一种从烟草突变体中筛选高分泌型材料的方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种从烟草突变体中筛选高分泌型材料的方法。

背景技术：

烟草叶面分泌物与烟叶的品质和抗性密切相关。叶面分泌物含量高的品种烟株抗性强、烟叶油分多，品质好，评吸质量较好。随着吸烟与健康问题的关注度提高，降焦减害显得日益重要，对烟叶的品质要求也越来越高。为了提升烟叶的品质，增加品种抗性，提高叶面分泌物含量是一条非常有效的途径。

研究发现，对烟草来说，腺毛密度和腺毛类型与叶面分泌物含量的多少密切相关。腺毛密度越大，尤其是分泌型腺毛密度越大，叶面分泌物含量越高。而高分泌型材料的创制，常规的品种选育很难达到目的，目前应用较多的是通过物理、化学等方法进行诱变，在诱变材料中筛选目标性状。由于诱变材料突变频率低且突变的随机性很强，符合目标性状的材料非常少，要想得到目标性状需要在大批的材料中筛选。高分泌型材料一般的筛选方法是对所有处理过的单株种植并逐个进行分泌物提取鉴定，但大批量的材料种植和叶面分泌物提取、分离、检测等，费时费力、成本非常高、工作量非常大。因此，找到一种简单有效的筛选方法，从而减少工作量，降低成本，提高筛选效率具有重要意义。

技术实现要素：

针对现有的高分泌型烟草材料创制主要采用对诱变后代全部种植并对逐个叶面分泌物进行提取鉴定，筛选工作量大，成本高，效率较低的问题，本发明的目的在于提供一种从烟草突变体中筛选高分泌型材料的方法，可以大大减少筛选工作量，节约成本，提高筛选效率。

本发明通过下述技术方案来实现：

一种从烟草突变体库中筛选高分泌型材料的方法，主要选育流程为：种子处理（物理化学诱变）→突变群体的初步筛选→单株筛选鉴定→重复鉴定（f2代鉴定）→品系鉴定→生产试验。

其中，包括以下步骤：

步骤1、种子处理：应用物理或化学的方法，对已知特性的烟草种子进行处理，达到诱变的目的；

步骤2、突变群体的初步筛选：将处理过的种子点播在装有合适基质的育苗盘上，单粒点播，在适宜温度下，进行漂浮育苗；待长到5-7片叶时，对幼苗的叶片进行腺毛形态学观察；筛选出与野生型相比腺头大及腺毛密度明显增加的材料，同时对剪取的单株进行标记，或直接移植到一个新的漂盘上，此过程可以淘汰90%以上的幼苗；

步骤3、单株筛选鉴定：对苗期筛选出的目标材料在大田进行单株种植，同时种植野生型对照。烟叶成熟期时，对叶面腺毛进行染色观察，重复鉴定可分泌型腺毛的密度，并对中部叶按照标准方法提取叶面分泌物，进行相关成分的检测，根据检测结果，保留叶面分泌物含量较高的材料，单株编号，套袋留种；

步骤4、重复鉴定（f2代鉴定）：将f2代种子种植，大田生长期淘汰重病株和弱小烟株，选择健壮的株系，在烟叶成熟期时，进行叶面分泌物提取鉴定；并对其形态特征、农艺性状、抗病性等进行自然选择，单株系套袋留种，尽可能得到更多变异类型的植株；

步骤5、品系鉴定：对f2代得到的材料进行品系比较试验，对选出的稳定品系进行生产可用性比较评价，确定目标高分泌型材料。

优选地，步骤1中用甲基磺酸乙酯（ems）、硫酸二乙酯（des）、快中子中任一种对烟草种子进行处理。

优选地，步骤2中对幼苗的烟草叶片进行腺毛形态学观察具体为：待其长至5-7片叶时，在苗盘上选择同一大小的叶片，在同一部位剪取0.5cm左右宽、2cm左右长的叶片，保持鲜活，不能失水，直接放在超景深体视显微镜下进行观察。

本发明与现有技术相比具有以下有益效果：

（1）本发明提供的从烟草突变体库中筛选高分泌型材料的方法，在鉴定初期，不直接从较为复杂的叶面分泌物入手进行鉴定和筛选，而是利用腺毛密度和类型与叶面分泌物的相关性，先进行直观的叶面腺毛的密度和类型的筛选，再在此基础上进行叶面分泌物的鉴定和高分泌型材料的筛选，经过两次腺毛筛选、两次分泌物鉴定，确保了筛选后代的目标性状，筛选结果准确可靠；

（2）本发明提供的从烟草突变体库中筛选高分泌型材料的方法，在幼苗期就淘汰了90%以上的突变体植株，大大减少了大田材料的种植量，减少了用地、用工等费用；

（3）本发明提供的从烟草突变体库中筛选高分泌型材料的方法，因种植材料的减少，也减少了成熟期分泌物鉴定的数量，分泌物的提取和检测费工费时，每个样品的提取、浓缩、检测时间在3-5个小时，检测费用在1000元左右，本发明大量缩减了检测植株的数量（90%以上），节约了大量成本，缩短了筛选时间，大大提高了筛选效率。

附图说明

图1为野生型k326腺毛形态观察照片。

图2为t29腺毛形态观察照片。

图3为t12腺毛形态观察照片。

图4为t2腺毛形态观察照片。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图及具体实施例进行详细描述。

实施例1

一种从烟草突变体库中筛选高分泌型材料的方法，包括以下步骤：

步骤1、种子处理：选择发芽率较高的烟草k326种子，按照适当浓度，用硫酸二乙酯（des）进行处理，得到诱变种子。

步骤2、突变群体的初步筛选：将处理过的种子点播在装有合适基质的育苗盘上，出苗后选择保留能正常生长的幼芽5000株，在适宜温度下，进行漂浮育苗生长。待苗长至5-7片叶时，把漂盘搬出控水，在苗盘上选择大小一致的叶片，在叶中部剪取0.5cm左右宽，2cm左右长的叶片，保持鲜活，不能失水，直接放在超景深体视显微镜下，进行腺毛形态学观察。与对照野生型k326相比较，对腺头明显增大和腺毛密度明显增加的材料进行拍照，同时对剪取的单株进行标记。从中挑选出腺头较大的12株，密度增加的53株，编号为t1到t65。图1为野生型k326腺毛形态观察照片，图2~4分别为t29、t12、t2腺毛形态观察照片。

步骤3、单株筛选鉴定：对初步筛选出的目标材料和野生型对照在大田进行株系种植，共种植66份。每个株系种植10株。成熟期时，淘汰掉发病较重，长势较弱的材料，对47个材料的中部叶，进行染色，在显微镜下二次观察，并按照标准方法提取叶面分泌物，进行叶面分泌物检测。根据观察和检测结果，保留叶面分泌物含量较高的材料30株，单株套袋留种。

步骤4、重复鉴定（f2代鉴定）：将f2代种子按照常规栽培方法种植，在成熟期对中部叶重复进行叶面分泌物鉴定，并对其形态特征、农艺性状、抗病性等进行自然选择，单株套袋留种，尽可能得到更多变异类型的植株。通过对比，得到10份分泌物总量超过50%的材料，其分泌物含量见表1。其中t12、t29、t31、t15、t23，这5个材料的综合农艺性状较好。

表1f2代叶面分泌物含量表

步骤5、品系鉴定：将得到的f3代材料，综合农艺性状较好的5个品系t12、t29、t31、t15、t23进行品系比较试验，主要对选出的稳定品系进行产量、产值、抗病性等全面的比较评价，筛选得到综合性状较好，叶面分泌物显著增加的目标品系t12、t29。

从实施例1的结果可知，应用本发明的方法成功地从烟草突变体库中筛选出了多种综合性状较好，叶面分泌物显著增加的高分泌型材料，该方法操作简单、筛选时间短、结果可靠、能大幅降低筛选成本。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其他修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。