解淀粉芽孢杆菌D2WM在促进蔬菜生长中的应用的制作方法

本发明涉及植物繁殖生长领域，具体涉及一种解淀粉芽孢杆菌d2wm在促进蔬菜生长中的应用。

背景技术：

芽孢杆菌(bacillus)作为重要的生防菌种群，具有很强的抗菌防病作用，同时繁殖速度快，产生耐低温、耐高温和抗逆性强的芽孢，易于存活与繁殖，因此多用于防治蔬菜和植物病害，请见(陈中义，张杰，黄大昉.植物病害生防芽孢杆菌抗菌机制与遗传改良研究[j].植物病理学报，2003，33(2)：97-103.)。根际是微生物活动特别旺盛的环境，在有机物质腐解过程中，微生物合成并供给了植物需要的生长刺激物质，即所谓植物有机养料，请见(司美茹，赵云峰.黑松林根际土壤微生物区系及其养分研究[j].曲阜师范大学学报(自然科学版)，2009，35(2)：104-109)。这些物质通过微生物细胞分泌或自解释放出来，被根吸收到植物体内。如固氮刚螺菌(azospirillum)和其他固氮细菌为植物提供氮素，请见(崔荣强，张久明，马湘君，等.海洋生境芽孢杆菌(bacillussp.)t28菌株对番茄生长的多功能促进作用[j].植物生理学报，2015(11)：1855-1860)，小麦根际的细菌能产生吲哚乙酸促进植物生长，请见(常慧萍，邢文会，夏铁骑，等.根际促生细菌的筛选及其对小麦幼苗的促生作用[j].河南农业科学，2016，45(12)：52-57)，有的微生物合成赤霉素类化合物提高种子发芽率和根毛的发育，请见(彭辉，施天穹，聂志奎，等.微生物发酵产赤霉素的研究进展[j].化工进展，2016，35(11)：3611-3618)。

高学文等报道了一种短小芽孢杆菌lnxm12及其应用(申请号：201210435043.3)，该生防菌能够显著抑制赤霉菌、水稻白叶枯病菌和酵母菌，主要是通过防病的作用达到促进小麦和拟南芥生长的目的，未报道其产生植物激素；王华平等报道了一种解淀粉芽孢杆菌zh1及其应用(申请号：201410095857.6)，该菌株能利用难溶性磷酸盐为磷源进行生长，提高肥料的利用率，促进植物根系发育和对肥料的吸收，未报道其有固氮和产生植物激素的作用；还有耿伟华等报道了解淀粉芽孢杆菌及其应用(申请号：201410811744.1)，该生防菌可以通过产生超敏蛋白水剂起到对植物促生壮苗作用。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种解淀粉芽孢杆菌d2wm在促进蔬菜生长中的应用，该菌株的菌悬液可使娃娃菜、紫菜薹、榨菜、快菜、白菜、油麦菜、萝卜、莴苣的发芽率分别提高了21.7、16.7、1.7、6.7、10、10、1.7、13.3个百分点；促进娃娃菜、紫菜薹、榨菜、白菜、油麦菜、萝卜的芽长和鲜重增加。

为实现上述目的，本发明所设计一种解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciensd2wm在促进蔬菜生长中的应用。该应用为：显著促进蔬菜种子萌发，提高发芽率，芽长和鲜重。

所述蔬菜选自娃娃菜、紫菜薹、榨菜、快菜、白菜、油麦菜、萝卜和莴苣。

上述解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciensd2wm从健康油茶根际土壤筛选得到，该解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciensd2wm已于2015年10月20日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称：cctcc，中国，武汉，武汉大学)，保藏编号为cctccno：m2015623；该菌株在专利号：zl201510740065.4的中国发明专利中公开。

本发明还提供了一种解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciensd2wm在制备促进蔬菜生长药品中的应用。

本发明还提供了一种解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciensd2wm的菌悬液在促进蔬菜生长及其制备促蔬菜生长药品中的应用。

将上述解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciensd2wm在lb液体培养基中培养，得到菌液，将菌液在转速为10000r·min^-1条件下离心10min，去除上清液收集菌体，加入无菌水使菌体均匀悬浮于无菌水中，即得菌悬液，采用b.amyloliquefaciensd2wm菌悬液处理蔬菜种子，评价它对常见蔬菜发芽率和鲜重等指标的影响。

本发明还提供了一种解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciensd2wm的发酵液在促进蔬菜生长及其制备促蔬菜生长药品中的应用。

上述解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciensd2wm本身具有防病能力，能显著提高蔬菜的成活率；而且更在于该菌能分泌多种植物激素，尤其是能分泌赤霉素、玉米素、脱落酸，这三种植物激素在其他促生菌中鲜见报道，且具有溶磷固氮能力，能促进植物对氮和磷的吸收。

本发明的有益效果：

1.该解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciensd2wm能产生吲哚-3-乙酸、赤霉素、玉米素、脱落酸等多种生长激素，具有溶磷固氮的功能。

2.解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciensd2wm菌悬液对蔬菜促生作用实验表明，该菌悬液可使娃娃菜的发芽率提高了21.7％；促进萝卜的芽长和鲜重分别提高76.8％和77.4％。

附图说明

图1为解淀粉芽孢杆菌b.amyloliquefaciensd2wm溶磷作用示意图；

图2为解淀粉芽孢杆菌b.amyloliquefaciensd2wm固氮作用示意图；

图3为解淀粉芽孢杆菌b.amyloliquefaciensd2wm菌悬液对蔬菜发芽率的影响示意图；

图中，娃娃菜(a)；紫菜薹(b)；榨菜(c)；快菜(d)；白菜(e)；油麦菜(f)；萝卜(g)；莴苣(h)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。

下述实施例所用的试剂或原料，均购自商业渠道。

植物激素吲哚-3-乙酸、赤霉素、玉米素、脱落酸采用高效液相色谱-质谱联用仪分析检测，检测条件为：色谱柱sb-c18柱(4.6x150mm)，流动相为甲醇：0.075％乙酸水溶液＝45：55，柱温为30℃，流速为0.7ml/min，进样量为10微升。

实施例1

解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciensd2wm促生机理研究

(1)检测解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciensd2wm中植物激素种类与含量：

将活化好的解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciensd2wm按1％的接种量接种到50ml液体lb培养基中，30℃，180转振荡20h。将发酵液10000rpm离心10min，将上清液转移到三角瓶中，加入50ml乙酸乙酯，充分摇晃之后，加入分液漏斗静止，完全分开。收集上层，用37℃、100rpm蒸干。再用1ml甲醇溶解，过0.45μm微滤膜，备用。

采用高效液相色谱-质谱联用仪对上述甲醇提取物进行检测分析，检测条件为色谱柱sb-c18柱(4.6×150mm)，流动相为甲醇：0.075％乙酸水溶液＝45：55，柱温为30℃，流速为0.7ml/min，进样量为10微升。结果显示，解淀粉芽孢杆菌发酵液甲醇提取物中含有吲哚-3-乙酸、赤霉素、玉米素、脱落酸4种植物激素，且其中高产吲哚-3-乙酸这种激素。

表1解淀粉芽孢杆菌b.amyloliquefaciensd2wm产植物激素种类及含量

(2)解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciensd2wm溶磷固氮作用检测分析：

a：菌株及培养基的制备：

将保藏的d2wm菌株接入lb液体培养基中培养30℃，180r·min^-1摇床培养20h后，用接种环在lb固体培养基上划线培养，得到单菌落。

购买青岛海博生物技术有限公司的无机磷培养基和固氮检测培养基(阿须贝氏培养基)，按照配方配置后，常规灭菌处理后倒平板备用。

b：溶磷能力的检测

挑取菌株d2wm单菌落，用接种环挑取菌体在无机磷培养基平板中央培养，在30℃恒温培养箱培养1-2天，观察培养基上是否有溶磷圈，结果如图1所示，菌株d2wm可以产生白色的溶磷圈，具有溶解磷的能力。

c：固氮能力的检测

挑取菌株d2wm单菌落，用接种环划线在阿须贝氏培养基培养，在30℃恒温培养箱培养1-2天，观察菌株是否能在培养基上生长，结果如图2所示，菌株d2wm可以在固氮检测培养基上生长，具有固氮的能力。

解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciensd2wm溶磷固氮功能能促进蔬菜对环境中磷和氮的吸收，显著促进蔬菜生长。

实施例2

解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciensd2wm菌悬液对不同蔬菜的促生作用

制备菌悬液并处理：将发酵液10000r·min^-1离心10min，去除上清液收集菌体，加入无菌水使菌体均匀悬浮于无菌水中，即得菌悬液。调整菌悬液浓度为0.5×10⁹cfu·ml^-1，将娃娃菜、菜薹、榨菜、快菜、白菜、油麦菜、萝卜、莴苣8种蔬菜种子使用4％氯化钠表面消毒后浸泡在菌悬液中4h，对照用无菌水浸泡。将上述处理过的种子分别放入铺有灭菌滤纸的培养皿内，每皿20粒，加入无菌水10ml放入培养箱，25℃培养，蒸发损失的水以无菌水补充，试验重复3次。待种子发芽时，统计种子萌发率，于发芽后3～5d测量芽长，并称量鲜质量。

由图3可知，b.amyloliquefaciensd2wm菌悬液处理蔬菜种子后的发芽率均高于水处理，使娃娃菜、紫菜薹、榨菜、快菜、白菜、油麦菜、萝卜、莴苣的发芽率分别提高了21.7、16.7、1.7、6.7、10、10、1.7、13.3个百分点。由表2可知，b.amyloliquefaciensd2wm菌悬液处理蔬菜种子后可以显著促进多种蔬菜的芽长和鲜重，尤其是可以促进榨菜和萝卜的芽长和鲜重，其中可以提高榨菜芽长和鲜重为26.8％和41.2％；提高萝卜的芽长和鲜重分别为76.8％和77.4％。

表2解淀粉芽孢杆菌b.amyloliquefaciensd2wm菌悬液对蔬菜芽长和鲜重的影响

其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。