本发明涉及农业生物技术中植物组织培养的方法，具体地说，涉及一种三棱再生体系构建的方法。
背景技术：
三棱为黑三棱科植物的干燥块茎，主产河北、辽宁、江苏、江西等地。秋、冬两季采挖其块茎，除去须根、茎叶，洗净泥土，削去外皮晒干。气微，味淡，嚼之有麻辣感。具有行血、行气、消积、止痛作用。用于瘀血所致之闭经，痛经，腹痛。目前，三棱主要依靠种子繁殖方式进行种苗生产，存在繁殖周期长、效率低、繁殖系数低等问题，尚未形成健全的产业化生产机制。近年来，由于三棱需求量逐渐增加，野生资源逐渐减少，其种子本身又具深度休眠特性，自然繁殖率普遍较低。因此，非常有必要建立一套完整的三棱组织培养快繁体系。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种三棱再生体系构建的方法，本发明以三棱为最初外植体，通过无菌体系建立、初代培养、丛生芽增殖培养、丛生芽壮苗培养、试管苗生根以及试管苗驯化移栽等过程建立了三棱的再生体系，为三棱优质种源的快速繁殖提供生产方法，进而实现了本发明的目的。
本发明的一种三棱再生体系构建的方法，包括以下的工艺步骤：
步骤1,无菌体系建立：选取成熟饱满、完整无病虫害的三棱种子，在自来水下初步清洗干净,种子以0.1%～0.5%高锰酸钾溶液浸泡5h，直至高锰酸钾溶液的颜色变浅至粉红色，经自来水冲洗干净后在75%乙醇溶液中消毒5min，无菌水冲洗5次，无菌滤纸沥干，人工去外种皮，接种到萌发培养基上进行启动培养；萌发培养基为：3/4b5+0.8mg/l6-ba+0.3mg/lnaa+1.8%蔗糖+3.5%琼脂+0.05%活性炭，ph值为5.6;
步骤2,初代培养：将无菌体系培养的萌发子叶未脱落的无菌苗接种到初代培养基上进行培养，接种后先在24℃条件下全暗培养15天，然后置于每天光照16小时，光照强度为2600lx，培养温度为24℃的条件下培养，41天转接一次；初代培养基为：b5+1～4mg/l6-ba+1～1.5mg/l2,4-d+1.5%蔗糖+0.3%琼脂+0.2%活性炭，ph值为5.6;
步骤3,丛生芽增殖培养：将初代培养的无菌苗无顶芽长度为4cm的茎段接种到增殖培养基上进行增殖培养，接种后先在24℃条件下全暗培养15天，然后置于每天光照16小时，光照强度为2600lx，培养温度为24℃的条件下培养，41天转接一次；增殖培养基为：ms+1～2mg/lkt+1～1mg/lnaa+4mg/l6-ba+1.5%蔗糖+0.3%琼脂+0.1%活性炭，ph值为5.6;
步骤4,丛生芽壮苗培养：将丛生芽增殖得到的不定芽，切除基部少量愈伤组织，去除底部叶片后接种到壮苗培养基上进行壮苗培养，接种后先在24℃条件下全暗培养15天，然后置于每天光照16小时，光照强度为2600lx，培养温度为24℃的条件下培养，41天转接一次；壮苗培养基为ms+0.8mg/lnaa+1.3mg/l6-ba+1.8%蔗糖+0.6%琼脂+0.11%活性炭，ph值为5.6;
步骤5,试管苗生根：将长至4cm的,叶片数不少于5片，植株较健壮的无根苗分切接种到生根培养基上进行诱导生根，接种后先在24℃条件下全暗培养15天，然后置于每天光照16小时，光照强度为2600lx，培养温度为24℃的条件下培养至生根；生根培养基为1/2ms+0.8mg/lnaa+3.8%蔗糖+0.8%琼脂+0.13%活性炭，ph值为5.6。
步骤6,试管苗驯化移栽：将长至8cm的生根试管苗的培养瓶瓶盖打开并置于自然光照下炼苗18天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入由黄沙土和火碳泥=2：1混合成的基质中并定植于大田中。
与现有技术相比本发明的优点是：本发明克服了三棱组织培养中存在的污染率高、褐化率高、生根困难、移栽成活率低等问题，构建了三棱再生体系，从而促进了三棱的商业化进程。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
实施例1：
（1）无菌体系建立：选取成熟饱满、完整无病虫害的三棱种子，在自来水下初步清洗干净。种子以0.1%高锰酸钾溶液浸泡6h，直至高锰酸钾溶液的颜色变浅至粉红色，经自来水冲洗干净后在75%乙醇溶液中消毒6min，无菌水冲洗6次，无菌滤纸沥干，人工去外种皮，接种到萌发培养基上进行启动培养。所述萌发培养基为3/4b5+0.5mg/l6-ba+0.4mg/lnaa+1.8%蔗糖+0.5%琼脂+0.15%活性炭，ph值为5.5。
（2）初代培养：将无菌体系培养的萌发子叶未脱落的无菌苗接种到初代培养基上进行培养，接种后先在24℃条件下全暗培养10天，然后置于每天光照15小时，光照强度为2500lx，培养温度为24℃的条件下培养，31天转接一次。所述初代培养基为b5+5mg/l6-ba+1.5mg/l2,4-d+1.8%蔗糖+0.6%琼脂+0.08%活性炭，ph值为5.5。
（3）丛生芽增殖培养：将初代培养的无菌苗无顶芽长度为4cm的茎段接种到增殖培养基上进行增殖培养，接种后先在24℃条件下全暗培养16天，然后置于每天光照16小时，光照强度为2500lx，培养温度为24℃的条件下培养，41天转接一次。所述增殖培养基为ms+2mg/lkt+2mg/lnaa+3mg/l6-ba+1.8%蔗糖+0.6%琼脂+0.08%活性炭，ph值为5.5。
（4）丛生芽壮苗培养：将丛生芽增殖得到的不定芽，切除基部少量愈伤组织，去除底部叶片后接种到壮苗培养基上进行壮苗培养，接种后先在24℃条件下全暗培养16天，然后置于每天光照15小时，光照强度为2500lx，培养温度为24℃的条件下培养，31天转接一次。所述壮苗培养基为ms+0.6mg/lnaa+0.6mg/l6-ba+1.8%蔗糖+0.2%琼脂+0.1%活性炭，ph值为5.5。
（5）试管苗生根：将长至4cm的,叶片数不少于6片，植株较健壮的无根苗分切接种到生根培养基上进行诱导生根，接种后先在24℃条件下全暗培养16天，然后置于每天光照14小时，光照强度为2600lx，培养温度为28℃的条件下培养至生根，生根率达到90%。所述生根培养基为1/2ms+0.6mg/lnaa+1.8%蔗糖+0.2%琼脂+0.1%活性炭，ph值为5.5。
（6）试管苗驯化移栽：将长至8cm的生根试管苗的培养瓶瓶盖打开并置于自然光照下炼苗8天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入由黄沙土和火碳泥=2：1混合成的基质中并定植于大田中，成活率达95%以上。
实施例2：
（1）无菌体系建立：选取成熟饱满、完整无病虫害的三棱种子，在自来水下初步清洗干净。种子以0.3%高锰酸钾溶液浸泡4h，直至高锰酸钾溶液的颜色变浅至粉红色，经自来水冲洗干净后在75%乙醇溶液中消毒6min，无菌水冲洗6次，无菌滤纸沥干，人工去外种皮，接种到萌发培养基上进行启动培养。所述萌发培养基为3/4b5+0.6mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+2.8%蔗糖+0.6%琼脂+0.2%活性炭，ph值为5.8。
（2）初代培养：将无菌体系培养的萌发子叶未脱落的无菌苗接种到初代培养基上进行培养，接种后先在24℃条件下全暗培养12天，然后置于每天光照15小时，光照强度为2200lx，培养温度为25℃的条件下培养，42天转接一次。所述初代培养基为b5+2mg/l6-ba+0.5mg/l2,4-d+2.5%蔗糖+0.3%琼脂+0.1%活性炭，ph值为5.8。
（3）丛生芽增殖培养：将初代培养的无菌苗无顶芽长度为2.0cm的茎段接种到增殖培养基上进行增殖培养，接种后先在28℃条件下全暗培养12天，然后置于每天光照12小时，光照强度为2600lx，培养温度为24℃的条件下培养，40天转接一次。所述增殖培养基为ms+1.5mg/lkt+0.5mg/lnaa+1mg/l6-ba+2.5%蔗糖+0.5%琼脂+0.05%活性炭，ph值为5.8。
（4）丛生芽壮苗培养：将丛生芽增殖得到的不定芽，切除基部少量愈伤组织，去除底部叶片后接种到壮苗培养基上进行壮苗培养，接种后先在24℃条件下全暗培养14天，然后置于每天光照12小时，光照强度为2500lx，培养温度为28℃的条件下培养，30天转接一次。所述壮苗培养基为ms+0.6mg/lnaa+0.4mg/l6-ba+2.5%蔗糖+0.35%琼脂+0.09%活性炭，ph值为5.8。
（5）试管苗生根：将长至2.0cm的,叶片数不少于5片，植株较健壮的无根苗分切接种到生根培养基上进行诱导生根，接种后先在28℃条件下全暗培养13天，然后置于每天光照13小时，光照强度为2600lx，培养温度为28℃的条件下培养至生根，生根率达到90%。所述生根培养基为1/2ms+1mg/lnaa+2.8%蔗糖+0.35%琼脂+0.08%活性炭，ph值为5.8。
（6）试管苗驯化移栽：将长至7cm的生根试管苗的培养瓶瓶盖打开并置于自然光照下炼苗7天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入由黄沙土和火碳泥=2：1混合成的基质中并定植于大田中，成活率达90%以上。