一种以杉木的萌蘖芽作为外植体进行诱导生根方法与流程

本发明属于植物繁育
技术领域：
，具体涉及一种以杉木的萌蘖芽作为外植体进行诱导生根方法。
背景技术：
：杉木的繁育方式包括杂交、扦插、嫁接以及组织培养法。种子育苗是通过雌雄授粉完成，往往会存在大小年，且繁育后代会不断发生基因重组，无法保持母代的优良遗传性状得以稳定传递，通过无性繁殖可以解决这种后代分离问题。但随着杉木造林规模和经营水平的不断扩大，扦插与嫁接难以满足这一庞大需求，因此组织培养技术开始成为杉木无性系改良和培育的重要技术手段，其育苗过程逐步发展为科学的、规模的工厂化生产。与传统育苗方式相比组织培养技术培育出的苗木不仅生长健壮且整齐，而且原株的优良基因型包括加性和非加性效应可以稳定的遗传。南京林业大学已建立了包括“洋020”、“洋061”等多个优良无性系的组培快繁体系，为杉木无性系造林提供了丰富资源，同时也创造了巨大的经济财富。目前杉木组织培养主要存在的问题包括：(1)基因型差异造成了杉木对组织培养的不同要求，比如外植体选择、基本培养基、激素配比等，因而需要为不同无性系建立一个系统的组培体系；(2)杉木外植体感染率高的问题仍然存在，迫切需要针对不同无性系材料去为它们筛选出最适的消毒灭菌方式，从而降低外植体的感染率和褐变率；(3)杉木外植体的增殖倍数、生根率以及增殖苗和根的质量有待进一步提高。因此，对杉木组织培养体系进行深入探究与完善意义重大。技术实现要素：发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种以杉木的萌蘖芽作为外植体进行诱导生根方法，具有方法简单、生根率高等优点。技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：一种以杉木的萌蘖芽作为外植体进行诱导生根方法，包括以下步骤：1)取c54号或c64号无性系杉木的萌蘖芽作为外植体材料，进行消毒处理，备用；2)将处理好的外植体接种在诱导培养基中，诱导培养30天以上，获得不定芽；其中，诱导培养基的基本培养基为dcr，附加有6-ba和naa；3)将步骤2)诱导后的外植体接种到增殖培养基中，进行不定芽的增殖培养40天以上；其中，增殖培养基的基本培养基为dcr，附加有6-ba和iba；4)将步骤3)增殖后的外植体，接种到生根培养基中，进行不定芽的生根培养30天以上；其中生根培养基以dcr培养基为基本培养基，附加iba、naa。步骤1)中，灭菌方法为：75％酒精浸泡30s+1％升汞浸泡9min，震荡1min。步骤2)中，c54号无性系，dcr+0.6mg/l6-ba+0.2mg/lnaa。步骤2)中，c64号无性系的最佳诱导培养基为dcr+0.6mg/l6-ba+0.2～0.3mg/lnaa。步骤3)中，增殖培养基中，6-ba浓度为0.6mg/l，iba浓度为0.3mg/l。步骤4)中，生根培养基中，iba浓度为0.4mg/l，naa浓度为0.1mg/l。步骤4)中，生根培养基中，iba浓度为0.4mg/l，naa浓度为0.3～0.5mg/l。有益效果：与现有技术相比，本发明的以杉木的萌蘖芽作为外植体进行诱导生根方法，具有以下优势：1)当前杉木外植体诱导生根多采用1/4ms作为基本培养基，但本方法表明dcr上的生根效果和组培苗成活率要明显高于1/4ms培养基；2)c54号、c64号无性系的最佳诱导培养基为dcr+0.6mg/l6-ba+0.2-0.3mg/lnaa。3)有利于提高各种无性系增殖倍数的最佳增殖培养基为dcr+0.6mg/l6-ba+0.3mg/liba；4)以dcr为生根诱导的基本培养基，最适培养基为dcr+0.4mg/liba+0.3～0.5mg/lnaa。5)为杉木各无性系个体诱导生根提供一种较为适宜的方法。附图说明图1是c54号、c64号无性系杉木的树形、针叶、树皮自然状态图；图2是c54号、c64号无性系杉木的外植体的诱导情况结果图；图3是c54号、c64号无性系杉木的外植体的增殖情况结果图；图4是组培苗接种的生根结果图；图中，a.组培苗接种20天后不定根生长情况；b.接种25天后不定根生长情况；c.接种35天后不定根生长情况；d.不定根的产生部位；图5是c54号无性系gn1/gn2/gn3组培苗生根情况结果图；图6是c64号无性系gn1/gn2/gn3组培苗生根情况结果图；图7是naa与iba组合处理下的c54号、c64号无性系组培苗生根情况结果图；图8是改良生根培养基上c54号无性系组培苗生根情况结果图，左2号，右3号。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。以下实施例所使用的材料为：优良无性系杉木单株是由福建洋口国有林场提供的，杉木第四代种质示范林，位于道坪工区14林班5大班2小班，2015年2月定砧，2016年3-4月嫁接。以下实施例中的c54、c64号无性系的植物资源对社会公众开放，可以获得。c54号、c64号无性系杉木自然类型如表1所示，自然生长情况如图1所示。表1c54号、c64号无性系杉木自然类型调查表以下实施例中，除另有说明外，其培养条件均为：温度25±2℃；光照12h.d-15h.d；光照强度为1500-2000lx。实施例1以c54、c64号无性系的萌蘖芽作为杉木外植体，早春取材，采用的灭菌方法为：75％酒精浸泡30s+1％升汞浸泡9min，震荡1min，灭菌后备用。诱导培养基配方：1/2ms、dcr、3/4ms；6-ba：0.6mg/l、0.8mg/l、1.0mg/l；iaa；0.1mg/l、0.2mg/l、0.3mg/l；蔗糖30g，卡拉胶8.5g，活性炭1.0g，ph5.8。共9个处理，每个处理接种30瓶，每瓶接种1个外植体，温度25±2℃；光照12h.d-15h.d；光照强度为1500-2000lx。在诱导30天后进行数据统计。各诱导培养基配方如表2所示。表2不同诱导培养基配方表不定芽的诱导发生：茎尖的分生能力明显强于茎段，观察发现萌芽发生在茎段的叶腋部和基部，10-14天首先发生膨胀，接着出现淡黄色凸起，在经过一段时间后凸起逐渐演变成嫩绿色的侧芽和从生芽，其发生过程如图2所示。培养40天后，平均萌芽数最多可达7.5个，外植体萌芽率较高。1)c54号无性系不定芽诱导实验结果表3c54号无性系在不同处理下的诱导情况表4c54号无性系诱导结果的极差分析结果如表3和表4所示，可知，c54号无性系在处理4、处理7、处理8下的萌芽率均达到100％；在处理2下茎尖伸长最快，诱导15天后高度可达4.8cm；在处理4下的平均芽数最多，可达2.75个。根据r值，将不同因素对萌芽率、茎尖生长、平均芽数影响按从大到小的顺序排列，培养基是影响c54号无性系茎段萌芽率和平均芽数的主导因素，6-ba和naa是决定c54号无性系茎尖生长的重要因素。因此，综合以上分析结果可以发现，c54号无性系的最佳诱导培养基为dcr+0.6mg/l6-ba+0.2mg/lnaa。2)c64号无性系不定芽诱导实验结果表5c64号无性系在不同处理下的诱导情况表6c54号无性系诱导结果的极差分析结果如表5和表6所示，可知，c64号无性系在9种培养基上的萌芽率均超过80％；在处理4下茎尖伸长最快，诱导15天后高度可达5.6cm；c64号无性系在处理4下的平均芽数最多，可达5.0个。根据r值，将不同因素对萌芽率、茎尖生长、平均芽数影响按从大到小的顺序排列，6-ba是影响c64号无性系茎段萌芽率的主导因素，naa是决定c64号无性系茎尖生长的重要因素，培养基是决定c64号无性系茎段平均芽数的主导因素。因此，综合以上分析结果可以发现，c64号无性系的最佳诱导培养基为dcr+0.6mg/l6-ba+0.2～0.3mg/lnaa。实施例2杉木继代增殖体系的建立材料：由诱导试验阶段培养而来的c54号、c64号无性系组培苗。继代增殖试验以培养基：ms、1/2ms、dcr；6-ba：0.3mg/l、0.6mg/l、1.0mg/l；naa：0mg/l、0.1mg/l、0.2mg/l；iba：0.1mg/l、0.2mg/l、0.3mg/l；蔗糖30g/l，卡拉胶8.5g/l，活性炭1.0g/l，ph＝5.8；共9个处理，每个处理接种20瓶，每瓶接种4～6个外植体；培养40天后统计组培苗的增殖系数、萌芽数以及外植体生长情况。各继代增殖培养基配方如表7所示。表7不同增殖培养基配方表序号培养基6-ba(mg/l)naa(mg/l)iba(mg/l)11/2ms0.300.121/2ms0.60.10.231/2ms1.00.20.34ms0.30.10.35ms0.60.20.16ms1.000.27dcr0.30.20.28dcr0.600.39dcr1.00.10.1继代培养40天后统计组培苗的增殖情况，采用spss和r语言完成统计数据的处理与分析，处理间的差异显著性在0.05水平上进行方差分析、lsd多重对比。其中，增殖倍数＝新增苗数/原接入苗数；平均芽数＝总共产生的不定芽数/诱导出不定芽的外植体总数。1)c54号组培苗的继代增殖培养表8不同增殖培养基对c54号增殖的影响由表8可知，第8组的平均增殖倍数最高，第7组次之，它们平均增殖倍数分别为2.86、2.53倍。通过观察发现，外植体可通过增高或萌芽两种途径进行增殖，其中7号主要借助增高方式达到增殖，外植体基部和部分培养基出现暗褐，平均萌芽数仅为0.37个；而8号在增高的同时萌发较多不定芽，萌芽生长健壮叶片舒展，平均萌芽数为3.0个。因此，综合分析试验结果表明，利于c54号无性系增殖的最佳培养基为dcr+0.6mg/l6-ba+0.3mg/liba。2)c64号组培苗的继代增殖培养表9不同增殖培养基对c64号增殖的影响由表9可知，在0.05的显著性水平下，第7组和第8组的增殖倍数平均值差异不显著，而这两组与其他7组却存在显著差异。第7组的平均增殖倍数最高3.61倍，第8组和第4组次之，平均增殖倍数分别为3.5、3.2倍。通过观察发现，7号生长较快，但外植体基部和部分培养基出现暗褐，平均萌芽数为1.2个；8号萌芽生长健壮叶片舒展，平均萌芽数为2.0个；4号基部形成大量愈伤组织，平均萌芽数为1.4个，4号增殖培养基可作用于愈伤的增殖培养。因此，综合分析试验结果表明，利于c64号无性系增殖的最佳培养基为dcr+0.6mg/l6-ba+0.3mg/liba。实施例3杉木瓶内生根体系的建立(1)基本培养基对生根诱导的影响以c54号无性系组培苗作为生根材料，基本培养基1/4dcr、1/4ms、dcr，附加0.8mg/lnaa，蔗糖20g/l，卡拉胶根据培养基的软硬度进行调节。3种生根培养基的配方分别为：①1/4dcr+0.8mg/lnaa+20g/l蔗糖+8.7g卡拉胶；②1/4ms+0.8mg/lnaa+20g/l蔗糖+9.0g卡拉胶；③dcr+0.8mg/lnaa+20g/l蔗糖+8.5g卡拉胶。杉木组培苗在诱导生根的培养过程中，观察发现其不定根会经历以下形态变化。如图4所示，前15天，组培苗生长良好，暂无不定根产出；15天，组培苗基部膨大形成愈伤组织；20天，在组培苗切口愈伤组织和近切口茎段皮层均有不定根产生，如米粒大小；30天，不定根伸长生长的同时会有新根产生；30天后，基本无新根产生，不定根长度也不在变化。2)基本培养基对生根诱导的影响表10不同培养基的生根结果c54号组培苗经过生根诱导40天后，如图5所示，3种处理下的不定根生长状况存在明显差异。由表10可知，第3组生根率最高80.0％，平均根数7-8根，平均根长3.0cm；第1组次之74.433％，根数10根/个，根长3.2cm；第2组最低50.0％，根数3-4根/个，根长2.2cm；而3组处理下的组培苗成活率并无差异。因此综合生根率和成活率，本次结果表明，dcr是组培苗生根诱导较为适宜的基本培养基。由表10可知，第2组生根率最高21.1％，根数1根/个，根长4-5cm；第1组次之11.10％，根数2根/个，根长1.5-2.0cm；第2组最低4.43％，几乎无不定根产生；而3组处理下的组培苗成活率有显著差异，第3组组培苗生产良好成活率达95％，另外两组均出现瓶苗褐化现象成活率较低。在提高组培苗生根率的同时，须保障苗木能够稳定成活。因此综合分析试验结果表明，dcr是组培苗生根诱导较为适宜的基本培养基(2)不同生长激素配比对生根诱导的影响以dcr培养基为基本培养基，附加iba(0.2gm/l、0.4gm/l)、naa(0.05gm/l、0.1gm/l)、20g/l蔗糖和8.2g卡拉胶，ph＝5.8。选取增殖继代2次以上长度达到3-4cm的c54号无性系健壮组培苗，剔除基部粘附的培养基，再将其接种到生根培养基上。试验设3个重复，每个无性系接种10瓶，每瓶10根组培苗。每隔一周统计培苗生根诱导和生长情况。表11不同生长激素配比对生根诱导的影响表12不同生长激素配比对生根诱导的影响结果的极差分析变量ibanaak19.3％21.9％k241.7％29.2％k14.7％10.9％k220.9％14.6％r16.2％3.7％最佳水平0.40.1试验结果如表11、12和图6所示，显示，iba是影响c54号无性系生根率的关键因素，其中本次试验中c64号无性系的生根效果较差(图7)。从表11可以看出，有助于c54号无性系提高生根率的最佳激素配比为0.4mg/liba+0.1mg/lnaa，生根率达65.4％，组培苗生长良好。多重比较结果表明，在0.05的显著性水平下，第4组与其他三组的生根率均值存在显著差异。由表11可知，第4组生根率最高65.4％；第1组生根率次之51.2％；第2、3组生根率分别为41.8％、48.7％。因此本次结果表明c54号无性系组培苗生根诱导的最佳培养基为dcr+0.4mg/liba+0.1mg/lnaa。(3)生根培养基改良实验结果本次改良试验意在，通过加大naa浓度梯度来进一步提高组培苗生根率。以四种无性系组培苗为生根材料，以dcr培养基为基本培养基，附加iba(0.4mg/l)、naa(0.1mg/l、0.3mg/l、0.5mg/l)、20g/l蔗糖和8.2g卡拉胶，ph＝5.8。选取增殖继代2次以上长度达到3-4cm的健壮组培苗，剔除基部粘附的培养基，再将其接种到生根培养基上。试验设3个重复，每个无性系接种10瓶，每瓶10根组培苗。每隔一周统计培苗生根诱导和生长情况。表13不同改良培养基对c54号无性系生根诱导的影响由表13可知，随着naa浓度的加大，c54号无性系组培苗的生根率呈现递增趋势，其中以3号生根率最高87.3％，2号次之85.5％；但观察2号根系长势优于3号，2号苗根系须根较多，根系发达(图8)。本次实验结果表明，通过增加naa浓度可以显著提高组培苗生根率，但浓度过高会对根系质量产生影响。因此，综合分析表明适合c54号无性系生根诱导的最佳培养基为dcr+0.4mg/liba+0.3～0.5mg/lnaa。当前第1页12