感。因此，茚虫威和甲氧虫酰肼对田间种群同样表现为负交互抗性。

当鳞翅目害虫对茚虫威的抗性倍数＜5倍时，甲氧虫酰肼的有效成分用量为6-1000克/公顷，优选为30-200克/公顷；当鳞翅目害虫对茚虫威的抗性倍数为5-10倍时，甲氧虫酰肼的有效成分用量为4-1000克/公顷，优选为20-200克/公顷；当鳞翅目害虫对茚虫威的抗性倍数为10-40倍时，甲氧虫酰肼的有效成分用量为3-1000克/公顷，优选为15-200克/公顷；当鳞翅目害虫对茚虫威的抗性倍数＞40倍时，甲氧虫酰肼的有效成分用量为2-1000克/公顷，优选为10-200克/公顷。

当鳞翅目害虫对甲氧虫酰肼的抗性倍数＜5倍时，茚虫威的有效成分用量为4-500克/公顷，优选为20-100克/公顷；当鳞翅目害虫对甲氧虫酰肼的抗性倍数为5-10倍时，茚虫威的有效成分用量为3-500克/公顷，优选为15-100克/公顷；当鳞翅目害虫对甲氧虫酰肼的抗性倍数为10-40倍时，茚虫威的有效成分用量为2-500克/公顷，优选为10-100克/公顷；当鳞翅目害虫对甲氧虫酰肼的抗性倍数＞40倍时，茚虫威的有效成分用量为1-500克/公顷，优选为5-100克/公顷。

生化代谢机制研究表明：接触药剂1h后，茚虫威及其活化代谢产物(n-去甲氧羰基代谢产物(dcjw))在甲氧虫酰肼抗性种群中的含量与敏感种群相当，且显著高于茚虫威抗性选育种群和茚虫威田间抗性种群。反应2h时，茚虫威及dcjw在甲氧虫酰肼抗性种群中的含量显著高于敏感种群及茚虫威抗性种群。活性成分茚虫威及dcjw在甲氧虫酰肼抗性种群内的积累是导致甲氧虫酰肼抗性棉铃虫对茚虫威更敏感的原因。从而明确了茚虫威和甲氧虫酰肼表现负交互抗性的生化机制。

同时，复配增效试验结果表明：茚虫威和甲氧虫酰肼复配，尤其当二者的质量比为50～11∶1时，对棉铃虫具有显著的增效作用。因此，可以将茚虫威和甲氧虫酰肼复配使用，防治对茚虫威或甲氧虫酰肼产生抗药性的鳞翅目害虫。从而减少化学农药使用量，延长农药使用寿命，提高防治效果。

本发明是这样实现的：

茚虫威抗药性选育种群：将茚虫威原药用二甲基甲酰胺(dmf)配制成1％的母液，然后用0.05％的曲拉通x-100水溶液稀释到一定浓度。将油菜叶片洗净晾干，在药液中浸渍10s后取出晾干，放入底部加有消毒滤纸的培养皿(150mm)中，接入棉铃虫初孵幼虫，每皿200头，3次重复；另设3皿溶剂对照，每皿200头。处理3d后记录死亡率，并将活虫移至人工饲料中饲养。每代选育控制幼虫校正死亡率在50％～80％之间，并参考每代棉铃虫的生长发育情况调整下一次选育情况，逐渐提高药剂选育浓度，茚虫威的汰选浓度为1-8mgl^-1。每汰选2～3代进行一次毒力测定，确定茚虫威对棉铃虫的毒力。经13代11次汰选，茚虫威对棉铃虫的lc50值由8.1升高到35.4mgl^-1。由此得到对茚虫威抗性倍数为4.4倍的抗性选育种群。

甲氧虫酰肼抗药性选育种群：抗性选育方法同上，敏感种群棉铃虫经甲氧虫酰肼抗性选育，甲氧虫酰肼对棉铃虫的lc50值由83.7升高到408.0mgl^-1。获得抗性倍数为4.9倍的甲氧虫酰肼抗性选育种群。

田间棉铃虫种群：分别从河北邯郸、河北廊坊、河北保定、山东沂水、和山东安丘五个地区的棉花田采集棉铃虫种群。

茚虫威与甲氧虫酰肼的负交互抗性试验：

茚虫威与甲氧虫酰肼的负交互抗性试验采用浸叶法进行，将茚虫威和甲氧虫酰肼原药分别溶于dmf中，配制成1％的母液。将上述母液用以0.05％的曲拉通x-100稀释，配制5～7个药剂浓度，分别测定2种药剂对敏感种群、茚虫威汰选种群、甲氧虫酰肼汰选种群的毒力。

试验结果见图1。结果表明：茚虫威抗性选育棉铃虫对甲氧虫酰肼的敏感性超过室内敏感种群，同样棉铃虫对甲氧虫酰肼产生抗性后也提高了对茚虫威的敏感度。茚虫威和甲氧虫酰肼表现出负交互抗性。

表1.不同棉铃虫种群对茚虫威和甲氧虫酰肼的抗性

^b茚虫威抗性倍数＝lc50/lc50(甲氧虫酰肼选育种群)

^c甲氧虫酰肼抗性倍数＝lc50/lc50(茚虫威选育种群)

田间种群棉铃虫对杀虫剂的抗药性测定：采用杀虫剂抗性行动委员会(irac，1990)推荐的叶片药膜法，分别测定杀虫剂对室内敏感种群和田间种群的毒力指数。将茚虫威、阿维菌素、甲氧虫酰肼、氰氟虫腙、氟虫脲、溴虫腈、氯虫苯甲酰胺、乙基多杀菌素、毒死蜱和丁硫克百威原药先溶于dmf中，配制成1％的母液。将上述母液用0.05％的曲拉通x-100稀释，配制5～7个药剂浓度。将直径2cm的油菜叶圆片在药液中浸渍10s，取出晾干放入10孔盒中，接入大小一致的3龄初幼虫。每处理重复3次，每重复10头试虫。72h检查死亡虫数，以解剖针轻触虫体，不能正常反应视为死亡。采用dpsversion7.05软件计算毒力回归方程和lc50，计算每种药剂的抗性倍数。抗性倍数＝田间种群的lc50/敏感种群lc50。

试验结果表明：茚虫威对邯郸、廊坊、保定、沂水、和安丘的棉铃虫的lc50分别为176.9、39.8、13.1、10.2和5.0mgl^-1。与室内敏感种群相比，邯郸种群棉铃虫对茚虫威的抗性水平最高，抗性倍数是28.4倍，为中等水平抗性。然而，邯郸种群棉铃虫对甲氧虫酰肼却最敏感。邯郸种群棉铃虫对甲氧虫酰肼的抗性倍数仅为1.7倍。保定、沂水、阿克苏种群棉铃虫对茚虫威敏感(抗性倍数＜3)，但3个种群对甲氧虫酰肼却表现为中等水平抗药性(抗性倍数分别为33.8、18.0、和10.4倍)。邯郸种群棉铃虫对氰氟虫腙的抗性倍数也高达17.1倍(图1)。说明茚虫威和氰氟虫腙可能存在交互抗性。邯郸种群棉铃虫对氯虫苯甲酰胺也产生了中等水平抗性，抗性倍数高达23.3倍。5个田间种群棉铃虫对阿维菌素、溴虫腈和乙基多杀菌素均处于敏感水平。由田间数据我们可以发现：只有茚虫威和甲氧虫酰肼表现为明显的负交互抗性。

茚虫威与甲氧虫酰肼表现负交互抗性的生化代谢机制研究：具体方法：制备反应缓冲液：0.1mol/lph6.8乙酸铵溶液，加入6.75mmol/l茚虫威丙酮溶液40μl(茚虫威终浓度为90μmol/l)。再加入1ml中肠酶液启动反应，反应总体积为3ml。在30℃振荡器中震荡恒温反应1h后，加入3ml冰冷的乙酸乙酯终止反应。稍作振荡后，下层水相分别用2ml，1ml乙酸乙酯依次萃取，收集上层溶剂相，收集液经过氮吹浓缩后，用400μl色谱纯乙腈定容，并转移至1ml进样小瓶，以备超高相液相色谱进行分析。实验设不加底物的酶液对照和不加酶液的底物对照。本研究以每分钟每毫克蛋白产生的dcjw皮摩尔数表示其代谢的活性。

试验结果如表2，甲氧虫酰肼选育种群的n-去甲氧羰基代谢反应活性在1h时与敏感种群无显著差异，但却显著高于茚虫威选育种群和茚虫威田间抗性种群。离体反应2h后，甲氧虫酰肼选育种群的dcjw活性显著高于敏感种群和抗性种群。同等时间内，产生更多高活性的产物dcjw，从而导致甲氧虫酰肼抗性种群对茚虫威表现更敏感。

表2不同棉铃虫种群对茚虫威的n-去甲氧羰基代谢反应活性比较

结果表明：反应2h后，母体化合物茚虫威及高活性代谢产物dcjw在甲氧虫酰肼抗性棉铃虫中的含量显著高于敏感种群及茚虫威抗性种群(图2)。活性成分的积累进一步证明棉铃虫对甲氧虫酰肼产生抗性后反倒对茚虫威更加敏感。从而在生化代谢水平上证明了茚虫威和甲氧虫酰肼存在负交互抗性的机制。

茚虫威与甲氧虫酰肼复配增效试验：分别采用上述的浸叶法，测定茚虫威、甲氧虫酰肼单剂及复配混剂的lc50，采用孙云沛法计算混剂的共毒系数(ctc值)。共毒系数ctc计算公式如下：(以茚虫威为标准药剂，其毒力指数为100)；

甲氧虫酰肼的毒力指数(ti)＝茚虫威lc50/甲氧虫酰肼lc50×100

m的真实毒力指数(ati)＝茚虫威lc50/m的lc50×100

m的理论毒力指数(tti)＝茚虫威的ti×p茚虫威+甲氧虫酰肼的ti×p甲氧虫酰肼

m的共毒系数(cmc)＝m的ati/m的tti×100。

式中：

m为茚虫威和甲氧虫酰肼不同配比的混合物

p茚虫威为茚虫威在混剂中所占的比例

p甲氧虫酰肼为甲氧虫酰肼在混剂中所占的比例。

茚虫威和甲氧虫酰肼复配增效试验结果见表3。结果表明：当茚虫威与甲氧虫酰肼的质量比为50～11∶1时，对敏感种群及廊坊种群棉铃虫(对茚虫威抗性倍数为6.4，对甲氧虫酰肼抗性倍数为7.5)的共毒系数均明显高于120，表现为显著的增效作用。尤其以茚虫威∶甲氧虫酰肼为50∶1时，增效作用最大。因此，茚虫威与甲氧虫酰肼复配可以显著提高对抗性害虫的致死率，提高对棉铃虫的防治效果，延缓棉铃虫对杀虫剂抗药性的发展速度。

表3茚虫威与甲氧虫酰肼配比为50∶1和20∶1时对棉铃虫的室内毒力的影响

附图说明

图1.5个田间种群棉铃虫对茚虫威、甲氧虫酰肼等10种杀虫剂的抗性倍数

(hdp：邯郸种群；lfp：廊坊种群；bdp：保定种群；aqp：安丘种群；ysp：沂水种群)

图2.茚虫威和dcjw在棉铃虫不同种群中的含量

(红色线(离体n-去甲氧羰基代谢反应1h)，黑色线(离体n-去甲氧羰基代谢反应2h))

具体实施方式：

以下是本发明的实施例，但本发明的内容并不局限于此。实施例的详细步骤同发明内容部分所述。

制剂实施例一：30.6％茚虫威·甲氧虫酰肼悬浮剂

按上述配方称取定量的原药、助剂及水加入砂磨机中，在2000r/min的砂磨条件下，工作3h，即可得到稳定合格的30.6％茚虫威·甲氧虫酰肼悬浮剂。

实施例二：甲氧虫酰肼对茚虫威抗性小菜蛾的田间防治效果

根据小菜蛾对茚虫威的抗药性调查，结果表明北京市大兴区礼贤镇蔬菜基地甘蓝小菜蛾对茚虫威产生中等水平抗药性。因此，发明人在北京市大兴区进行了甲氧虫酰肼对茚虫威抗性小菜蛾的田间防效试验。按667m²用水30kg，用电动喷雾器对甘蓝叶片均匀喷雾。每个处理重复4次，每小区面积为50平方米，随机区组排列。喷药前调查幼虫基数，采取5点取样法，并于药后1、3、7和14d分别调查虫口数，计算防效。

结果表明：24％甲氧虫酰肼悬浮剂1500倍稀释液对甘蓝小菜蛾第1、3、7、14天的防效分别为68.3％、87.0％、92.6％、90.1％。

对照单剂30％的茚虫威悬浮剂3000倍液对甘蓝小菜蛾第1、3、7、14天的防效仅为61.9％、69.3％、75.2％、69.6％。

实施例三：茚虫威对甲氧虫酰肼抗性甜菜夜蛾的田间防治效果

根据甜菜夜蛾对甲氧虫酰肼的抗药性调查，结果表明山东省安丘市赵戈镇甜菜夜蛾对甲氧虫酰肼产生中等水平抗药性。因此，发明人在山东省安丘市赵戈镇进行了茚虫威对甲氧虫酰肼抗性甜菜夜蛾的田间防效试验。按667m²用水30kg，用电动喷雾器对大葱叶片均匀喷雾。每个处理重复4次，每小区面积为50平方米，随机区组排列。喷药前调查幼虫基数，采取5点取样法，并于药后1、3、7和14d分别调查虫口数，计算防效。

结果表明：30％茚虫威悬浮剂3000倍液对甜菜夜蛾第1、3、7、14天的防效分别是：86.2％、95.7％、94.3％、91.5％。

24％甲氧虫酰肼悬浮剂1500倍稀释液对甜菜夜蛾第1、3、7、14天的防效仅为48.0％、67.4％、72.6％、74.7％。

实施例四：30.6％茚虫威·甲氧虫酰肼悬浮剂对茚虫威及甲氧虫酰肼抗性棉铃虫的田间防治效果

根据棉铃虫对茚虫威的抗药性调查，结果表明河北省廊坊市棉铃虫对茚虫威和甲氧虫酰肼分别产生6.4倍和7.5倍抗药性。因此，发明人在河北省廊坊市进行了甲氧虫酰肼、茚虫威及30.6％茚虫威·甲氧虫酰肼悬浮剂对抗性棉铃虫的田间防效试验。按667m²用水30kg，用电动喷雾器对棉花叶片均匀喷雾。每个处理重复4次，每小区面积为50平方米，随机区组排列。喷药前调查幼虫基数，采取5点取样法，并于药后1、3、7和14d分别调查虫口数，计算防效。

结果表明：30.6％茚虫威·甲氧虫酰肼悬浮剂(30％茚虫威+0.6％甲氧虫酰肼)对水稀释5000倍对棉铃虫第1、3、7、14天的防效分别为89.5％、93.2％、97.5％、90.7％，尤其是防治7天之后，田间几乎不见害虫踪迹，被危害的缺刻叶片逐渐恢复长势，防治彻底。

24％甲氧虫酰肼悬浮剂1500倍稀释液对棉铃虫第1、3、7、14天的防效分别为50.3％、68.9％、73.6％、75.5％。

30％的茚虫威悬浮剂3000倍液对棉铃虫第1、3、7、14天的防效仅为68.7％、76.4％、77.1％、72.5％。

从上述试验结果可以得知，甲氧虫酰肼单剂对茚虫威抗性小菜表现出优异的防治效果，有利于克服鳞翅目害虫对茚虫威抗药性的发生。茚虫威单剂对甲氧虫酰肼抗性甜菜夜蛾亦表现出优异的防治效果，有利于克服鳞翅目害虫对甲氧虫酰肼抗药性的发生。所以茚虫威和甲氧虫酰肼轮换用药，可以延长农药的使用寿命，适合抗性鳞翅目害虫的防治。

同时，本发明所配制的30.6％茚虫威·甲氧虫酰肼悬浮剂对抗性棉铃虫的防治效果显著高于茚虫威和甲氧虫酰肼单剂。本发明杀虫组合物具有单位用药量少、速效性好、持效期长，延缓抗药性发生的优点。所以本发明的研发及推广会产生重要的经济效益和社会效益，在棉铃虫等鳞翅目害虫的抗药性治理方面具有良好的应用前景。