一种提高水稻三系不育系柱头外露率的分子育种方法与流程

本发明涉及水稻分子育种学领域，具体是一种提高水稻三系不育系柱头外露率的分子育种方法。

背景技术：

水稻是我国最主要的粮食作物，水稻产量的丰欠将直接影响到粮食安全和社会稳定。20世纪70年代中期杂交水稻的研究成功，大大提高了我国水稻的产量，然而现行的三系、两系育种体系由于不育系的异交性能差导致杂交制种产量低，制种成本高，极大的限制了水稻生产的大面积推广。水稻是自花授粉作物，花器构造适于自交而不利于异交，是杂交稻繁殖制种的限制因素之一。水稻柱头是接受花粉的器官，柱头外露率、柱头长和宽等性状决定母本的受粉能力，直接影响水稻不育系繁殖及杂交稻制种产量。选育优良不育系，除应选择雄性不育和高配合力等特性外，还必须选择具有较高柱头外露特性。因此，研究不育系柱头外露特性是水稻育种家们的重要目标之一。

水稻柱头外露率是多基因控制的数量性状，各世代均呈连续性变异。针对柱头外露率性状，研究人员利用不同的分离群体，基于连锁分析，进行了大量的qtl定位工作(李晨等，2001；李文宏等，2003；ugaetal，2003；yamamotoetal，2003；yuetal，2006；沈圣泉等，2006；miyataetal，2007；岳高红等，2009；huetal，2009；冯玲玲等，2010；邓应德等，2010；李海彬等，2010；陈爱国等，2011；尹成等，2014；lietal，2014；liuetal，2015；李威等，2017；mdhabiburrahmanetal，2017)。此外，还有学者利用bsa法和关联分析对柱头外露率进行qtl定位(邓应德等，2011；yanetal，2009；dangetal，2016；zhouetal，2017；guoetal，2017)。定位的qtls数目很多，分布在水稻的12条染色体上，但是单个qtl解释的表型变异多在15％以内，表明柱头外露率是一个受多个微效qtl影响的典型的数量性状。像其他数量性状一样，柱头外露性状可在qtl定位后，通过分子标记进行辅助选择。尽管不同学者对柱头外露率进行了qtl分析，但各自的研究结果并不完全一致，这与不同研究中采用的群体性质、群体大小、分析方法、标记数量及密度等不同有关，同时反应出柱头外露性状qtl遗传的复杂性。目前，对水稻柱头外露率的qtl精细定位还报道甚少，迄今还没有qtl被克隆出来，更未进行基因功能与表达调控分析。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种提高水稻三系不育系柱头外露率的分子育种方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种提高水稻三系不育系柱头外露率的分子育种方法，包括以下步骤：

(1)以低柱头外露率的水稻三系保持系沪旱1b作为轮回亲本，以携带柱头外露率基因qes7的水稻三系保持系ii-32b作为供体，进行杂交获得f1；

(2)对步骤(1)中得到的f1代植株，利用与柱头外露率基因qes7紧密连锁的分子标记rm3859和indel4373进行真假杂种鉴定和分子标记辅助选择，选择高柱头外露率，农艺性状与轮回亲本相似且标记杂合基因型的单株，与轮回亲本沪旱1b连续回交3代获得bc3f1；

(3)将步骤(2)中经鉴定为真杂种的bc3f1自交得到bc3f2，选择高柱头外露率，农艺性状与轮回亲本相似且标记纯和基因型的单株与野败型不育系沪旱1a杂交，单株套袋自交收种获得bc3f3；

(4)连续回交3代，每一代选取柱头外露率高且农艺性状与沪旱1a相近的单株进行成对回交，即育成柱头外露率提高的改良不育系和成对的保持系。

作为本发明进一步的方案：步骤(2)中所述的柱头外露率基因qes7紧密连锁的分子标记rm3859的

左端引物序列为ttgcagatcggtttccactg

右端引物序列为ggtcctggattcatggtgtc；

作为本发明进一步的方案：步骤(2)中所述的柱头外露率基因qes7紧密连锁的分子标记indel4373的

左端引物序列为agtctttgatggaaagctcc

右端引物序列为tattcccaaaattttcatgg。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：传统水稻柱头外露率改良育种中，需要种植大规模分离群体，人工观察选育高柱头外露率单株进入育种程序，表型鉴定容易受环境影响，本发明的提高水稻三系不育系柱头外露率的分子育种方法在精细定位出柱头外露率基因qes7的基础上，利用与目标基因紧密连锁的分子标记进行辅助选择，从传统的对植株表型鉴定和选择改进为对基因型的选择，基因型的选择可以在早期进行，不受环境和生育期的限制，提高柱头外露率改良育种效率和准确性，加快育种进程。

附图说明

图1为一种提高水稻三系不育系柱头外露率的分子育种流程图。

图2为水稻柱头外露率基因qes7在第7染色体上的定位。

其中，mas表示分子标记辅助选择；

a：qes7基因的初步定位，水平线表示第7染色体，水平线上方表示初步定位的ssr标记，水平线下方表示标记间的遗传距离(cm)；

b：qes7基因的精细定位，qes7精细定位于分子标记rm3859和indel4373之间，水平线下方表示标记间的物理距离(bp)。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例，参阅图1和2，

一、水稻头外露率基因qes7的精细定位

(一)沪旱1b/ii-32bbc3f2群体构建

岳高红等(2009)利用沪旱1b/ⅱ-32b构建的f2群体对水稻的柱头外露率性状进行了qtl分析，初步定位到了1个同时影响单边柱头外露率和总柱头外露率的qtl-qes7，位于第7染色体分子标记rm3859和rm5436之间，加性效应来自高柱头外露率亲本ii-32b。因此，以沪旱1b为轮回亲本，选择f2群体中含有qes7位点的单株与沪旱1b回交，获得bc1f1，然后利用分子标记rm3859和rm5436检测回交后代，选择两侧标记均为杂合基因型的单株继续与沪旱1b回交获得bc2f1，同样再选择两侧标记均为杂合基因型的回交后代与沪旱1b回交获得bc3f1，然后自交收种获得6720个bc3f2群体单株。

(二)构建的bc3f2群体的分子标记分析

参考并比较已测序的水稻品系9311及日本晴在rm3859和rm5436之间相应的基因组序列，利用微卫星dna位点查找软件ssrhunter查找ssr序列，利用分子生物学应用软件dnaman比对发现indel差异序列。将上述序列通过引物设计软件primeprimer5设计。

按照常规ctab法提取供亲本沪旱1b，ii-32b及bc3f2群体单株的dna，用设计的indel标记引物对亲本进行多态性筛选，pcr扩增反应体系为：20ng水稻基因组dna模板，10ultaqpcrmastermix(天根生化科技(北京)有限公司)，10um的前后引物各1ul，补充ddh2o至20ul。pcr扩增程序为：95℃预变性5min，然后按95℃30s，55℃下30s，72℃下45s进行30个循环，最后72℃下延伸5min。pcr扩增产物在6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析，最终在目标区间内从23个设计合成的indel标记中获得6个标记引物在亲本间有多态性(表1)。

表1分子标记信息

标记rm3859和rm5436之间的遗传距离为1.2cm，物理距离约200kb。利用rm3859和rm5436从6720个bc3f2群体单株中筛选出18株杂合重组单株，利用新设计开发的筛选获得indel4373，indel4380，indel4385，indel4419，indel4459，indel4477的6个多态性分子标记检测重组单株基因组dna，发现分为6种重组类型(表2)，对这18株重组单株收种继续种植成bc3f3株系，每个株系种植48株，调查每个株系里每个单株的柱头外露率表型，表型调查方法参考岳高红等(2009)所述，根据表型值的分离情况推测bc3f2单株的基因型，收取6个纯和重组类型单株的种子，继续种植成bc3f4株系，每个株系种植24株，理论上纯和重组类型不会再有分离，重复调查柱头外露率表型，结合表型和基因型将qes7基因最终精细定位于分子标记rm3859和indel4373之间的28.5k区间(表3)。

表2bc3f2重组单株基因型

表3bc3f4重组单株基因型及表型

二、提高水稻三系不育系柱头外露率的分子育种方法

在实施例1中获得的bc3f3代纯和重组单株中，选择高柱头外露率，农艺性状与轮回亲本沪旱1b相似，且标记rm3859和indel4373为ii-32b基因型，其余标记为沪旱1b基因型的单株与野败型不育系沪旱1a杂交，单株套袋自交收种获得bc3f4；连续回交3代，每一代选取柱头外露率高且农艺性状与沪旱1a相近的单株进行成对回交，即育成柱头外露率提高的改良不育系和成对的保持系。

对新改良不育系的开花习性、柱头活力、柱头外露率、异交结实率和制种产量等异交特性进行了调查，结果表明：改良不育系农艺性状与沪旱1a相似，开花习性好，花期集中，午前花比例高，柱头活力强，总柱头外露率达69.7％，异交结实率高达68.0％。与旱恢3号制种产量为3.72t/hm2，比对照沪旱1a与旱恢3号的制种产量(1.39t/hm2)增加2.33t/hm2。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。