一种脂肪间充质干细胞的保存液的制作方法

本发明涉及干细胞保存技术领域，尤其涉及一种脂肪间充质干细胞的保存液。

背景技术：

干细胞是一类原始且未特化的多潜能细胞，具有自我复制的能力。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。脂肪间充质干细胞是干细胞中的一种重要类型，脂肪间充质干细胞是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞，具有可迅速扩增、不易衰老等一般干细胞的特点。人体脂肪间充质干细胞是目前广泛应用于组织工程及再生医学领域的一种成体干细胞，与骨髓间充质干细胞一样具有多向分化潜能。脂肪间充质干细胞呈成纤维细胞样生长，胞浆和核仁丰富，呈平行或漩涡样排列。

正常情况下脂肪间充质干细胞在体外培养时会不停生长分裂从而导致最终衰老和功能丧失，此外，人脂肪间充质干细胞体外长期培养传代容易发生自发分化，失去其多向分化的潜能，而且不间断的培养方式保存也会造成过高的培养成本以及细菌和病原体污染的可能性。为了保证实验的连续性，合理有效利用以及备份足够量的细胞资源，人们需要将有用的细胞种子资源保存起来以供日后方便使用，以及在需要时用于科学研究和临床治疗。

目前，常用的冻存液主要含有二甲基亚砜(dmso)、胎牛血清(fbs)和基础培养基。dmso是细胞保存中最常用的冷冻剂，但它对细胞也存在一定的毒性，常温下能使胞内蛋白变性，从而使冻存的人脂肪间充质干细胞受到损伤，甚至对人脂肪间充质干细胞的存活率造成不利，造成冻存效果不佳。

fbs是细胞保存中最常用的保外保护剂，然而动物来源的血清存在感染病毒病菌等病原体的风险，而且间充质干细胞在接触胎牛血清时会内吞血清物质，当使用胎牛血清保存的间充质干细胞回输人体后，其中的一些蛋白质可能会导致异源蛋白引起的免疫排斥反应，使得间充质干细胞移植后成功率降低的同时，导致不良反应的发生，严重的可能引起过敏性休克。除此之外，血清存在批次之间差异和不稳定性等问题。

因此，现有的脂肪间充质干细胞的保存液存在长时间保存复苏率差与增殖能力下降的缺陷。

技术实现要素：

本发明解决的技术问题在于提供一种脂肪间充质干细胞的保存液，该保存液可使细胞长时间保存后依然具有较好的复苏率，不影响细胞的增值能力。

有鉴于此，本申请提供了一种脂肪间充质干细胞的保存液，包括：甘油、海藻糖和人血白蛋白。

优选的，所述保存液中还包括非必需氨基酸。

优选的，所述保存液中包括：5vol％～10vol％的甘油、5wt％～15wt％的海藻糖、0.8wt％～1.2wt％的非必需氨基酸、余量的人血白蛋白。

优选的，所述甘油的含量为6.5vol％～8.8vol％。

优选的，所述海藻糖的含量为6wt％～12wt％。

优选的，所述非必需氨基酸的含量为0.9wt％～1.0wt％。

优选的，所述保存液的制备方法为：

将海藻糖溶解于生理盐水中过滤后再除菌，然后与甘油、人血白蛋白混合。

本申请提供了一种脂肪间充质干细胞的保存液，其包括：甘油、海藻糖和人血白蛋白，本申请中的甘油和海藻糖相互配合使用，使保存液的液态体系保持稳定，并在该体系形成膜状物质，通过该膜状物质承载和包覆，可以防止脂肪间充质干细胞在冻存过程中沉淀至容器底部堆积成团使脂肪间充质干细胞分散且受到周围保存液的侵蚀，并在保存过程中受到保护，减少其损伤，从而提高脂肪间充质干细胞的保存存活率；进一步的，本申请采用的海藻糖可以与细胞膜形成玻璃态基质，避免细胞外部形成冰晶产生的伤害。

附图说明

图1为本发明实施例1～3与对比例1～3提供的保存液的脂肪间充质干细胞生长天数曲线图。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。

针对现有技术采用二甲基亚砜和胎牛血清作为脂肪间充质干细胞的保存液使细胞复苏率下降与增值能力下降的问题，本发明提供了一种脂肪间充质干细胞的保存液，该保存液具有长时间保存后依然具有较高的复苏率，不影响细胞增殖能力，复苏后细胞保持干细胞的多能性等特点，具体的，本申请实施例公开了一种脂肪间充质干细胞的保存液，包括：甘油、海藻糖和人血白蛋白。

在本申请中，所述脂肪间充质干细胞的保存液中还包括非必需氨基酸。

海藻糖是由两个葡萄糖分子以a,a,1,1-糖苷键构成非还原性糖，自身性质非常稳定。海藻糖对细胞具有保护作用，是因为海藻糖在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境下能在细胞表面形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持细胞的活性和生物特征。许多对外界恶劣环境表现出非凡抗逆耐受力的物种，都与它们体内存在大量的海藻糖有直接的关系。自然界中的蔗糖、葡萄糖等其它糖类均不具备这一功能。

甘油是脂肪醇的一种，具有脂肪醇的化学活性，同时又是多元醇，是简单的三元醇，因此，甘油的化学性质除了脂肪醇的通性外，还有多元醇的性质。

本申请将甘油与海藻糖相互配合使用，使本申请中的保存液的液态体系保持稳定，并在该体系形成膜状物质，通过该膜状物质承载和包覆脂肪间充质干细胞，可以防止其在冻存过程中沉淀至容器底部堆积成团，使脂肪间充质干细胞分散且受到周围冻存液的浸润，并在冻存过程中受到保护，减少其损伤，从而提高脂肪间充质干细胞的冻存存活率；另外，本发明海藻糖可以与细胞膜形成玻璃态基质，避免细胞外部形成冰晶产生的伤害。

人血白蛋白在脂肪间充质干细胞中可维持溶液胶体渗透压，还可维持细胞营养，防止细胞聚集成团。

本申请的保存液还包括非必需氨基酸，其具体可包括l-丙氨酸、l-谷氨酸、l-天(门)冬酰胺、l-天(门)冬氨酸、l-脯氨酸、l-丝氨酸和甘氨酸7种非必需氨基酸，能有效改善细胞培养基配比，降低细胞培养时细胞自身生产非必须氨基酸的副作用，促进细胞增殖代谢，是细胞培养中常用的添加剂之一。在本发明中主要起到维持细胞营养的作用。

在本申请中，所述脂肪间充质干细胞的保存液包括：5vol％～10vol％的甘油、5wt％～15wt％的海藻糖、0.8wt％～1.2wt％的非必需氨基酸、余量的人血白蛋白。甘油、海藻糖、非必需氨基酸的含量超出上述范围对保存液的粘稠度及渗透压都会产生影响，从而影响冻存细胞混匀的程度和细胞形态变化。

在某些具体实施例中，所述甘油的含量为6.5vol％～8.8vol％；在某些具体实施例中，所述海藻糖的含量为6wt％～12wt％；在某些具体实施例中，所述非必需氨基酸的含量为0.9wt％～1.0wt％。

更具体的，在本申请的具体实施例中提供了一种脂肪间充质干细胞的保存液，其包括：5.0vol％的甘油，5wt％的海藻糖，0.8wt％的非必需氨基酸以及余量的人血白蛋白。

在本申请的具体实施例中还提供了一种脂肪间充质干细胞的保存液，其包括：10.0vol％的甘油，15wt％的海藻糖，1.2wt％的非必需氨基酸以及余量的人血白蛋白。

在本申请的具体实施例中还提供了一种脂肪间充质干细胞的保存液，其包括：7.5vol％的甘油，10wt％的海藻糖，1.0wt％的非必需氨基酸以及余量的人血白蛋白。

本申请所述甘油、海藻糖、非必需氨基酸以及人血白蛋白均为本领域技术人员熟知的原料，其来源本申请没有特别的限制。

在本申请中，所述保存液的制备方法按照本领域技术人员熟知的方式制备即可，对此本申请没有特别的限制，为了保证保存液的无菌性，本申请所述保存液的制备方法具体为：

将海藻糖首先溶解于生理盐水中，溶解后再过滤除菌，最后与甘油、非必需氨基酸与人血白蛋白混合，即得到保存液。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的脂肪间充质干细胞的保存液进行详细说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。

实施例1

1)无菌吸取吸脂手术的脂肪抽提液，用生理盐水冲洗2次，去除吸脂手术中所用药物及血细胞；用0.5％i型胶原酶37℃消化0.5小时，400g/min离心5min，吸取上层脂肪后，混匀用200目筛网过滤；将所获得的细胞悬液500g/min，离心8min，细胞沉淀用生理盐水洗涤后，调细胞浓度为7×10⁴个/ml，用含体积分数10％血清的dmem/f12培养基悬浮，接种于10cm培养皿中，置于37℃、体积分数5％co2培养箱中培养；48小时后，吸出悬浮细胞液体，更换新培养基；3天换液1次，培养10天左右细胞达80％以上汇合度时，进行传代培养；

2)用0.25％胰酶对细胞进行消化，弃去培养皿中的培养基或用枪小心吸去培养板中的培养基，生理盐水冲洗两次，用0.25％胰酶消化细胞，500g/min离心5min收集细胞；

3)配制成脂肪间充质干细胞冻存液冻存细胞，细胞密度为1×10⁶个/ml，密封后标记冻存细胞名称，冻存液种类和冻存日期；采用程序降温器放在-80℃冰箱过夜，第二天放入液氮罐长期保存；

4)保存10～20天后把冻存管从液氮中取出来进行复苏，将保存的细胞置于37～42℃的水浴中轻微摇动1.5～2分钟，待液体都融化后，拿出来喷少量酒精放到超净工作台里，然后加入生长培养基进行悬浮，相对每ml的冻存液，生长培养基的加入量为10～15ml，500～700g离心5min收集细胞，把上清液倒掉，再加入生长培养基悬浮，调整细胞浓度至(5～10)×10⁴个/ml，使培养皿中的细胞均匀分布，培养生长至80％融合度，消化后调整细胞浓度至(5～10)×10⁴个/ml接种传代，得到冻存复苏后传代的第1代脂肪间充质干细胞，对脂肪间充质干细胞再进行培养，冻存，复苏率，细胞生长特性检测。

冻存液配方：基础成分为人血白蛋白，添加5％体积的甘油，5％质量百分含量的海藻糖，0.8％质量百分含量的非必需氨基酸。

复苏率检测：分别将冻存1个月、5个月和10个月的样品复苏，每组3个重复，取100μl细胞液与100μl台盼兰混合，取少许细胞混合液加入血球计数器，并利于显微镜下计算细胞数。活细胞不受染色，死细胞会被染成蓝色。计算大九宫格之4大格子总细胞数，除以4，乘以稀释倍数，再乘于10⁴，即是每ml中细胞数数目。即每ml细胞数＝总计算细胞数/4×稀释倍数×10⁴。

细胞生长曲线：细胞复苏洗涤后，用适量培养基重悬细胞，向6孔板中每孔加入2.5ml细胞悬液(含10000个活细胞)，放置37℃，5％co2培养箱中培养7天，每3天换液，每隔24小时取1个6孔板进行消化计数，实验组与对照组取3孔平均值，连续监测7天，将检测结果绘制成脂肪间充质干细胞生长曲线。

实施例2

1)无菌吸取吸脂手术的脂肪抽提液，用生理盐水冲洗2次，去除吸脂手术中所用药物及血细胞；用0.5％i型胶原酶37℃消化0.5小时，400g/min离心5min，吸取上层脂肪后，混匀用200目筛网过滤；将所获得的细胞悬液500g/min，离心8min，细胞沉淀用生理盐水洗涤后，调细胞浓度为7×10⁴个/ml，用含体积分数10％血清的dmem/f12培养基悬浮，接种于10cm培养皿中，置于37℃、体积分数5％co2培养箱中培养；48小时后，吸出悬浮细胞液体，更换新培养基；3天换液1次，培养10天左右细胞达80％以上汇合度时，进行传代培养；

2)用0.25％胰酶对细胞进行消化，弃去培养皿中的培养基或用枪小心吸去培养板中的培养基，生理盐水冲洗两次，用0.25％胰酶消化细胞，500g/min离心5min收集细胞；

3)配制成脂肪间充质干细胞冻存液冻存细胞，细胞密度为1×10⁶个/ml，密封后标记冻存细胞名称，冻存液种类和冻存日期；采用程序降温器放在-80℃冰箱过夜，第二天放入液氮罐长期保存；

4)保存10～20天后把冻存管从液氮中取出来进行复苏，将保存的细胞置于37～42℃的水浴中轻微摇动1.5～2分钟，待液体都融化后，拿出来喷少量酒精放到超净工作台里，然后加入生长培养基进行悬浮，相对每ml的冻存液，生长培养基的加入量为10～15ml，500～700g离心5min收集细胞，把上清液倒掉，再加入生长培养基悬浮，调整细胞浓度至(5～10)×10⁴个/ml，使培养皿中的细胞均匀分布，培养生长至80％融合度，消化后调整细胞浓度至(5～10)×10⁴个/ml接种传代，得到冻存复苏后传代的第1代脂肪间充质干细胞，对脂肪间充质干细胞再进行培养，冻存，复苏率，细胞生长特性检测。

冻存液配方：基础成分为人血白蛋白，添加10％体积的甘油，15％质量百分含量的海藻糖，1％质量百分含量的非必需氨基酸。

复苏率检测：分别将冻存1个月、5个月和10个月的样品复苏，每组3个重复，取100μl细胞液与100μl台盼兰混合，取少许细胞混合液加入血球计数器，并利于显微镜下计算细胞数，活细胞不受染色，死细胞会被染成蓝色，计算大九宫格之4大格子总细胞数，除以4，乘以稀释倍数，再乘于10⁴，即是每ml中细胞数数目，即每ml细胞数＝总计算细胞数/4×稀释倍数×10⁴。

细胞生长曲线：细胞复苏洗涤后，用适量培养基重悬细胞。向6孔板中每孔加入2.5ml细胞悬液(含10000个活细胞)，放置37℃，5％co2培养箱中培养7天，每3天换液。每隔24小时取1个6孔板进行消化计数，实验组与对照组取3孔平均值，连续监测7天。将检测结果绘制成脂肪间充质干细胞生长曲线。

实施例3

1)无菌吸取吸脂手术的脂肪抽提液，用生理盐水冲洗2次，去除吸脂手术中所用药物及血细胞；用0.5％i型胶原酶37℃消化0.5小时，400g/min离心5min，吸取上层脂肪后，混匀用200目筛网过滤；将所获得的细胞悬液1200r/min，离心8min，细胞沉淀用生理盐水洗涤后，调细胞浓度为7×10⁴个/ml，用含体积分数10％血清的dmem/f12培养基悬浮，接种于10cm培养皿中，置于37℃、体积分数5％co2培养箱中培养；48小时后，吸出悬浮细胞液体，更换新培养基；3天换液1次，培养10天左右细胞达80％以上汇合度时，进行传代培养；

2)用0.25％胰酶对细胞进行消化，弃去培养皿中的培养基或用枪小心吸去培养板中的培养基，生理盐水冲洗两次，用0.25％胰酶消化细胞，500g/min离心5min收集细胞；

3)配制成脂肪间充质干细胞冻存液冻存细胞，细胞密度为1×10⁶个/ml，密封后标记冻存细胞名称，冻存液种类和冻存日期；采用程序降温器放在-80℃冰箱过夜，第二天放入液氮罐长期保存；

4)保存10～20天后把冻存管从液氮中取出来进行复苏，将保存的细胞置于37～42℃的水浴中轻微摇动1.5～2分钟，待液体都融化后，拿出来喷少量酒精放到超净工作台里，然后加入生长培养基进行悬浮，相对每ml的冻存液，生长培养基的加入量为10～15ml，500～700g离心5min收集细胞，把上清液倒掉，再加入生长培养基悬浮，调整细胞浓度至(5～10)×10⁴个/ml，使培养皿中的细胞均匀分布，培养生长至80％融合度，消化后调整细胞浓度至(5～10)×10⁴个/ml接种传代，得到冻存复苏后传代的第1代脂肪间充质干细胞，对脂肪间充质干细胞再进行培养，冻存，复苏率，细胞生长特性检测。

冻存液配方：基础成分为人血白蛋白，添加7.5％体积的甘油，10％质量百分含量的海藻糖，1.2％质量百分含量的非必需氨基酸。复苏率检测：分别将冻存1个月、5个月和10个月的样品复苏，每组3个重复，取100μl细胞液与100μl台盼兰混合，取少许细胞混合液加入血球计数器，并利于显微镜下计算细胞数。活细胞不受染色，死细胞会被染成蓝色，计算大九宫格之4大格子总细胞数，除以4，乘以稀释倍数，再乘于10⁴，即是每ml中细胞数数目，即每ml细胞数＝总计算细胞数/4×稀释倍数×10⁴。

细胞生长曲线：细胞复苏洗涤后，用适量培养基重悬细胞，向6孔板中每孔加入2.5ml细胞悬液(含10000个活细胞)，放置37℃，5％co2培养箱中培养7天，每3天换液，每隔24小时取1个6孔板进行消化计数，实验组与对照组取3孔平均值，连续监测7天。将检测结果绘制成脂肪间充质干细胞生长曲线。

对照组的实施过程与上述实施例相同，区别仅在于保存液的成分不同。

实施例4效果评价

(一)实验分组

表1实施例1～3与对比例1～3提供的保存液的组分数据表

(二)脂肪间充质干细胞增殖生长曲线

复苏后细胞7天的生长曲线分为3个阶段，第一阶段为适应期，细胞增殖较慢；第二阶段为生长期，细胞增殖较快，呈对数增长；第三阶段为平台期，细胞增长变慢。图1为实施例1～3与对比例1～3复苏后的脂肪间充质干细胞的生长天数曲线图，由图1可见，本发明所使用的间充质干细胞保存液，相对于对照组冻存复苏的细胞能够较快进入细胞生长期，且增殖的速度较快。

(三)脂肪间充质干细胞复苏率结果

表2脂肪间充质干细胞复苏率数据表

上述检测的结果表明，分离培养的人脂肪间充质干细胞传至第1代后使用制备实施例1～3得到的冻存液进行冻存，在复苏后进行培养，冻存，复苏，台盼蓝拒染率与细胞增殖检测，结果显示实验组台盼蓝拒染率显著高于对照组，细胞增殖结果显示，实验组的细胞生长速度与状态明显优于对照组。由以上结果可以看出，本发明的冻存液特别适合于人脂肪干细胞的冻存培养，具有较好的细胞保护活性。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。