一种以杉木未木质化侧枝新梢为外植体的诱导生根方法与流程

本发明属于植物繁育
技术领域：
，具体涉及一种以杉木未木质化侧枝新梢为外植体的诱导生根方法。
背景技术：
：杉木的繁育方式包括杂交、扦插、嫁接以及组织培养法。种子育苗是通过雌雄授粉完成，往往会存在大小年，且繁育后代会不断发生基因重组，无法保持母代的优良遗传性状得以稳定传递，通过无性繁殖可以解决这种后代分离问题。但随着杉木造林规模和经营水平的不断扩大，扦插与嫁接难以满足这一庞大需求，因此组织培养技术开始成为杉木无性系改良和培育的重要技术手段，其育苗过程逐步发展为科学的、规模的工厂化生产。与传统育苗方式相比组织培养技术培育出的苗木不仅生长健壮且整齐，而且原株的优良基因型包括加性和非加性效应可以稳定的遗传。南京林业大学已建立了包括“洋020”、“洋061”等多个优良无性系的组培快繁体系，为杉木无性系造林提供了丰富资源，同时也创造了巨大的经济财富。目前杉木组织培养主要存在的问题包括：(1)基因型差异造成了杉木对组织培养的不同要求，比如外植体选择、基本培养基、激素配比等，因而需要为不同无性系建立一个系统的组培体系；(2)杉木外植体感染率高的问题仍然存在，迫切需要针对不同无性系材料去为它们筛选出最适的消毒灭菌方式，从而降低外植体的感染率和褐变率；(3)杉木外植体的增殖倍数、生根率以及增殖苗和根的质量有待进一步提高。因此，对杉木组织培养体系进行深入探究与完善意义重大。技术实现要素：发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种以杉木未木质化侧枝新梢为外植体的诱导生根方法，具有方法简单、诱导率高，生根率高等优点。技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：一种以杉木未木质化侧枝新梢为外植体的诱导生根方法，包括以下步骤：1)取c34号或c35号无性系杉木的中上部未木质化侧枝新梢作为外植体材料，进行消毒处理，备用；2)将处理好的外植体接种在诱导培养基中，诱导培养30天以上，获得不定芽；其中，诱导培养基的基本培养基为3/4ms或1/2ms，附加有6-ba和naa；3)将步骤2)诱导后的外植体接种到增殖培养基中，进行不定芽的增殖培养40天以上；其中，增殖培养基的基本培养基为dcr，附加有6-ba和iba；4)将步骤3)增殖后的外植体，接种到生根培养基中，进行不定芽的生根培养30天以上；其中生根培养基以dcr培养基为基本培养基，附加0.2～0.4gm/liba、0.05～0.1gm/lnaa。步骤1)中，以杉木中上部未木质化侧枝新梢作为外植体材料，穗条长8cm，分别于4月中旬晴天采集，采集后先用清水冲洗1-2h；多余茎段和针叶用剪刀剪去，保留3-5cm长的穗条，再用无菌水清洗去除附着在穗条上的碎叶，然后摆放在空瓶内进行消毒处理。步骤1)中，消毒处理：75％酒精浸泡20～30s，清洗；0.1％升汞浸泡7～8min，轻荡，清洗。步骤1)中，完成消毒后开始接种，首先用手术刀修去褐化叶片，保留0.3mm长；接着将每个穗条切割成1-1.5cm长的小段。步骤2)中，将步骤1)处理好的c35号外植体接种在3/4ms+0.8mg/l6-ba+0.1～0.2mg/lnaa培养基中，温度25±2℃；光照12h.d-15h.d；光照强度为1500-20001x；诱导培养30天以上。步骤2)中，将步骤1)处理好的c34号外植体接种在1/2ms+0.8mg/l6-ba+0.2mg/lnaa或3/4ms+0.8mg/l6-ba+0.1mg/lnaa培养基中，温度25±2℃；光照12h.d-15h.d；光照强度为1500-20001x；诱导培养30天以上。步骤3)中，外植体为c34号无性系外植体，增殖培养基为dcr+0.6mg/l6-ba+0.3mg/liba。步骤3)中，外植体为c35号无性系外植体，增殖培养基为dcr+0.6mg/l6-ba+0.3mg/liba。步骤4)中，选取增殖继代2次以上长度达到3-4cm的健壮组培苗，剔除基部粘附的培养基，再将其接种到生根培养基上。步骤4)中，c34号无性系组培苗生根诱导的适宜培养基为dcr+0.4mg/liba+0.1mg/lnaa；c35号无性系组培苗生根诱导的最佳培养基为dcr+0.4mg/liba+0.05-0.1mg/lnaa。有益效果：与现有技术相比，本发明的以杉木未木质化侧枝新梢为外植体的诱导生根方法，具有以下优势：1)当前杉木外植体诱导生根多采用1/4ms作为基本培养基，但本方法表明dcr上的生根效果和组培苗成活率要明显高于1/4ms培养基；2)酒精与升汞的组合处理更为适用杉木外植体消毒，其最适消毒方式为：75％酒精20～30s+0.1％升汞8～10min；3)c34号、c35号无性系的最适诱导培养基为1/2ms+0.8mg/l6-ba+0.2mg/lnaa或3/4ms+0.8mg/l6-ba+0.1mg/lnaa；4)有利于提高各无性系增殖倍数的最佳增殖培养基为dcr+0.6mg/l6-ba+0.3mg/liba；5)以dcr为生根诱导的基本培养基，各无性系的最适培养基为dcr+0.4mg/liba+0.3～0.5mg/lnaa。6)为杉木各无性系个体诱导生根提供一种较为适宜的方法。附图说明图1是c34号、c35号无性系杉木的树形、针叶、树皮自然状态图；图2是c34号、c35号无性系杉木的外植体的诱导情况结果图；图3是c34号、c35号无性系杉木的外植体的增殖情况结果图；图4是组培苗接种的生根结果图；图中，a.组培苗接种20天后不定根生长情况；b.接种25天后不定根生长情况；c.接种35天后不定根生长情况；d.不定根的产生部位；图5是naa与iba组合处理下的c34号、c35号无性系组培苗生根情况结果图。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。以下实施例所使用的材料为：优良无性系杉木单株是由福建洋口国有林场提供的，杉木第四代种质示范林，位于道坪工区14林班5大班2小班，2015年2月定砧，2016年3-4月嫁接。以下实施例中的c34号、c35号无性系的植物资源对社会公众开放，可以获得。c35号、c34号无性系杉木自然类型如表1所示，自然生长情况如图1所示。表1c34号、c35号无性系杉木自然类型调查表以下实施例中，除另有说明外，其培养条件均为：温度25±2℃；光照12h.d-15h.d；光照强度为1500-2000lx。实施例1外植体消毒灭菌体系的建立1)外植体的获取以杉木中上部未木质化侧枝新梢作为外植体材料，穗条长约8cm，分别于4月中旬晴天采集，取材时间在8:30-9:00.am。采集后先用清水冲洗1-2h；多余茎段和针叶用剪刀剪去，保留3-5cm长的穗条，再用无菌水清洗4次洗去附着在穗条上的碎叶，然后用镊子将穗条整齐摆放在空瓶内进行消毒处理；完成消毒后开始接种，首先用手术刀修去褐化叶片，约保留0.3mm长；接着将每个穗条切割成1-1.5cm左右长的小段。2)消毒灭菌处理本次杉木外植体消毒处理所用的消毒剂是75％酒精和0.1％升汞，试验共设置了4个处理，其中不同消毒处理方式如表2所示。将外植体接种在附加0.6mg/l6-ba、30g/l蔗糖和8g卡拉胶的1/2ms培养基，ph调至5.8左右；温度25±2℃；光照12h.d-15h.d；光照强度为1500-2000lx；每个处理分别接种15个，3次重复，每5天统计一次外植体的污染与萌发情况。表2不同消毒处理方式结果显示，c35号无性系污染率在处理2、3、4三组均是递减的，这说明延长酒精和升汞的浸泡时间可以大大降低污染率；在处理4下3种无性系的污染率分别为7.7％、30.0％、3.5％时，褐化率分别对应为15.4％、26.7％、96.4％，这表明延长消毒剂的处理时间虽然可以大大降低污染率，但同时会伴随褐化加深甚至导致外植体死亡，因此在保证外植体成活率和降低污染率的条件下，消毒灭菌环节必须严格把控酒精和升汞的处理时间结合污染率和褐化率，结果表明c35号无性系较为适用的消毒方式是处理1，其次处理2、处理3。但培养20天后，在c35号无性系在处理1下的污染率和褐化率却均表现最低(分别为16.7％，0％)，这表明单独使用升汞对部分无性系前期培养阶段也能取得较佳的消毒效果，但培养30天后却发现处理1下的污染率增幅较大。因此，酒精与升汞的组合处理更为适用杉木外植体消毒，其最适消毒方式为：75％酒精20～30s+0.1％升汞8～10min。实施例2不定芽的诱导将以林区内c34号、c35号无性系的侧枝新梢作为杉木外植体，早春取材，所采用的灭菌方法为：75％酒精浸泡30s+1％升汞浸泡9min，震荡1min。诱导培养基配方：1/2ms、dcr、3/4ms；6-ba：0.6mg/l、0.8mg/l、1.0mg/l；iaa：0.1mg/l、0.2mg/l、0.3mg/l；蔗糖30g，卡拉胶8.5g，活性炭1.0g，ph5.8。共9个处理，每个处理接种30瓶，每瓶接种1个外植体，温度25±2℃；光照12h.d-15h.d；光照强度为1500-20001x。在诱导30天后进行数据统计。各诱导培养基配方如表3所示。表3不同诱导培养基配方表不定芽的诱导发生：茎尖的分生能力明显强于茎段，观察发现萌芽发生在茎段的叶腋部和基部，10-14天首先发生膨胀，接着出现淡黄色凸起，在经过一段时间后凸起逐渐演变成嫩绿色的侧芽和从生芽，其发生过程如图2所示。培养40天后，平均萌芽数最多可达7.5个，外植体萌芽率较高。1)c35号无性系诱导试验结果表4c35号无性系在不同处理下的诱导情况表5c35号无性系诱导结果的极差分析结果如表4、表5所示，根据r值，将不同因素对增殖倍数、有效芽比例、有效芽数的影响按从大到小的顺序排列，naa和培养基是影响c35号无性系增殖倍数的关键因素，培养基是影响c35号无性系有效芽比例和有效芽数的关键因素。结果表明处理2的增殖倍数最高，其次是处理8和处理9(增殖倍数分别为7.0、6.7和6.3)。但处理2与处理8相比有效芽比例较小(77.0％＞21.4％)，有效芽数少(5.1个＞1.5个)；处理8的有效芽比例最高，其次是处理7和处理9(有效芽比例分别为77％、62.5％和54.7％)；处理8的有效芽最多，其次是处理9和处理7(有效芽数分别为5.1、3.5和3.3)。因此，综合以上分析结果可以发现，以c35号无性系侧枝春梢为外植体材料，其最适诱导培养基为3/4ms+0.8mg/l6-ba+0.1-0.2mg/lnaa。2)c34号无性系诱导试验结果分析表6c34号无性系在不同处理下的诱导情况表7c34号无性系诱导结果的极差分析试验结果如表6、表7所示，表明处理9的增殖倍数最高，其次是处理2和处理6(增殖倍数分别为7.5、5.5和5.5)。处理2诱导的不定芽生长良好，有效芽数最多3.5个，而处理6和处理9的有效芽比例较低，分别是36.4％、33.3％，且9号处理下的不定芽出现玻璃化；处理3的有效芽比例最高，其次是处理8和处理2(有效芽比例分别为66.7％、65.0％和63.6％)，但在三种处理中平均有效芽数t2＞t8＞t3(3.5＞3.25＞3.0)，增殖倍数t2＞t8＞t3(5.5＞5.5＞4.5)；处理2的有效芽比例最高，其次是处理8和处理3(有效芽数分别为3.5、3.25和3.0)。根据r值，将不同因素对增殖倍数、有效芽比例、有效芽数的影响按从大到小的顺序排列，6-ba和naa是影响c34号无性系增殖倍数的关键因素，6-ba和培养基是影响c34号无性系有效芽比例的关键因素，6-na是影响c34号无性系有效芽数的关键因素。因此，综合以上分析结果可以发现，以c34号无性系侧枝春梢为外植体材料，其最适诱导培养基为1/2ms+0.8mg/l6-ba+0.2mg/lnaa或3/4ms+0.8mg/l6-ba+0.1mg/lnaa。实施例3杉木继代增殖体系的建立材料：由诱导试验阶段培养而来的c34号、c35号无性系组培苗。继代增殖试验以培养基：ms、1/2ms、dcr；6-ba：0.3mg/l、0.6mg/l、1.0mg/l；naa：0mg/l、0.1mg/l、0.2mg/l；iba：0.1mg/l、0.2mg/l、0.3mg/l；蔗糖30g/l，卡拉胶8.5g/l，活性炭1.0g/l，ph＝5.8；共9个处理，每个处理接种20瓶，每瓶接种4～6个外植体；培养40天后统计组培苗的增殖系数、萌芽数以及外植体生长情况。各继代增殖培养基配方如表8所示。表8不同增殖培养基配方表继代培养40天后统计组培苗的增殖情况，采用spss和r语言完成统计数据的处理与分析，处理间的差异显著性在0.05水平上进行方差分析、lsd多重对比。其中，增殖倍数＝新增苗数/原接入苗数；平均芽数＝总共产生的不定芽数/诱导出不定芽的外植体总数。1)c34号组培苗的继代增殖培养表9不同增殖培养基对c34号增殖的影响培养基茎尖数萌芽数有效芽新增数增殖倍数有效芽比例平均萌芽112165292.431.2％1.3221277723.4326.0％1.2931150161.450.0％0.45410133282.830.0％1.3510114262.636.4％1.1614111241.79.1％0.79711128403.6466.7％1.0989157444.8946.7％1.6691291302.511.1％0.75表10c34号无性系诱导结果的极差分析结果如表9、表10所示，根据r值，将不同因素对增殖倍数、平均萌芽数的影响按从大到小的顺序排列：6-ba＞培养基＞iba＞naa；6-ba＞naa＞培养基＞iba，6-ba是影响c34号无性系增殖倍数和平均萌芽数的关键因素。极差分析结果表明，有助于提高c34号无性系增殖倍数的最佳培养基为dcr+0.6mg/l6-ba+0.3mg/liba。2)c35号组培苗的继代增殖培养表11不同增殖培养基对c35号无性系增殖的影响培养基茎尖数萌芽数有效芽新增数增殖倍数有效芽比例平均萌芽1263210612.431.3％1.2226207542.135.0％0.8356171.416.7％1.241630462.90.0％0.25560112.20.0％1.269183242.716.7％2.072163633.050.0％0.38203826753.868.4％1.999142222.414.3％1.6表12c35号无性系诱导结果的极差分析结果如表11、表12所示，根据r值，将不同因素对增殖倍数的影响按从大到小的顺序排列：培养基＞naa＞6-ba＞iba；6-ba＞naa＞iba＞培养基，其中6-ba是影响c35号无性系增殖倍数和平均萌芽数的关键因素。极差分析结果表明，有助于提高c35号无性系增殖倍数的最佳培养基为dcr+0.6mg/l6-ba+0.3mg/liba。实施例4杉木瓶内生根体系的建立以dcr培养基为基本培养基，附加iba(0.2gm/l、0.4gm/l)、naa(0.05gm/l、0.1gm/l)、20g/l蔗糖和8.2g卡拉胶，ph＝5.8。选取增殖继代2次以上长度达到3-4cm的健壮组培苗，剔除基部粘附的培养基，再将其接种到生根培养基上。试验设3个重复，每个无性系接种10瓶，每瓶10根组培苗。每隔一周统计培苗生根诱导和生长情况。表13不同生长激素配比对生根诱导的影响表14不同生长激素配比对生根诱导的影响结果的极差分析试验结果如表13、14、图4和图5所示，显示，naa是影响c34号无性系生根率的关键因素，iba是影响c35号无性系生根率的关键因素。从表13可以看出，有助于提高c34号无性系生根率的最佳激素配比为0.4mg/liba+0.1mg/lnaa，生根率达30％，组培苗生长良好。多重比较结果表明，在0.05的显著性水平下，第4组与其他三组的生根率均值存在显著差异，而第1组和第2、3两组的差异不显著。由表14可知，第4组生根率最高30.0％，平均根数2-3根，平均根长4-5cm；第2组生根率13.3％，根数2-3根/个，根长5cm；第1组生根率仅10.0％，且多为单根系，根长5.8cm；而第3组无不定根产生。因此综合生根率和成活率，本次实验结果表明c34号无性系组培苗生根诱导的适宜培养基为dcr+0.4mg/liba+0.1mg/lnaa。有助于c35号无性系提高生根率的最佳激素配比为0.4mg/liba+0.05-0.1mg/lnaa，生根率达20～22％，组培苗生长良好。多重比较结果表明，在0.05的显著性水平下，第4组与其他三组的生根率均值存在显著差异。由表20可知，第3组生根率最高21.8％；第4组生根率次之19.9％；第1、2组生根率分别为0％、9.3％。因此本次实验结果表明c35号无性系组培苗生根诱导的最佳培养基为dcr+0.4mg/liba+0.05-0.1mg/lnaa。当前第1页12