本发明涉及的是植物组织培养和种质保存技术领域，具体涉及一种荸荠种质的超低温脱毒保存方法。
背景技术：
荸荠（学名：eleocharisdulcis(burm.f.)trin.），又名马蹄、水栗、乌芋、菩荠等，属单子叶莎草科，为多年生宿根性水生草本植物，原产于中国和印度，现广泛分布于热带和亚热带地区。荸荠可食用的部分为匍匐根状茎先端膨大的球茎，其皮色紫黑，肉质洁白，味甜多汁，清脆可口，有着“地下雪梨”之美誉，既可作为水果，又可算作蔬菜，是大众喜爱的时令之品。荸荠具有很好的营养价值，荸荠中含有蛋白质、脂肪和碳水化合物、维生素等人体所必需的营养物质；荸荠还含有较多的磷、钾以及膳食纤维，磷和钾可以促进人体发育，同时可以促进体内的糖、脂肪、蛋白质三大物质的代谢，调节酸碱平衡，膳食纤维可以促进大肠蠕动，对滑肠通便有着很好的效果。荸荠还有药用价值，中医药学认为其具有润喉去燥、清热除烦、顺气降逆、行气宽中、下气除胀的功效，主治热病消渴、黄疸、目赤、咽喉肿痛、小便赤热短少、外感风热、痞积等病症；除此之外，它还含有抗癌消肿的有效成分—荸荠英，荸荠英对一些微生物致病菌有一定的抑制作用，也有临床研究指出经常食用荸荠对肺部、鼻咽和食道等部位的癌症肿瘤有积极的防治效果。
荸荠是无性繁殖的植物，通过产生球茎进行营养繁殖。在长期的无性繁殖过程中，植物体内会积累大量的病毒，并且通过种球传给后代，从而导致荸荠种性严重退化、植株矮化、抗病性和抗逆性减退，甚至不产生球茎或出现“雄荸荠”，使得荸荠的整体产量和品质下降，影响了荸荠产业的发展。植物病毒病与由真菌和细菌病原引起的病害不同，一旦植物被病毒感染很难用任何化学方法根治，因此获得脱毒种苗是荸荠提纯复壮、培育优良品种最为有效
的途径。
我国的荸荠资源十分丰富，荸荠产量位于世界前列。种质资源保存是荸荠新品种选育和保持遗传多样性的重要保证，培育高产、优质和高抗新品种离不开丰富的种质资源，因此开展荸荠种质资源的保存工作具有重要的意义。种质保存方法可分为田间种植保存和离体保存两大类，目前荸荠的种质资源保存方法仍停留在前者，该种方法需要大量的人力、物力，且保存的种质资源占地面积大，易受到病毒、病菌、虫害的影响和自然条件的限制。离体保存是指在适宜条件下，利用种子、分生组织、根和茎等组织或器官来保存种质资源。荸荠是无性繁殖植物，不能以种子形式进行种质保存，因此开发出一种以组织培养为基础的离体保存技术是理想的保存途径之一。
超低温保存作为离体保存技术的组成部分之一，是无性繁殖的植物种质资源长期保存的理想方法。超低温保存是指将植物材料安全存入-196℃液氮中长期保存，需要时采取一定的方法使之回到常温并正常生长的一整套生物技术。超低温保存的原理是，保存材料在超低温条件下几乎所有的细胞代谢活动和生长过程都停止，但细胞活力和形态发生的潜能却可保存，因而细胞培养物的遗传稳定性得以保证。而超低温脱毒的原理是，以植物的茎尖作为保存材料，其顶端分生组织由于结构的特殊性能够经受住低温而存活下来，而这部分组织不含或含有很少病原物，再经过恢复培养就能形成脱毒植株。因此将二者结合起来就能形成一种种质资源保存及脱毒的新技术，具有广阔的应用前景。
目前关于植物种质资源超低温保存的研究已有不少，然而针对不同物种，其适宜的超低温保存方法及程序技术都有可能不同。经检索，有关利用超低温保存技术对荸荠种质资源进行脱毒保存的研究尚未见报道。
技术实现要素：
本发明首次建立了荸荠种质资源的超低温脱毒保存的技术程序，能有效解决田间保存耗费大量的人力、物力、土地以及易受病虫害、自然灾害影响的问题，同时可对保存的种质进行脱毒复壮，从而为生产提供更多优质的荸荠种苗。
为了实现上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：
一种荸荠种质的超低温脱毒保存方法，其特征在于，包括以下技术环节：种质材料预处理、装载、玻璃化液处理、超低温冷冻保存、卸载和恢复培养；
该方法的详细步骤如下：
1）种质材料预处理：将继代培养35d左右的荸荠试管苗置于4℃黑暗条件下炼苗3周；在无菌条件下从试管苗上剥取长1-3mm带有叶原基的茎尖作为种质保存材料，接种于预培养基上，在4℃黑暗条件下预培养4-6d；
2）装载：将预培养后的离体茎尖转接于装载液中，于室温下装载处理25-35min；装载液的成分为：ms+2mol/l甘油+0.4mol/l蔗糖；
3）玻璃化液处理：将装载处理后的茎尖转移到玻璃化保护剂中，于0℃处理1.5-2.5h；然后将处理后的茎尖转移到铝箔条上，并向每个茎尖滴加8-10μl玻璃化保护剂，使茎尖完全包裹于玻璃化保护剂的小液滴中，每个锡箔条上放5-6个茎尖；
4）超低温冷冻保存：将上述制作好的含有小液滴的锡箔条直接浸入液氮中冷冻60-90s，然后将冷冻后的锡箔条置于2ml冷冻离心管中，盖紧盖子后，投入液氮进行长期保存；
5）卸载：种质保存期结束后，将冷冻离心管取出，立即进行38℃水浴化冻处理3-4min，再送入0℃冰水混合物中处理10min，然后在室温下取出茎尖用卸载液洗涤，最后用无菌滤纸吸去残留在茎尖表面的液体，准备接种；
6）恢复培养：为了减少培养过程中温度和光照的抑制，将卸载后的茎尖接种至恢复培养基中先在0℃条件下进行暗培养，等茎尖返绿并有萌动迹象时再转移至光照强度为2000-2500lx、光暗周期为光16h/暗8h的条件下培养35-40d，培养温度为25±2℃。
所述步骤1）中荸荠试管苗的获得方法为：将荸荠球茎清洗干净，切取侧芽剥去最外层包片，采用常规消毒方法进行表面消毒，然后接种于ms+6-ba1.0mg/l+iba0.2mg/l+蛋白胨50mg/l+柠檬汁33ml/l+硝酸镧0.1mg/l培养基上诱导出不定芽，然后将不定芽转移到ms+6-ba2.0mg/l+naa0.2mg/l+芸苔素内酯0.13mg/l+亚精胺1.2mg/l培养基上进行继代增殖，培养条件为温度25℃、光照强度2000lx、光照时间12h/d。
所述步骤1）中预培养基的成分为：1/2ms+吡啶醇0.2~0.4mg/l+酪氨酸5.1~5.5mg/l+荸荠皮提取物23~27ml/l+n-乙酰基-5-甲氧基色胺0.33~0.39mg/l+聚乙烯吡咯烷酮7.3~7.9g/l+蔗糖0.3~0.5mol/l+dmso44~50g/l，ph为5.4~5.8。
所述步骤4）中玻璃化保护剂的成分为：ms液体培养基+甘油300g/l+乙二醇150g/l+dmso120g/l+0.4mol/l蔗糖+乳酸钠22~26mg/l+鼠尾草酚4.4~5.0mg/l+半胱氨酸30~40mg/l+水溶性碳纳米管0.8~1.0g/l+n-羧甲基壳聚糖2.6~3.6g/l。
所述步骤5）中卸载液的成分为ms+1.2mol/l蔗糖；卸载液洗涤方法为：将茎尖接入卸载液停留8-10min，然后更换新的卸载液，重复2-3次。
所述步骤6）中恢复培养基的成分为：ms+2-（3，4-二氯苯氧基）三乙胺2.1~2.5mg/l+吲熟酯0.2~0.4mg/l+尿囊素18~22mg/l+5'单磷酸腺苷1.7~2.3mg/l+中蛋白乳清粉4.8~5.6g/l+荸荠汁36~40ml/l+柠檬酸钛1.0~1.5g/l+叶黄素0.6~0.8mg/l，ph为5.6~6.0。
所述荸荠皮提取物的制备方法为：将收集到的荸荠皮洗净晾干后用粉碎机打碎，根据1：30料液比加入浓度为50%的乙醇，加热到60℃后保温提取50min，然后用300目滤网过滤掉残渣得到提取物。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
1、本发明与一般茎尖脱毒法相比，操作简便，无需剥取小于1mm的茎尖，而且脱毒率高，脱毒周期短，脱毒效果显著。
2、本发明改良了茎尖超低温保存前预处理的培养基、玻璃化保护剂以及超低温保存后恢复培养基的成分，并优化了培养条件，提高了种质保存材料的恢复生长率。
3、本发明与常温和低温种质离体保存方法相比，具有省时省力、无需继代、长期安全、稳定可靠的优点，并且经过2年超低温保存后种质材料的恢复生长率达到90%以上。
4、本发明的方法可同时用于种质资源的脱毒与保存，既保存了种质又能获得无病毒种苗，是一种具有广阔应用前景的新技术。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
以感染cmv病毒的‘汶上大荸荠’和‘苏荠’2种荸荠作为供试材料，按照本发明的技术方案进行以下操作：
1）获得荸荠试管苗：将荸荠球茎清洗干净，切取顶芽剥去最外层包片，采用常规消毒方法进行表面消毒，然后接种于ms+6-ba1.0mg/l+iba0.2mg/l+蛋白胨50mg/l+柠檬汁33ml/l+硝酸镧0.1mg/l培养基上诱导出不定芽，然后将不定芽转接到ms+6-ba2.0mg/l+naa0.2mg/l+芸苔素内酯0.13mg/l+亚精胺1.2mg/l培养基上进行继代增殖，获得带cmv病毒的荸荠试管苗，培养条件为温度25℃、光照强度2000lx、光照时间12h/d；
2）种质材料预处理：将继代培养35d左右的荸荠试管苗置于4℃黑暗条件下炼苗3周；在无菌条件下从试管苗长1-3mm带有叶原基的茎尖作为种质保存材料，接种于预培养基上，预培养基的成分为：1/2ms+吡啶醇0.3mg/l+酪氨酸5.3mg/l+荸荠皮提取物25ml/l+n-乙酰基-5-甲氧基色胺0.36mg/l+聚乙烯吡咯烷酮7.6g/l+蔗糖0.4mol/l+dmso47g/l，ph为5.6，在4℃黑暗条件下预培养4-6d；
预培养基中荸荠皮提取物的制备方法为：将收集到的荸荠皮洗净晾干后用粉碎机打碎，根据1：30料液比加入浓度为50%的乙醇，加热到60℃后保温提取50min，然后用300目滤网过滤掉残渣得到提取物；
3）装载：将预培养后的离体茎尖转接于装载液中，于室温下装载处理25-35min；所述的装载液的成分为：ms+2mol/l甘油+0.4mol/l蔗糖；
4）玻璃化液处理：将装载处理后的茎尖转移到玻璃化保护剂中（玻璃化保护剂的成分为：ms液体培养基+甘油300g/l+乙二醇150g/l+dmso120g/l+0.4mol/l蔗糖+乳酸钠24mg/l+鼠尾草酚4.7mg/l+半胱氨酸35mg/l+水溶性碳纳米管0.9g/l+n-羧甲基壳聚糖3.1g/l），于0℃处理1.5-2.5h；然后将处理后的茎尖转移到铝箔条上，并向每个茎尖滴加8-10μl玻璃化保护剂，使茎尖完全包裹于玻璃化保护剂的小液滴中，每个锡箔条上放5-6个茎尖；
5）超低温冷冻保存：将上述制作好的含有小液滴的锡箔条直接浸入液氮中冷冻60-90s，然后将冷冻后的锡箔条置于2ml冷冻离心管中，盖紧盖子后，投入液氮进行长期保存；
6）卸载：种质保存期结束后，将冷冻离心管取出，立即进行38℃水浴化冻处理3-4min，再送入0℃冰水混合物中处理10min，然后在室温下取出茎尖用成分为ms+1.2mol/l蔗糖的卸载液洗涤，洗涤方法为：将茎尖接入卸载液停留8-10min，然后更换新的卸载液，重复2-3次，最后用无菌滤纸吸去残留在茎尖表面的液体，准备接种；
7）恢复培养：为了减少培养过程中温度和光照的抑制，将卸载后的茎尖接种至恢复培养基（恢复培养基的成分为：ms+2-（3，4-二氯苯氧基）三乙胺2.3mg/l+吲熟酯0.3mg/l+尿囊素20mg/l+5'单磷酸腺苷2.0mg/l+中蛋白乳清粉5.2g/l+荸荠汁38ml/l+柠檬酸钛1.3g/l+叶黄素0.7mg/l，ph为5.8）中先在0℃条件下进行暗培养，等茎尖返绿并有萌动迹象时再转移至光照强度为2300lx、光暗周期为光16h/暗8h、培养温度为25℃的条件下培养38d，计算茎尖的恢复生长率。
实施例2
采用与实施例1相同的带cmv病毒的2个品种的荸荠作为供试材料，采用一般茎尖脱毒法进行脱毒试验，具体步骤为：将荸荠球茎清洗干净，切取顶芽剥去最外层包片，采用常规消毒方法进行表面消毒；在无菌条件下，在显微镜下剥离大小为0.5mm左右的茎尖分生组织，接种于ms+6-ba1.0mg/l+iba0.2mg/l+蛋白胨50mg/l+柠檬汁33ml/l+硝酸镧0.1mg/l培养基上进行茎尖诱导培养；将茎尖分化出的不定芽转接到ms+6-ba2.0mg/l+naa0.2mg/l+芸苔素内酯0.13mg/l+亚精胺1.2mg/l培养基上继代培养30-40d，获得再生植株。
实施例3
采用与实施例1相同的种质保存材料和技术方案，不同的是将步骤2）中预培养基替换为ms+蔗糖0.4mol/l。
实施例4
采用与实施例1相同的种质保存材料和技术方案，不同的是将步骤4）中玻璃化保护剂替换为pvs2。
实施例5
采用与实施例1相同的种质保存材料和技术方案，不同的是将步骤7）中恢复培养基替换为ms培养基。
结果分析
1、按照实施例1的技术方案将种质材料超低温冷冻保存60min，将恢复培养后获得的再生植株与实施例2获得的再生植株均采用rt-pcr技术进行病毒检测，统计cmv（黄瓜花叶病毒）的脱除率，结果见表1。
由表1可以看出，采用本发明的方法对2个荸荠品种cmv的脱除率高达90.7%和89.5%，显著高于一般茎尖脱毒法，说明本发明的脱毒效果良好。
2、按照实施例1与实施例3-5的技术方案将种质材料超低温冷冻保存2年，统计茎恢复生长率，结果见表2。
由表2可以看出，采用本发明的方法对2个荸荠品种的种质材料进行保存，保存2年后种质材料的恢复生长率均能达到90%以上，高于其他实施例，说明本发明的种质保存效果最好；具体来说，本发明的预培养基降低了营养成分并添加了吡啶醇能够在一定程度上抑制保存材料的生长，添加的酪氨酸、荸荠皮提取物、n-乙酰基-5-甲氧基色胺能够保护细胞膜结构抵御活性氧损伤，从而提高保存材料抗低温能力；玻璃化保护剂添加了乳酸钠、鼠尾草酚、半胱氨酸，提高了抗氧化能力，有助于保持细胞结构完整性，水溶性碳纳米管和n-羧甲基壳聚糖能改变冰晶的形成状况，减少冻结过程对细胞的损伤；本发明的再生培养基添加了高效植物激素、核酸类、蛋白类和天然活性物质，能有效促进植物的营养吸收，增强光合作用，促进茎尖恢复生长，以上几种因素相结合对超低温保存后茎尖恢复生长产生了显著的正向效果。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。