本发明属于农业养殖技术领域，具体涉及一种增强刺参免疫力饲料的制备方法及增强刺参免疫力饲料在养殖刺参中的应用。
背景技术：
刺参(apostichopusjaponicus)又称仿刺参，习惯上称为海参，隶属于棘皮动物门，海参纲，楯手目，刺参科，仿刺参属，具有很高的经济、药用保健价值。随着人们生活水平的提高和保健意识的增强，对刺参的需求不断增加，从而引发了刺参的过度捕捞，导致刺参自然资源濒临枯竭。为解决需求与资源的矛盾，刺参的人工养殖技术应运而生，并迅速发展，成为我国继中国对虾、扇贝后的又一大养殖品种。然而刺参的大规模无序养殖诱发了刺参病害孽生，严重制约着该产业的健康和可持续性发展。而化学药品和抗生素的过量滥用带来了环境污染，造成了食品安全隐患，破坏了刺参的内稳定和自身免疫反应。因此，寻找安全、有效、健康的免疫增强剂势在必行。
刺参属棘皮动物，与其他无脊椎动物一样，缺乏特异性免疫系统，关键防御机制受细胞免疫应答和非细胞的体液应答调节，依赖天然免疫机制对进入动物体的异物进行识别、排除，或使异物变成无害物质，以及伤口恢复等。提高体腔细胞的活性，对增强刺参免疫反应具有重要的意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种增强刺参免疫力饲料的制备方法及增强刺参免疫力饲料在养殖刺参中的应用。使用该增强刺身免疫力的饲料制备方法制备出的饲料及养殖方法可以提高刺参机体免疫反应，在一定程度上增强刺参抗病能力，并且促进刺参的生长。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种增强刺参免疫力饲料的制备方法，包括以下步骤：基础原料粉碎，加入添加剂制粒，干燥后整粒；
步骤1，基础原料粉碎：所述基础原料包括以下重量份数的原料，其中马尾藻：25～35份，大叶藻：25～35份，海泥：10～20份，海带粉：8～15份，豆粕：5～10份，鱼粉：5～10份，将所述基础原料粉碎，粉碎后所述基础原料粒度小于100目；
步骤2，加入添加剂制粒：向步骤1完成后得到的基础原料中加入添加剂和水，所述添加剂加入量为所述基础原料重量的0.5～2％，所述添加剂为益母草提取物、狗脊提取物中的至少一种；所述水加入量为所述基础原料重量的25～50％；混合均匀后制成直径为0.5～1.5mm的颗粒；
步骤3，干燥、整粒：将步骤2完成后得到的所述颗粒烘干，整粒，得到粒径在40～80目的增强刺参免疫力饲料。
上述技术方案中，所述产品饲料中粗蛋白含量18～22％，粗脂肪含量2.5～3.5％。
上述技术方案中，所述步骤2采用双螺旋挤压机将混合均匀后的原料挤压成直径为0.8～1mm，长度为1～1.2mm的颗粒。
上述技术方案中，所述步骤3中所述烘干采用鼓风干燥机，烘干温度为40～50℃，烘干时间为20～30min。
上述技术方案中，所述步骤2中所述益母草提取物的制备方法为：益母草超声浸出，氧化铝柱提纯；
益母草超声浸出：向益母草中加入第一溶剂，所述第一溶剂的加入量为所述益母草重量的8～12倍，在超声波发射器中浸出，所述超声频率为100～120khz，浸出时间30～50min，浸出完成后过滤，得到的滤液为益母草浸出液；
氧化铝柱提纯：将所述益母草浸出液浓缩至重量为所述益母草重量的0.8～2倍，浓缩后的益母草浸出液通过氧化铝柱吸附，吸附饱和的氧化铝柱采用其重量15～25倍的水洗脱，洗脱液水浴蒸发干燥，得到的固体干燥物为所述益母草提取物。
上述技术方案中，所述第一溶剂为水，1wt％盐酸溶液，95wt％乙醇溶液或0.1wt％盐酸乙醇溶液。
上述技术方案中，所述超声浸出过程进行两遍，即向第一遍过滤后得到的滤饼中再次加入所述第一溶剂，所述第一溶剂的加入量为所述益母草重量的8～12倍，在超声波发射器中浸出，所述超声频率为100～120khz，浸出时间30～50min，浸出完成后过滤得到的滤液与第一遍过滤得到的滤液合并得到益母草浸出液；
上述技术方案中，所述步骤2中所述狗脊提取物的制备方法为：狗脊超声浸出，树脂柱提纯；
狗脊超声浸出：向狗脊粉末中加入第二溶剂，所述第二溶剂的加入量为所述狗脊粉末重量的5～15倍，在超声波发射器中浸出，所述超声频率为100～120khz，浸出时间30～50min，浸出完成后过滤，将滤液蒸干，向蒸干后的残渣中加入水再次溶解所述残渣，所述加入水的量为所述狗脊粉末重量的8～12倍，再次过滤，得到滤液为狗脊浸出液；
树脂柱提纯：将所述狗脊浸出液投入大孔吸附树脂床层进行吸附，所述狗脊浸出液体积与所述大孔吸附树脂床层体积比为4～6:1，吸附时间60～100min，吸附完成后，吸附饱和的树脂首先采用水洗脱除杂，所述洗脱除杂用水体积与所述大孔吸附树脂床层体积比为2.5～3.5:1，所述洗脱除杂时间为2.5～3.5h，所述洗脱除杂完成后，采用10wt％～20wt％的乙醇水溶液对大孔吸附树脂床层洗脱，所述乙醇水溶液洗脱过程不少于两次，每次所述洗脱用乙醇水溶液体积与所述大孔吸附树脂床层体积比为3～5:1，得到洗脱液合并作为狗脊提取物。
上述技术方案中，所述第二溶剂为丙酮，正丁醇或乙醇，所述大孔吸附树脂为d101型大孔吸附树脂。
一种上述增强刺参免疫力饲料在养殖刺参中的应用，将所述饲料作为饵料，初始投饵量为海参体重的5％,根据每天各箱海参的摄食情况进行适当调整达到饱食投喂,每天投喂1次,投喂时间为17:00,次日8:00吸除残饵和粪便,并补充新鲜海水，饲养期间连续充气,水温控制在(17±0.5)℃,盐度27～29,ph7.8～8.2,溶解氧不低于5mg/l,氨氮不高于0.5mg/l,亚硝氮不高于0.1mg/l。
本发明的优点和有益效果为：
饲料中添加益母草和狗脊提取物对刺参的生长有一定程度的促进作用，能提高机体免疫反应，并在一定程度上增强刺参抗病力。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
棘皮动物的体腔细胞是其参与免疫反应的效应细胞，通过对刺激产生反应，产生吞噬作用，参与机体的免疫功能。体腔细胞在进行吞噬作用时，可被细菌或细菌胞壁组分诱导产生具有杀伤力作用的活性氧自由基如，o2-；nos产生的一氧化氮可以抑制细菌病毒的核酸和蛋白质的代谢，与机体的免疫有相关性。sod是体内重要的抗氧化酶，可以清除体内多余的氧自由基，消除其对于机体本身的危害。因此nos，sod也被看做是反映刺参免疫系统的重要非特异性免疫指标。
吞噬活性的测定取100μl体腔细胞悬液加入96孔板中，贴壁30min，弃上清液。加入100μl0.001m的中性红溶液，吞噬30min后，用生理盐水洗掉未被吞噬的中性红，加入100μl细胞裂解液(冰醋酸：无水乙醇＝1:1，v/v)，裂解20min后，酶标仪测定溶液在波长540nm处的吸光值。以实验条件下每106个体腔细胞对应的吸光值来表示吞噬活性。
体腔细胞o2-产量(cop)的测定在96孔酶标板中加入200μl体腔细胞悬液,然后加入等体积的2mg/ml的nbt(溶在含2％nacl的tris-hcl缓冲液中,ph＝7.6),室温下避光反应1h,300r/min离心10min,去除上清,用等渗缓冲液洗涤3次后加入200μl甲醇,固定10min后750r/min离心10min,去除上清并用50％的甲醇洗涤3次,最后一次离心去除上清后,于室温下晾干。待干燥后,加入240μlkoh(2mol/l)和280μldmso充分溶解。在酶标仪测定溶液在波长630nm的吸光值。
超氧化物歧化酶(sod)和氧化氮合酶(nos)活性测定cls中sod酶活性单位定义为每毫克样品蛋白在1ml反应液中sod抑制率达到50％时所对应的sod量为1个酶活性单位(u),sod活性表示为u/mg蛋白；cls中nos酶活性单位定义为每毫克样品蛋白每分钟生成1nmolno为1个酶活性单位(u),nos活性表示为u/mg蛋白。活性测定使用南京建成试剂盒测定。
实施例一
一种增强刺参免疫力的饲料制备方法，包括以下步骤：基础原料粉碎，加入添加剂制粒，干燥后整粒；
步骤1基础原料粉碎：所述基础原料包括以下重量份数的原料，其中马尾藻：30份，大叶藻：30份，海泥：15份，海带粉：10份，豆粕：8份，鱼粉：7份，将所述基础原料粉碎，粉碎后所述基础原料粒度小于100目；
步骤2加入添加剂制粒：向步骤1完成后得到的基础原料中加入益母草提取物和水，所述益母草提取物加入量分别为所述基础原料重量的0.5％，1％，2％，并依次编号为ⅰ，ⅱ，ⅲ号饲料；所述水加入量为所述基础原料重量的25～50％；混合均匀后采用双螺旋挤压机(f-26(ⅱ)华南理工大学)将混合均匀后的原料挤压成直径为1mm，长度为1～1.2mm的颗粒；
步骤3干燥后整粒：将步骤2完成后得到的所述颗粒在鼓风干燥器中44℃烘干，烘干的饲料粉碎后过筛，取40～80目中间颗粒作为产品饲料，密封保存。
最终所述产品饲料中粗蛋白含量18～22％，粗脂肪含量2.5～3.5％。
采用上述技术方案制作的饲料养殖刺参，将所述饲料作为饵料，初始投饵量为海参体重的5％,根据每天各箱海参的摄食情况进行适当调整达到饱食投喂,每天投喂1次,投喂时间为17:00,次日8:00吸除残饵和粪便,并补充新鲜海水，饲养期间连续充气,水温控制在(17±0.5)℃,盐度27～29,ph7.8～8.2,溶解氧不低于5mg/l,氨氮不高于0.5mg/l,亚硝氮不高于0.1mg/l。
对于判断刺参是否达到饱食喂养，方法为：投喂饲料前后镜检，投喂后半小时镜检，如果胃内饲料颜色明显，下次投喂前镜检胃内仍可见饲料颜色则认为投喂量适宜；若下次投喂前刺参胃内较空则需加大投喂量；若水箱中有残饵则认为投喂过量。
对照组饲料基础原料制作的饲料，制作方法与上述方法基本相同，未加入益母草提取物和狗脊提取物添加剂，养殖刺参的方法完全相同。
8周养殖结束后,对所养殖刺参饥饿24h,然后对每个重复进行计数,称重。取样测定免疫指标。解剖刺参，取其体腔液。吸取抗凝剂[0.068mol/ltris-hcl，0.02mol/ledta，0.48％nacl，0.019mol/lkcl，ph＝7.6，]至抗凝剂与体腔液的体积比为1:1，所得抗凝体腔液，一部分直接用于体腔细胞计数、吞噬活性的测定；然后离心10min(3000r/min，4℃)，弃上清液,体腔细胞沉淀物迅速用冰冻的等渗缓冲液[0.001mol/ledta，0.53mol/lnacl,0.01mol/ltris-hcl,ph＝7.6]调整到2×106细胞/ml。取600μl体腔细胞悬液用于海参体腔细胞o2-产量的测定,其余样品迅速用液氮保存并贮存于-80℃冰箱中用于其他分析。体腔细胞样品于4℃下解冻并加入0.1mmol/lpmsf，用超声波匀浆6s(输出22khz，0℃),离心10min(3000r/min，4℃)。所得上清液即为体腔细胞破碎物上清液(cls),立即用于各项免疫指标的测定。
各项指标见表1。
表1添加益母草提取物对刺参免疫力的影响(
实施例二
一种增强刺参免疫力的饲料制备方法，包括以下步骤：基础原料粉碎，添加剂加入制粒，干燥、整粒；
步骤1基础原料粉碎：所述基础原料包括以下重量份数的原料，其中马尾藻：30份，大叶藻：30份，海泥：15份，海带粉：10份，豆粕：8份，鱼粉：7份，将所述基础原料破碎研磨，研磨后所述基础原料粒度小于100目；
步骤2添加剂加入制粒：向步骤1完成后得到的基础原料中加入狗脊提取物和水，所述狗脊提取物加入量分别为所述基础原料重量的0.5％，1％，2％，并依次编号为ⅳ，ⅴ，ⅵ号饲料；所述水加入量为所述基础原料重量的25～50％；混合均匀后采用双螺旋挤压机(f-26(ⅱ)华南理工大学)将混合均匀后的原料挤压成直径为1mm，长度为1～1.2mm的颗粒；
步骤3干燥破碎筛分：将步骤2完成后得到的所述颗粒在鼓风干燥器中44℃烘干，烘干的饲料粉碎后过筛，取40～80目中间颗粒作为产品饲料，密封保存。
最终所述产品饲料中粗蛋白含量18～22％，粗脂肪含量2.5～3.5％。
采用上述技术方案制作的饲料养殖刺参，将所述饲料作为饵料，初始投饵量为海参体重的5％,根据每天各箱海参的摄食情况进行适当调整达到饱食投喂,每天投喂1次,投喂时间为17:00,次日8:00吸除残饵和粪便,并补充新鲜海水，饲养期间连续充气,水温控制在(17±0.5)℃,盐度27～29,ph7.8～8.2,溶解氧不低于5mg/l,氨氮不高于0.5mg/l,亚硝氮不高于0.1mg/l。
对照组饲料基础原料制作的饲料，制作方法与上述方法基本相同，未加入益母草提取物和狗脊提取物添加剂，养殖刺参的方法完全相同。
8周养殖结束后,对所养殖刺参饥饿24h,然后对每个重复进行计数,称重。取样测定免疫指标。解剖刺参，取其体腔液。吸取抗凝剂[0.068mol/ltris-hcl，0.02mol/ledta，0.48％nacl，0.019mol/lkcl，ph＝7.6]至抗凝剂与体腔液的体积比为1:1，所得抗凝体腔液，一部分直接用于体腔细胞计数、吞噬活性的测定；然后离心10min(3000r/min，4℃)，弃上清液,体腔细胞沉淀物迅速用冰冻的等渗缓冲液[0.001mol/ledta，0.53mol/lnacl,0.01mol/ltris-hcl,ph＝7.6]调整到2×106细胞/ml。取600μl体腔细胞悬液用于海参体腔细胞o2-产量的测定,其余样品迅速用液氮保存并贮存于-80℃冰箱中用于其他分析。体腔细胞样品于4℃下解冻并加入0.1mmol/lpmsf，用超声波匀浆6s(输出22khz，0℃),离心10min(3000r/min，4℃)。所得上清液即为体腔细胞破碎物上清液(cls),立即用于各项免疫指标的测定。
各项指标见表2。
表2添加狗脊提取物对刺参免疫力的影响(
实施例三
一种增强刺参免疫力的饲料制备方法，包括以下步骤：基础原料粉碎，添加剂加入制粒，干燥、整粒；
步骤1基础原料粉碎：所述基础原料包括以下重量份数的原料，其中马尾藻：30份，大叶藻：30份，海泥：15份，海带粉：10份，豆粕：8份，鱼粉：7份，将所述基础原料破碎研磨，研磨后所述基础原料粒度小于100目；
步骤2添加剂加入制粒：向步骤1完成后得到的基础原料中加入添加剂和水，所述添加剂加入量分别为所述基础原料重量的0.5％，1％，2％，并依次编号为ⅶ，ⅷ，ⅸ号饲料；所述添加剂为益母草提取物和狗脊提取物按重量比1:1组成的添加剂，所述水加入量为所述基础原料重量的25～50％；混合均匀后采用双螺旋挤压机(f-26(ⅱ)华南理工大学)将混合均匀后的原料挤压成直径为1mm，长度为1～1.2mm的颗粒；
步骤3干燥破碎筛分：将步骤2完成后得到的所述颗粒在鼓风干燥器中44℃烘干，烘干的饲料粉碎后过筛，取40～80目中间颗粒作为产品饲料，密封保存。
最终所述产品饲料中粗蛋白含量18～22％，粗脂肪含量2.5～3.5％。
采用上述技术方案制作的饲料养殖刺参，将所述饲料作为饵料，初始投饵量为海参体重的5％,根据每天各箱海参的摄食情况进行适当调整达到饱食投喂,每天投喂1次,投喂时间为17:00,次日8:00吸除残饵和粪便,并补充新鲜海水，饲养期间连续充气,水温控制在(17±0.5)℃,盐度27～29,ph7.8～8.2,溶解氧不低于5mg/l,氨氮不高于0.5mg/l,亚硝氮不高于0.1mg/l。
对照组饲料基础原料制作的饲料，制作方法与上述方法基本相同，未加入益母草提取物和狗脊提取物添加剂，养殖刺参的方法完全相同。
8周养殖结束后,对所养殖刺参饥饿24h,然后对每个重复进行计数,称重。取样测定免疫指标。解剖刺参，取其体腔液。吸取抗凝剂[0.068mol/ltris-hcl，0.02mol/ledta，0.48％nacl，0.019mol/lkcl，ph＝7.6]至抗凝剂与体腔液的体积比为1:1，所得抗凝体腔液，一部分直接用于体腔细胞计数、吞噬活性的测定；然后离心10min(3000r/min，4℃)，弃上清液,体腔细胞沉淀物迅速用冰冻的等渗缓冲液[0.001mol/ledta，0.53mol/lnacl,0.01mol/ltris-hcl,ph＝7.6]调整到2×106细胞/ml。取600μl体腔细胞悬液用于海参体腔细胞o2-产量的测定,其余样品迅速用液氮保存并贮存于-80℃冰箱中用于其他分析。体腔细胞样品于4℃下解冻并加入0.1mmol/lpmsf，用超声波匀浆6s(输出22khz，0℃),离心10min(3000r/min，4℃)。所得上清液即为体腔细胞破碎物上清液(cls),立即用于各项免疫指标的测定。
各项指标见表3。
表3益母草提取物、狗脊提取物1:1比例添加对刺参免疫力的影响(
注：表1、2、3中a与对照组比较p＜0.05，b与对照组比较p＜0.01。
饲料中添加益母草、狗脊提取物对刺参的成活率没有影响,各处理组均为100％。添加益母草和狗脊提取物能不同程度地提高刺参体腔细胞活性氧产量(cop)、超氧化物歧化酶(sod)、一氧化氮合酶(nos)及吞噬活性，且呈剂量依赖。其中1.0％、2.0％添加组刺参的体腔细胞活性氧产量、sod、nos及吞噬活性显著高于对照组及0.5％添加组(p＜0.05)；在不增加添加比例的情况下，二者按1:1配比同时添加，各指标与对照组有显著差异(p＜0.01)。综合结果比较表明，：(1)饲料中添加益母草、狗脊提取物可以提高刺参养殖的产量,同时可以提高刺参的非特异性免疫力和抗病力；(2)在研究中,全周期养殖期间投喂益母草、狗脊提取物不会产生免疫疲劳或其他副作用。
实施例四
一种狗脊提取物的制备方法为：狗脊超声浸出，树脂柱提纯；
狗脊超声浸出：向5.0g狗脊粉末中加入60％丙酮50ml，在超声波发射器中浸出，所述超声频率为100～120khz，浸出时间30min，浸出完成后过滤，将滤液蒸干，向蒸干后的残渣中加入水50ml再次溶解所述残渣，再次过滤，得到滤液为狗脊浸出液(含生药量0.1g/ml)；
树脂柱提纯：将所述狗脊浸出液投入d101型大孔吸附树脂床层进行吸附，所述狗脊浸出液体积与所述d101型大孔吸附树脂床层体积比为6:1，吸附时间90min，吸附完成后，吸附饱和的树脂首先采用水洗脱除杂，所述洗脱除杂用水体积与所述d101型大孔吸附树脂床层体积比为3:1，所述洗脱除杂时间为3h，洗脱除杂完成后，首先采用10wt％的乙醇水溶液洗脱，所述洗脱用10wt％乙醇水溶液体积与所述d101型大孔吸附树脂床层体积比为4:1，再采用20wt％的乙醇水溶液洗脱，所述洗脱用20wt％乙醇水溶液体积与所述d101型大孔吸附树脂床层体积比为4:1，两次洗脱得到洗脱液合并作为狗脊提取物。每100g所述狗脊提取物当中含有狗脊总鞣质69.5g。
实施例5
一种益母草提取物的制备方法为：益母草超声浸出，氧化铝柱提纯；
益母草超声浸出：向益母草中加入10倍所述益母草重量的水，在超声波发射器中浸出，所述超声频率为110khz，浸出时间40min，浸出完成后进行一次过滤，得到一次滤液，向一次过滤后得到的滤饼中加入10倍所述益母草重量的水，在超声波发射器中浸出，所述超声频率为110khz，浸出时间40min，浸出完成后进行二次过滤，得到的二次滤液与一次滤液合并作为益母草浸出液；
氧化铝柱提纯：将所述益母草浸出液浓缩至重量为所述益母草重量的1倍，浓缩后的益母草浸出液通过氧化铝柱(中性，100～200目，重量与所述益母草浸出液重量相同)吸附，吸附饱和的氧化铝柱采用其重量20倍的水洗脱，洗脱液水浴蒸发干燥，得到的固体干燥物为所述益母草提取物。每100g所述益母草提取物当中含有益母草总生物碱70.3g。
而且，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个与另一个具有相同名称的部件区分开来，而不一定要求或者暗示这些部件之间存在任何这种实际的关系或者顺序。
以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。