本发明涉及洋葱组织培养技术领域，具体地说是一种易操作、诱导效果好的洋葱不育系愈伤组织诱导的方法。
背景技术：
洋葱（alliumcepal.）是世界上主要蔬菜种类之一，也是我国主要的栽培和出口品种。洋葱属于典型的2年生异花授粉作物，育种上存在周期长、效率低、自交退化严重等特点；而洋葱杂交优势特别明显，但不同品种洋葱在自然状态下杂交率很低，利用雄性不育系进行杂交育种可提高育种效率，因此，不育系的选育是洋葱杂交育种的基础。
植物组织培养和植株再生体系的建立是基因工程育种的重要工作，通过组织培养建立高效植株再生体系主要有两种主要途径：器官发生途径和体细胞胚胎发生途径。其中器官发生分为直接器官发生和间接器官发生,植物的间接器官发生与体细胞胚胎发生都需要愈伤组织为材料。但是，我国洋葱的离体培养过程中存在很多问题，特别是愈伤组织诱导率和愈伤增繁低的问题，而利用不育系鳞茎盘进行离体培养的研究更少。利用组织培养技术可以提高洋葱育种效率，缩短育种年限，同时还可获得更多的优良性状，有效解决一些洋葱育种上的问题，是一种有效的育种新途径。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术存在的缺陷，提供一种易操作、诱导效果好的洋葱不育系愈伤组织诱导的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案解决的：
一种洋葱不育系愈伤组织诱导的方法，其特征在于：该方法步骤如下：
a、取具有鳞茎盘的不育洋葱球；
b、去除叶片与根、去除膜质鳞片和2-3层肉质鳞片后，消毒处理；
c、继续去除肉质鳞片至不育洋葱球的直径为3-3.5cm，采用75%酒精一次消毒后采用无菌水冲洗，再用次氯酸钠二次消毒后采用无菌水冲洗；
d、无菌条件下，握住肉质鳞片将不育洋葱球倒置且不接触鳞茎盘，将步骤（c）的消毒过程中与消毒液接触的鳞茎盘切除；
e、无菌条件下，以1.5-2mm的高度间隔，用手术刀沿鳞茎盘横切面平切，并在鳞茎盘上以4-5mm间距横、竖划线竖切到横切面平切口处，获得多个小块鳞茎盘；
f、将切出的小块鳞茎盘作为外植体放置在诱导愈伤组织的培养基上，外植体的上下朝向不变；
g、重复步骤（e）和步骤（f），直至横切面平切至鳞片与鳞茎盘接口处；
h、避光培养且诱导愈伤组织的培养温度为（25±2）℃。
所述步骤（b）中的消毒处理时间为50-60min。
所述步骤（b）中的消毒处理采用浓度为10-20ppm的臭氧。
所述步骤（c）中的继续去除肉质鳞片至不育洋葱球的直径为3-3.5cm的过程中，如出现分球则不再去除鳞片。
所述步骤（c）中的75%酒精一次消毒时间为30-40s，并采用无菌水至少冲洗1次。
所述步骤（c）中的二次消毒采用10%次氯酸钠消毒10-15min，无菌水冲洗4-5次。
所述步骤（d）中的鳞茎盘切除厚度为自鳞茎盘底部起0.5-1mm。
所述步骤（e）中的平切过程中，手术刀沿鳞茎盘横切面平切至留存0.5-1mm的连接部分，以防切面掉落污染。
所述步骤（f）中的诱导愈伤组织的培养基以ms为基础培养基，其它成分为：3-5mg/l的2,4-d、1.5-3.5mg/l的甘氨酸、685-700mg/l的脯氨酸、mg/l的、995-1005mg/l的酪蛋白水解物、8000mg/l的琼脂、30000mg/l的蔗糖。
所述步骤（f）中的诱导愈伤组织的培养基的ph值为5.8。
本发明相比现有技术有如下优点：
本发明采用的洋葱不育系愈伤组织诱导的方法与现有传统的洋葱组织培养方法相比，利用不育系的鳞茎盘进行愈伤组织的诱导，为洋葱育种提供新的思路与方法；采用该洋葱不育系愈伤组织诱导的方法可有效降低污染率，提高愈伤组织诱导率，重复性好。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
一种洋葱不育系愈伤组织诱导的方法，该方法步骤如下：a、取具有鳞茎盘的不育洋葱球；b、去除叶片与根、去除膜质鳞片和2-3层肉质鳞片后，采用浓度为10-20ppm的臭氧消毒50-60min；c、继续去除肉质鳞片至不育洋葱球的直径为3-3.5cm，在此过程中如出现分球（不同鳞芽）则不再去除鳞片，采用75%酒精一次消毒30-40s后采用无菌水至少冲洗1次，再用10%次氯酸钠二次消毒10-15min，采用无菌水冲洗4-5次；d、无菌条件下，握住肉质鳞片将不育洋葱球倒置且不接触鳞茎盘，将步骤（c）的消毒过程中与消毒液接触的鳞茎盘切除，鳞茎盘切除厚度为自鳞茎盘底部起0.5-1mm；e、无菌条件下，以1.5-2mm的高度间隔，用手术刀沿鳞茎盘横切面平切，平切过程中，手术刀沿鳞茎盘横切面平切至留存0.5-1mm的连接部分，以防切面掉落污染，并在鳞茎盘上以4-5mm间距横、竖划线竖切到横切面平切口处，获得多个小块鳞茎盘；f、将切出的小块鳞茎盘作为外植体放置在诱导愈伤组织的培养基上，外植体的上下朝向不变；诱导愈伤组织的培养基以ms为基础培养基，其它成分为：3-5mg/l的2,4-d、1.5-3.5mg/l的甘氨酸、685-700mg/l的脯氨酸、mg/l的、995-1005mg/l的酪蛋白水解物、8000mg/l的琼脂、30000mg/l的蔗糖；诱导愈伤组织的培养基的ph值为5.8；g、重复步骤（e）和步骤（f），直至横切面平切至鳞片与鳞茎盘接口处；h、避光培养且诱导愈伤组织的培养温度为（25±2）℃。
下面通过具体实施例对本发明的洋葱不育系愈伤组织诱导的方法作进一步的说明。
实施例一
a、早熟黄皮圆球形不育材料‘a1’，鳞茎膨大后至采收存储均可取任何大小的具有鳞茎盘的洋葱球；
b、去除叶片与根、去除膜质鳞片和2-3层肉质鳞片后，采用浓度为20ppm的臭氧消毒50-60min；
c、继续去除肉质鳞片至不育洋葱球的直径为3-3.5cm，在此过程中如出现分球（不同鳞芽）则不再去除鳞片，采用75%酒精一次消毒30s，采用无菌水冲洗1次，再用10%次氯酸钠二次消毒10min，采用无菌水冲洗4次；
d、无菌条件下，握住肉质鳞片将不育洋葱球倒置且不接触鳞茎盘，将步骤（c）的消毒过程中与消毒液接触的鳞茎盘切除，鳞茎盘切除厚度为自鳞茎盘底部起0.8mm；
e、无菌条件下，以1.5mm的高度间隔，用手术刀沿鳞茎盘横切面平切，平切过程中，手术刀沿鳞茎盘横切面平切至留存0.5mm的连接部分，以防切面掉落污染，并在鳞茎盘上以4.5mm间距横、竖划线竖切到横切面平切口处，获得多个小块鳞茎盘；
f、将切出的小块鳞茎盘作为外植体放置在诱导愈伤组织的培养基上，外植体的上下朝向不变；诱导愈伤组织的培养基以ms为基础培养基，其它成分为：3-5mg/l的2,4-d、1.5-3.5mg/l的甘氨酸、685-700mg/l的脯氨酸、mg/l的、995-1005mg/l的酪蛋白水解物、8000mg/l的琼脂、30000mg/l的蔗糖；诱导愈伤组织的培养基的ph值为5.8；
g、重复步骤（e）和步骤（f），直至横切面平切至鳞片与鳞茎盘接口处；
h、避光培养且诱导愈伤组织的培养温度为（25±2）℃。
培养40天后调查诱导率达到100%。
实施例二
a、中晚紫皮扁球形洋葱不育材料‘t’，鳞茎膨大后取任何大小的具有鳞茎盘的洋葱球；
b、去除叶片与根、去除膜质鳞片和2-3层肉质鳞片后，采用浓度为15ppm的臭氧消毒50-60min；
c、继续去除肉质鳞片至不育洋葱球的直径为3-3.5cm，在此过程中如出现分球（不同鳞芽）则不再去除鳞片，采用75%酒精一次消毒40s，采用无菌水冲洗1次，再用10%次氯酸钠二次消毒12min，采用无菌水冲洗5次；
d、无菌条件下，握住肉质鳞片将不育洋葱球倒置且不接触鳞茎盘，将步骤（c）的消毒过程中与消毒液接触的鳞茎盘切除，鳞茎盘切除厚度为自鳞茎盘底部起1mm；
e、无菌条件下，以2mm的高度间隔，用手术刀沿鳞茎盘横切面平切，平切过程中，手术刀沿鳞茎盘横切面平切至留存0.5mm的连接部分，以防切面掉落污染，并在鳞茎盘上以4mm间距横、竖划线竖切到横切面平切口处，获得多个小块鳞茎盘；
f、将切出的小块鳞茎盘作为外植体放置在诱导愈伤组织的培养基上，外植体的上下朝向不变；诱导愈伤组织的培养基以ms为基础培养基，其它成分为：3-5mg/l的2,4-d、1.5-3.5mg/l的甘氨酸、685-700mg/l的脯氨酸、mg/l的、995-1005mg/l的酪蛋白水解物、8000mg/l的琼脂、30000mg/l的蔗糖；诱导愈伤组织的培养基的ph值为5.8；
g、重复步骤（e）和步骤（f），直至横切面平切至鳞片与鳞茎盘接口处；
h、避光培养且诱导愈伤组织的培养温度为（25±2）℃。
培养35天后调查诱导率达到100%。
本发明采用的洋葱不育系愈伤组织诱导的方法与现有传统的洋葱组织培养方法相比，利用不育系的鳞茎盘进行愈伤组织的诱导，为洋葱育种提供新的思路与方法；采用该洋葱不育系愈伤组织诱导的方法可有效降低污染率，提高愈伤组织诱导率，重复性好。
以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内；本发明未涉及的技术均可通过现有技术加以实现。