细菌基因表达的跨生物调节的制作方法
本申请要求于2017年5月22日提交的美国临时申请no.62/509,272的权益和优先权。上述申请的全部说明书和附图在此全部引入作为参考。
序列表
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通常，本发明技术涉及用于控制致病剂的新型跨生物策略，所述致病剂包括宿主真核有机体中的多药耐药细菌。特别地，本发明的技术可以包括用于通过引入反义rna(asrna)来调节细菌基因表达的表达的新颖系统，所述反义rna可以破坏靶致病基因和/或其产物(rna、蛋白)的表达。在一些实施方案中，本发明的技术可以包括新颖的基因工程改造的供体细菌l菌株，其被配置为有效和连续地将asrna多核苷酸递送至受体病原体并下调宿主中一种或多种必需基因的表达。
背景技术：
根据世界卫生组织(who)的报告，世界上超过20％的死亡是由于传染病造成的。细菌介导的宿主感染的机制基于病原体蛋白质与其宿主之间的相互作用。细菌性植物病原体每年造成的农作物损失估计达数千亿美元，直接造成了全球粮食不安全的加剧。
传统上，致病细菌通过在植物和动物系统中使用抗生素化合物进行管理。实际上，自20世纪下半叶以来，抗生素化合物一直是临床医学的基石。然而，随着临床环境中微生物抗生素耐药性范围的扩大以及新抗生素合同的开发，细菌在细菌中产生的抗生素耐药性正日益增加。抗生素抗药性基因组的全球基因组范围使这个问题更加复杂，以至于抗生素抗药性跨越了从临床上发现的病原体基因到良性环境微生物的基因的连续区域。
由抗生素抗性细菌引起的多药耐药性(mdr)感染正在威胁我们治疗常见感染的能力，直接医疗保健费用估计达200亿美元。几种重要病原体的耐药率逐渐提高，包括耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌、耐万古霉素的肠球菌、耐多药的铜绿假单胞菌、耐亚胺培南的鲍曼不动杆菌、以及耐第三代头孢菌素的大肠杆菌和克雷伯菌属，这严重威胁公共卫生。产生广谱β内酰胺酶的病原体和mrsa在世界各地的许多医院中都很流行。
一种提出的解决方案是利用基于工程化rna的分子。例如，近几十年来已广泛探索了asrna作为高度特异性的抗菌药物的用途。反义rna(asrna)技术利用rna分子的产生，该rna分子与靶mrna互补并杂交。asrna与目标mrna杂交的结果是，mrna无法充当蛋白质翻译的模板，因此asrna-mrna相互作用导致细菌中mrna编码蛋白的水平降低或降低。此外，靶向的mrna可能会被rnase水解，导致转录后基因沉默。然而，将asrna实际应用于抗菌治疗的最大障碍之一是asrna的生产和向感染部位的传递方式。面临的挑战是如何在很长的时间内连续产生和输送足够数量的asrna，以极低的成本或没有成本使病原体中的目标必需基因沉默。
因此，需要一种新颖的解决方案来解决上述技术和实际问题。确实，前述关于控制细菌病原体的问题可能代表了长期需要一种有效且经济的解决方案。尽管可以使用实现元素，但在某种程度上可能缺少实际的尝试来满足这一需求。这可是由于本领域普通技术人员未能充分理解或理解所涉及问题和挑战的性质而导致的。由于缺乏了解，试图满足这些长期的需求可能无法有效解决本文中所指出的一个或多个问题或挑战。这些尝试甚至可能偏离了本发明技术所采取的技术方向，甚至可能导致考虑了本发明技术的成就，在某种程度上是本领域技术人员所采取的方法的意外结果。如将在下面更详细地讨论的，本发明技术克服了传统细菌病原体控制系统的限制。
发明概述
本发明涉及基因修饰的供体细菌的利用，所述基因修饰的供体细菌可被配置为产生某些asrna多核苷酸，其可靶向植物和/或动物系统中的特定细菌基因和/或其产物(rna、蛋白)。这些asrna多核苷酸可能会抑制或减少某些基因的表达和/或导致致病因子中基因产物的损伤或降解。本发明可以包括用于控制真核宿主中致病细菌、病毒、真菌和/或原生动物的新颖技术、系统和方法。
本发明技术的一个目的可以包括用于通过asrna跨受体调节受体病原体细菌中细菌基因表达的新型系统、方法和组合物。本发明的一个实施方案可以包括在宿主中携带的供体细菌种中有效表达高水平的asrna。在某些实施方案中，该供体细菌可以是表达一种或多种异源asrna多核苷酸的肠、内生和/或共生细菌种。
本发明的另一个目的可以包括在供体细菌中产生异源asrna，该供体细菌可以进一步被递送至受体细菌，更具体地讲是致病细菌。这些异源asrna多核苷酸可以靶向特定的基因及其rna和/或蛋白质产物，这些基因可是唯一的和/或限于靶细菌病原体。此类异源asrna多核苷酸可以完全互补，或包含与其靶标相关的错配；这两个方面都可能导致其目标降级或损害其翻译，使它们无法实现其功能。
本发明的又一个目的可以包括抑制受体细菌中靶基因的表达，从而抑制宿主真核有机体中细菌的种群和/或细菌的致病活性。
本发明的另一个目的可以包括产生可以编码一个或多个异源asrna多核苷酸的一个或多个质粒和/或细菌人工染色体(bac)。另一个目的可以包括将编码一种或多种asrna的特定遗传元件整合到病原体的基因组中。本发明的另一个目的可以是产生遗传构建体，该遗传构建体可以通过在供体细菌菌株中的组成性、诱导性、异源或同源基因启动子/终止子产生非编码rna分子，例如上述的异源asrna多核苷酸。本发明的又一个目的可以包括可以保护非编码rna分子免于降解的某些蛋白质或其他因子的共表达。
本发明的另一目的可以包括开发可以产生异源asrna多核苷酸的基因修饰的营养缺陷型细菌菌株，所述异源asrna多核苷酸可以进一步通过纳米管更有效地递送至靶病原体。
本发明的另一个目的可以包括用于各种有机体的新的生物防治策略，包括另外的动植物物种。在优选的实施方案中，本发明的另一个目的可以包括用于水产养殖种群的新颖的生物防治策略。在该实施方案中，本发明技术包括多种交叉机制，用于敲除在水产养殖系统中生长的水生动物中的必需病原体基因。这可以通过将工程微生物引入表达特定异源asrna多核苷酸的水产养殖动物种群中来实现，这些特定异源asrna多核苷酸可能下调和/或抑制选定的病原体必需基因。
本发明的另一个目的可以是可以表达一个或多个异源asrna多核苷酸的基因修饰的共生和/或益生菌菌株的产生。在某些实施方案中，虾益生菌可以是基因修饰的，以表达针对必需病原体基因的一种或多种抑制性rna分子，优选在弧菌中。
本发明的本发明的另一个目的可以包括用于通过基因工程改造的供体微生物的感染将异源asrna多核苷酸引入目标宿主的系统和方法。在一个实施方案中，本发明可以提供基因工程改造的微生物，其可以在靶有机体中表达一种或多种异源asrna多核苷酸，并且可以用于下调致病性病原体中必需基因的表达。这样的目标有机体可以包括水生动物，水产养殖系统中的水生动物以及其他脊椎动物和无脊椎动物。
从下面的附图和描述中，本发明技术的其他目的将变得显而易见。
附图简述
结合在说明书中并构成说明书一部分的附图示出了本发明的一个或多个实施方案，并且与说明书一起用于解释本发明的原理。附图仅出于说明本发明的一个或多个优选实施方案的目的，并且不应被解释为限制本发明。在图中：
图1-asrna抑制gfp荧光。a)与与表达非特异性asrna-cop1的细菌共培养相比(ns)，与表达asrna-gfp的大肠杆菌ht-27菌株共培养的大肠杆菌ht-115-pgfp菌株的荧光水平降低。b)与与非特异性asrna-cop共培养相比(ns)，与表达asrna-gfp(as-gfp1)的大肠杆菌ht-27菌株共培养的ag1-pad-43-25菌株的荧光水平降低。
图2-asrna阻断dam基因表达的潜在作用。起点/dnaa启动子区域甲基化的减少导致dna复制调节环的破坏和弧菌细胞分裂的抑制。dam表达的抑制通过未知机制抑制生物膜形成，所述机制可包括对特定基因启动子的转录抑制，导致细胞生长减慢。
图3-弧菌与表达ag1的asrna-dam共同生长对弧菌适应性和生物膜形成的影响。共接种asrna供体(肠杆菌属ag1)和受体(vibriorifr)细菌，并使其在各种条件下共同生长。耐利福霉素细菌(弧菌)的细胞数通过平板接种其连续稀释液来确定。a)与ag1-asrnadam共同生长导致液体培养物中弧菌细胞计数减少3倍(n＝24)；b)与ag1-asrna-dam共生长导致琼脂表面上弧菌细胞计数减少1.5倍(n＝8)；c)在微量滴定板中生长24小时后形成的生物膜用结晶紫染色并刻痕。与ag1-asrna-dam共同生长导致生物膜形成减少2倍。
图4-dna上共生长的ag1-asrna-dam对弧菌染色体dna甲基化的影响。a)弧菌dna的腺嘌呤被高度甲基化；b)与表达ag1的asrna-dam共同生长可降低弧菌dna的6ma含量。在对照实验中，弧菌与表达非特异性rna的ag1共同生长，例如asrna-gfp；c)响应于与ag1-asrna-dam共生长的弧菌dna甲基化变化的分析结果。与ag1-asrna-dam共同生长导致弧菌dna(n＝16)中6ma含量降低30％。
图5-弧菌与ag1-asdam共同生长导致弧菌i染色体复制起点(oric)的6madna甲基化水平降低。a)oric/dnaa启动子附近的dam(dpni/mboi)甲基化位点示意图。在oric图下方映射的是qpcr分析中使用的pcr片段。分析中使用的寡核苷酸列于表4；b)在存在dam的情况下，vibriooric弧菌的6madna甲基化状态降低，因为mboi限制性内切酶导致较高的裂解-仅切割未甲基化的dna-因此与对照相比，扩增子积累较低(n＝8)；c)相反，与在ag1-asdam(n＝8)存在下与弧菌弧菌相比，由于较高的dna甲基化水平，在对照样品中oricdna对dpni的消化更敏感-dpni只能切割6ma甲基化的dna。
图6-dam和dnaa基因表达的qrt-pcr分析。a)带有绘制的pcr产物位点的弧菌dam和dnaa基因示意图；b)用于测定的寡核苷酸对弧菌dna的特异性；c)弧菌与ag1-asdam共同生长导致dam和dnaamrna显着降低(n＝6)。
图7-qrt-pcr分析生活在饲喂ag1-asrna-dam或ag1-asrna-gfp的秀丽隐杆线虫肠道中的弧菌中的dam表达，显示了asrna-damrna的转录后调控导致damrna水平降低。
图8-表达asrna的盒和质粒。a)表达asrna的质粒图；b)表达rna的盒设计；c)asrna-dam反义rna-发夹asrna结构，环中有asrna-dam。折叠由mfoldweb服务器上的mfold应用程序执行。
图9–asrna-dam与dammrna的比对。
图10–描绘在工程细菌中表达的广义asrna的作用方式的图。
图11–哈维氏弧菌中的一般群体感应途径示意图。
图12–示例性crispr/cas9系统图。
发明详述
本发明包括多个方面，其可以以不同的方式组合以大体上描述与通过供体细菌表达和递送的asrna对受体致病细菌中细菌基因表达的转基因调控有关的新颖系统、方法和组合物。提供以下描述以列出元件并描述本发明的一些实施方案。这些元件与初始实施方案一起列出，但是应当理解，它们可以以任何方式和任何数量组合以创建另外的实施方案。各种描述的示例和优选实施方案不应被解释为将本发明限制为仅明确描述的系统、技术和应用。此外，该描述应被理解为支持并涵盖具有任何数量的所公开元素的所有各种实施方案、系统、技术、方法、设备和应用程序的描述和权利要求，其中每个元素单独使用，以及具有本申请或任何后续申请中所有元素的任何以及所有各种排列和组合。
本发明的技术可以包括通过选择性灭活病原性、必需或其他靶基因来控制特定细菌或其他病原体的毒力的系统和方法。这种靶向的基因失活可以通过将异源asrna分子从供体细菌表达和递送至靶宿主病原体来实现。在一个优选的实施方案中，可以对一种或多种供体细菌种类或菌株进行基因工程改造以表达异源asrna分子，所述异源asrna分子可以在靶标致病因子中起到调节和/或抑制基因表达的作用。
如图10所示，asrna可以包括非编码单链rna分子，该分子可能与从靶基因转录的特定信使rna(mrna)链表现出互补关系。另外的实施方案可以包括相对于其靶mrna具有一个或多个错配的asrna。无论mrna和asrna之间的同源性如何，在该实施方案中，asrna可以与互补mrna物理配对并结合。这种互补结合可以通过碱基配对rna分子来抑制互补mrna的翻译，从而在物理上阻碍或在空间上阻碍翻译机制。
应当注意，当提及asrna是互补的时，这意味着用于反义抑制的多核苷酸可能对应于编码靶多肽的序列的全部或部分互补序列、靶多肽转录物的5'和/或3'非翻译区的全部或部分互补序列，或编码靶多肽的转录本的编码序列和非翻译区的全部或部分互补序列。互补核酸分子是与全部或部分靶核酸分子的mrna转录物互补的核酸。另外，反义多核苷酸可以与靶序列完全互补(即与目标序列的互补序列100％相同)或部分互补(即与目标序列的互补序列少于100％相同)。
反义抑制可用于抑制同一细胞中多种蛋白质的表达。此外，部分反义核苷酸可用于破坏靶核酸分子的表达。通常，可以使用至少10个核苷酸、20个核苷酸、50个核苷酸、100个核苷酸、200个核苷酸、300、500、550、500、550或更大以及它们之间的任何数量的反义序列。该序列可以与信使rna的任何序列互补，即，它可以在5'末端或加帽位点附近、在加帽位点下游、在加帽位点和起始密码子之间，并且可以覆盖全部或仅一部分非编码区域，可以桥接非编码和编码区域，与全部或部分编码区互补，与编码区的3'末端互补，或与mrna的3'-非翻译区互补。
反义序列可以与独特序列或重复序列互补，从而提高结合的可能性。因此，反义序列可涉及独特序列，重复序列的单个单元或重复序列的多个单元的结合。制备反义核酸分子的方法是本领域公知的。
这样，在某些实施方案中，本发明可以包括抑制致病剂的核酸分子，或在一些实施方案中，抑制致病剂的核酸分子表达的系统、方法和组合物。当涉及抑制靶基因的表达时，是指核酸分子的表达被抑制、破坏或以其他方式受到干扰，从而使真核受体或靶宿主免受疾病的侵害。抑制靶基因的表达通常还可以指被抑制，破坏或以其他方式受到干扰的核酸分子的翻译，从而保护真核受体或靶宿主免受疾病侵害。抑制靶基因的表达还可能意味着核酸分子(例如asrna多核苷酸)的表达抑制、破坏或以其他方式干扰真核生物受体或靶宿主表现出wt宿主较低的感染率、传播率、病原体负荷或疾病症状的病原体中必需基因的表达或翻译。
如上所述，在一个实施方案中，本发明可以包括在致病剂中使用与靶基因的核酸分子互补的asrna。反义rna是与靶标互补的rna，通常是靶标核酸分子的信使rna(mrna)。反义是指与靶核酸分子的5'至3'正常方向相反的方向的序列。在一个优选的实施方案中，可以对供体细菌进行基因修饰以表达异源asrna。该表达可以是表达载体的一部分，并且可以是表达盒的一部分，并且可以进一步与表达控制序列可操作地连接。可以将这种基因修饰的供体细菌引入靶宿主并表达可以从供体细菌输出并被吸收到靶致病剂中的靶异源asrna，该靶致病剂在该实施方案中可以是致病细菌。传递给受体致病细菌的异源asrna可能会阻止目标核酸分子编码的蛋白质的正常表达。这可能会干扰致病因子的生命周期、复制和/或致病性的能力，从而提供有效的抗菌释放系统。在该实施方案中，供体细菌可以是共生细菌菌株，其可以在靶宿主中持续存在并提供异源asrna的连续表达，从而在宿主靶中提供持续产生以对抗致病剂。在另外的实施方案中，供体细菌可以是益生菌或类似益生菌的细菌，其可以持续存在于靶宿主中并在一段时间内表达异源asrna并将其递送至受体细菌病原体。以这种方式，靶宿主多次暴露于益生菌或类似益生菌的细菌可以有效地递送异源asrna，但不能永久地持久存在于靶宿主内。
在另一个优选的实施方案中，可以将基因修饰的供体细菌引入尚未暴露于靶致病因子的靶宿主，并可以表达可从供体细菌输出到目标宿主的细胞和/或细胞内环境的目标异源asrna。传递给受体宿主的异源asrna可以作为预防性疫苗，这样，当将诸如致病细菌的靶标致病因子引入靶标宿主时，异源asrna阻止了目标核酸分子编码的蛋白质的正常表达，并可能阻止了致病剂定殖或影响目标宿主的能力。在该实施方案中，供体细菌可以是共生细菌菌株，其可以在靶宿主中持续存在并提供异源asrna的连续表达，从而在宿主中提供持续的预防性疫苗生产，从而赋予目标病原体一定程度的免疫力。
另外的实施方案可以包括一个或多个靶基因的asrna诱导的基因失活。例如，在一个优选的实施方案中，基因失活可以针对一种或多种对于毒力、外壳蛋白、代谢活性、感染途径和/或能量产生等必不可少的病原体基因。虽然以示例性模型提供，但靶基因可能包括一个或多个基因，这些基因负责细菌的致病性或引起宿主疾病的能力。此类细菌靶基因的实例还可包括一种或多种毒力因子。毒力因子可以帮助细菌：1)入侵宿主，2)引起疾病，和/或(3)逃避宿主防御。在一个优选的实施方案中，可以修饰细菌菌株或物种以表达asrna，其可以展示出与从靶毒力因子基因转录的特定信使rna(mrna)链的互补关系。此类毒力因子的示例可能包括但不限于：
粘附因子：该组可能包括有助于细菌病原体粘附于某些细胞的基因；
入侵因子：该组可能包括允许细菌入侵宿主细胞的表面成分基因；
胶囊：这一类可能包括结构性胶囊的基因，可以保护细菌免受调理作用和吞噬作用；
内毒素：这一类可能包括几种类型的有毒脂多糖的基因，这些基因可以引发免疫反应；
外毒素：这一类可能包括由致病细菌产生和/或分泌的几种蛋白质毒素和酶的基因。主要类别包括细胞毒素、神经毒素和肠毒素；
铁载体：这一类可能包括几种类型的铁结合因子的基因，这些因子可使某些细菌与宿主竞争铁，后者与血红蛋白、转铁蛋白和乳铁蛋白结合。
在一个实施方案中，本发明可以包括在致病剂中鉴定靶基因。在该优选实施方案中，靶基因可以包括致病因子的必需基因，这意味着一种或多种必需基因的表达和/或翻译受到抑制、破坏或干扰，导致致病因子数量减少，改善致病因子的致病性，中断致病因子的生命周期，在真核宿主中定殖的能力，逃避宿主的特异性或一般性免疫反应或导致疾病状态。
在一个实施方案中，针对致病因子中待表达或抑制的核酸序列(靶核酸分子或靶基因)的异源asrna可以表达、抑制或竞争与任何这样的靶核酸分子的结合位点，当施用时，这些靶核酸分子导致对真核宿主的保护免受致病因子的影响。
在一个实施方案中，本发明可包括供体共生细菌在哈维氏弧菌中针对一种或多种靶基因的异源asrna的产生和递送。在一个优选的实施方案中，一个或多个靶基因可以参与群体感应和生物膜形成的机制。(见图11)。通常，群体感应描述了与细菌种群密度相关的刺激和反应系统。群体感应可以使细菌不断产生低分子量信号分子并将其排泄到周围环境中，这些分子通常被称为自动诱导物(ai)。随着细菌数量的增加，ai的浓度也随之增加。在限定的ai浓度阈值下，细菌群体可能会表达同步的ai特异性反应-通常是表型，例如毒力、光产生或生物膜形成，当由一组细胞而不是单个细胞部署时，这种方法更有效细菌。这种群体感应反应可以极大地增强细菌病原体的毒力，并使细菌和细菌生物膜的情况更难以通过抗生素或其他化学手段阻止微生物的生长。
在一个特定的实施方案中，可以产生与来自一个或多个基因的mrna的mrna完全或部分互补的asrna，所述一个或多个基因在靶细菌病原体中提供群体感应机制。在一个优选的实施方案中，可以修饰细菌的种类或菌株以产生可以与弧菌中一个或多个ai基因的mrna互补的asrna，其中某些物种是虾和其他动物宿主的已知病原体。这些靶ai基因可能包括hai-1、ai-1和/或cai-1。如下所示，与哈维氏弧菌群体发送途径有关的其他基因靶标也可是具有互补asrna的靶标，例如cqsa、luxm、luxs和luxp。
根据本发明的一个方面，提供了一种控制病原体感染的生物的方法，该方法包括向目标宿主生物给药，该宿主生物在一个优选的实施方案中可以包括水生生物，该核酸试剂包括一种核酸序列，该核酸序列包括特异性下调至少一种必需靶病原体基因产物表达的核酸序列，其中在靶宿主中至少一种必需靶病原体基因产物的表达下调，使靶宿主免受病原体引起的疾病状态的侵害。在一个优选的实施方案中，这种核酸剂可以包括被鉴定为seqidno1的asrna多核苷酸，或其同源物和/或直系同源物。另外的实施方案可以包括跨越引起疾病的病原体的各种菌株的基本靶基因之间大于平均同源性的区域的任何核酸。一个优选的实施方案可以包括跨多个弧菌菌株的基本靶基因之间的大于平均同源性的区域的任何核酸。在哈维氏弧菌致病剂的例子中，这可以包括，如下文一般所示，在编码鉴定为seqidno.3的dam基因的区域中。
在一个实施方案中，本发明包括用于控制引起疾病的病原体的新型系统的产生。本发明可以具体地包括一种系统，该系统构造成将一种或多种异源rna多核苷酸递送至病原体感染的或病原体易感的宿主，该异源rna多核苷酸构造成抑制所述病原体中一种或多种必需基因的表达。在一个实施方案中，本发明可以包括一种或多种基因工程微生物，其可以优选地与宿主共生和/或内共生，并且还被配置为将一种或多种异源rna分子(例如rna多核苷酸)递送至病原体/致病因子。在一个优选的实施方案中，本发明可以包括一种或多种经基因工程改造的共生细菌，其被配置为将一种或多种asrna分子递送至宿主生物中的致病细菌。在一个优选的实施方案中，本发明可以包括一种或多种经基因工程改造的共生细菌，其被配置为将一种或多种asrna分子递送至水生宿主生物(例如虾或其他通常通过水产养殖饲养的生物)中的致病细菌。
在另一个优选的实施方案中，当前的发明技术可以将该技术扩展到在宿主的组织、后代和/或卵的整个发育过程中和成年阶段持续存在的共生微生物。以这种方式，经基因修饰的共生微生物可以连续地产生和递送asrna分子，以靶向病原体，例如弧菌。这可用于治疗已经感染宿主的疾病，和/或免疫易感宿主。
本发明可以进一步包括一种或多种用于抑制多种病原体基因表达的载体，其中所述载体包含一种或多种可以对应于一种或多种选择的病原体基因的异源asrna多核苷酸。该实施方案可以包括质粒表达系统的使用。在一些实施方案中，该质粒可以具有一个或多个表达盒，包括：至少一个基因抑制盒，其包含可操作地连接至表达控制序列的多核苷酸，其中该多核苷酸编码异源asrna分子，其被配置为减少靶病原体基因的表达，如本文一般所述。
本发明的优选实施方案包括用于调节多种病原体基因的载体，其中包含一个或多个asrna的载体可以对应于一个或多个选择的宿主基因。该实施方案可以包括质粒表达系统的使用。在一些实施方案中，该质粒可以具有一个或多个表达盒，包括：至少一个基因抑制盒，其包含可操作地连接至表达控制序列的多核苷酸，其中该多核苷酸编码异源asrna分子，其被配置为减少靶病原体基因的表达，如本文一般所述。
本发明还包括用于抑制宿主中致病因子基因表达的载体，其中该载体包含至少一个基因抑制盒，该基因抑制盒包含与表达控制序列可操作连接的多核苷酸，其中该多核苷酸通过rna干扰减少宿主内靶病原体基因的表达编码asrna分子。在一个实施方案中，编码asrna的多核苷酸包含seqidno.1的核苷酸序列。用于基因抑制盒的合适启动子的实例包括但不限于t7启动子、bla启动子、u6启动子、polii启动子、ell启动子和cmv启动子等。任选地，基因促进盒和基因抑制盒的每个启动子序列可以是诱导性的和/或组织特异性的。
在该实施方案中，被鉴定为seqidno.1的asrna分子可以是部分自我互补的，因此形成茎和环结构。(参见图8c)rna双链体的有义区和反义区包含一个或多个错配，使得可以形成凸出或二级结构(例如发夹结构)。rna双链体包含约4至约23个核苷酸碱基对错配。更优选地，rna双链体包含约7至约9个核苷酸碱基对错配。在又一个实施方案中，asrna环包含约50-200bp，或59个长bp和约90bp长的环。
在其他方面，本发明包括施用治疗有效量的一种或多种表达异源asrna多核苷酸的基因修饰的供体细菌的方法。在一个实施方案中，该治疗有效量可以是细菌的量，或者是供体基因修饰的细菌表达的异源asrna多核苷酸的量，其可以被运出供体并被目标病原体吸收，以改善、减少或消除疾病状况。
在另一个实施方案中，该治疗有效量可以是基因修饰的细菌的量，或者是供体基因修饰的细菌表达的异源asrna多核苷酸的量，其可以被运出供体，使得宿主对后来引入的病原体的感染抵抗力增强。
在另一个实施方案中，该治疗有效量可以是可以通过垂直和/或水平转移在目标宿主群体内定殖或成为地方性的基因修饰的供体细菌的量。
在一个实施方案中，本发明可以包括施用治疗有效量的基因修饰的细菌的方法，所述基因修饰的细菌被配置成表达异源asrna多核苷酸，可以靶向弧菌中的必需靶基因并且可以被鉴定为seqidno.1。
在一实施方案中，本发明可包括用于治疗和/或预防细菌生物膜形成的方法。在该实施方案中，该方法可以包括施用治疗有效量的基因修饰的细菌的步骤，该细菌被配置成表达异源asrna多核苷酸，可以靶向弧菌中与生物膜产生有关的必需靶基因，并且可以被鉴定为seqidno.1。
在一个实施方案中，本发明可以包括施用治疗有效量的基因修饰的细菌的方法，所述基因修饰的细菌被配置为表达异源asrna多核苷酸，可以靶向弧菌中与dna甲基化有关的必需靶基因，并且可以被鉴定为seqidno.1。
本发明的替代实施方案可以包括新颖的体外和/或体内方法，以选择可以在有效的病原体基因抑制系统中使用的共生细菌。特别地，本发明的另一个目的可以包括选择可以在有效的病原体基因抑制系统中使用的共生宿主细菌的新颖的体外和/或体内方法。这些共生宿主细菌在人类中可能不是致病性的，并且进一步具有可培养性、可转化性、质粒动员，并且能够分泌宿主核酸中特有的或能够成为地方性的靶核酸，如rna等，可分散，例如通过雾化分散，能够在环境中生存，并且在生活的各个阶段都可以被宿主食用或摄取。
在另一方面，本发明包括产生本发明载体的方法。在另一方面，本发明包括产生本发明的转化的或基因修饰的微生物的方法，例如通过用重组质粒转化。
本发明的另一个实施方案可以包括细胞，例如基因修饰的微生物，其被配置为表达本发明一些实施方案的异源核酸试剂，例如asrna，或核酸构建体，例如质粒。在一个优选的实施方案中，本发明可以包括基因修饰的细菌，其被配置为表达异源asrna多核苷酸。在另一个优选的实施方案中，异源asrna多核苷酸可以在弧菌中靶向必需的靶基因，并且可以被鉴定为seqidno.1。
本发明的另一个实施方案可以包括细胞，其包含本发明一些实施方案的分离的核酸试剂，例如asrna，或核酸构建体，例如质粒，其中所述细胞选自由以下组成的组：细菌细胞、藻类细胞、共生细菌和水表面微生物的细胞。根据本发明一些实施方案的一个方面，提供了包含本发明一些实施方案的细胞的可摄入化合物。
在另一个优选的实施方案中，可以修饰细菌的物种或菌株以产生asrna，其可以与哈维氏弧菌中编码dna腺嘌呤甲基化酶(dam)的mrna互补。这些修饰的细菌可以包括作为虾的正常菌群一部分的菌株或物种，和/或与诸如虾或其他水生生物的目标宿主共生和/或内共生的菌株。引入后，这些基因工程改造的细菌可能被虾吸收并成为正常菌群的一部分。
在该实施方案中，在供体细菌如大肠杆菌或肠杆菌中表达的asrna可抑制靶宿主中弧菌中的dam或其他必需基因的表达。在另一个实施方案中，在供体细菌中表达的鉴定为seqidno.1的asrna-dam可降低弧菌适应性，并且还产生生物膜形成或发病机理的显着下降。如下所述，弧菌适应性的降低与受体弧菌细胞中dam表达的降低直接相关，如观察到的结果所示：1)与表达asrna-dam的细菌共培养时，弧菌dna的甲基化程度降低了30％；2)弧菌复制起点oric和dnaa的启动子(dna复制起始的关键要素)的甲基化程度是未暴露于表达asrna-dam细菌的对照中甲基化程度的2倍；3)弧菌dam基因的表达也相对于对照降低了2倍；4)弧菌dnaa基因的表达相对于对照降低了3倍；5)当在模型动物生物体中暴露于表达asrna-dam的肠杆菌ag1时，弧菌dam基因的表达降低了6倍。这样的结果证明了本发明通过有针对性地将asrna从供体细菌产生和递送到宿主生物中来控制疾病和生物膜产生的能力。
如上所述，异源asrna的递送可以通过引入基因修饰的宿主特异性供体微生物来实现，例如肠道、内生、共生或共生细菌。这类经过基因修饰的宿主特异性微生物可能包括：1)作为目标病原体正常内部或外部细菌微生物组一部分的微生物；2)经修饰能够在目标动物、植物、组织、细胞或宿主环境中定殖的微生物；3)被目标宿主用作食物或能源的微生物；或4)在益生菌或类益生菌微生物、特定动物、植物、组织、细胞或宿主环境中，经过修饰可在目标宿主中定植或暂时保留的微生物。如上所述，在一个优选的实施方案中，异源asrna供体细菌可以包括大肠杆菌，以及来自肠杆菌属的细菌。在另一个优选的实施方案中，异源asrna供体细菌可以包括一种或多种选自下面表5中鉴定的组的肠细菌。自然地，这样的例子是非限制性的，因为任何能够，和/或被配置成稳定地定殖或与目标宿主建立共生关系的细菌可以充当供体细菌。
在一个优选的实施方案中，供体细菌可以用人工产生的遗传构建体转化，例如可以产生异源asrna多核苷酸的质粒。在某些情况下，可以通过缀合和其他手段将这样的质粒构建为可转移至其他细菌，这可以允许构建体的广泛分布。在某些实施方案中，可以在递送异源asrna多核苷酸的供体细菌中的组成型、诱导型、异源或同源基因启动子/终止子对的控制下，在质粒和/或bac上编码asrna分子。在另一个实施方案中，可以将用于产生异源asrna多核苷酸的遗传构建体整合到递送或宿主细菌的细菌基因组中。
在另一个优选的实施方案中，一个或多个异源asrna多核苷酸可以通过基因修饰的供体细菌被递送至靶动物宿主/种群，所述基因修饰的供体细菌可以自然地定殖于宿主，或被配置成定殖于宿主。然后，在一个优选的实施方案中，供体细菌可将表达异源asrna多核苷酸的遗传构建体传播至周围环境中的天然存在的宿主微生物和/或致病细菌。在这个实施方案中，一旦定居在目标宿主中，修饰细菌的垂直传播就可以传递到宿主的后代，从而自然地将致病细菌的抗性复制到后代。另外，经过修饰的细菌也可以通过将经修饰的细菌作为废物分配到环境中而整体上水平地传播到宿主群体。这样的特征可以允许向宿主和/或宿主的环境一次性或至少周期性地施用基因修饰的细菌，从而产生显着的商业优势。
本发明的技术可以进一步包括控制供体细菌中异源asrna多核苷酸表达的水平和时间的方法和技术。在一个优选的实施方案中，一种或多种异源asrna多核苷酸的表达可以在新型基因开关的控制下。这种基因转换可以由转换分子控制，转换分子可以是水溶性的食品级分子，可以添加到宿主生物的环境或食物中。该开关分子的存在可以激活例如异源asrna产生。在没有它的情况下，可能不会发生asrna的产生，或者只能以可忽略的水平发生。
在某些实施方案中，宿主特异性或共生供体细菌可包括以下一个或多个特征：1)目标宿主的微生物组中，例如目标宿主的肠道菌群中的普遍细菌；2)可在宿主外部培养，例如在发酵罐中培养；3)对非目标生物无已知的不利环境或健康影响；4)能够进行基因工程改造，以稳定表达足够数量的异源asrna分子，以抑制目标基因在宿主生命周期的至少一个(但最好是全部)生命周期中复制；5)配置成可动员到宿主内其他细菌中的基因构建物中。
本发明的另外的实施方案可以包括优化异源asrna多核苷酸的有效性的方法和系统。在一个优选的实施方案中，可以将asrna与伴侣蛋白共表达和/或融合以保护rna分子免于降解。另外的优选实施方案可以包括分泌标签/部分的共表达和/或融合，其可以促进异源asrna多核苷酸的分泌和/或摄取，从而提高其有效性。
细菌内切核糖核酸酶，外切核糖核酸酶和rna降解体可能降解非编码rna分子，例如asrna或grna。在一个实施方案中，本发明的技术可包括对先前鉴定的递送细菌进行修饰以使其表达降低或这些蛋白质家族的功能或活性失活。表达和/或活性的这种降低或失活可以抑制或降低单链非编码rna物种的降解。在一个优选的实施方案中，可以对先前鉴定的宿主特异性细菌进行基因修饰以在rna内切核糖核酸酶、外切核糖核酸酶和/或降解体缺乏的背景中有效表达异源asrna多核苷酸。在一个优选的实施方案中，供体细菌可以缺乏或具有降解的rnaseiii功能。在这个优选的实施方案中，可以通过同源重组或其他合适的方法敲除这些非编码rna分子降解基因。
本发明技术的另一个实施方案可以包括促进宿主特异性细菌基因过表达的系统和方法，所述宿主特异性细菌基因已知增强非编码rna分子例如asrna和/或grna的稳定和/或动员，以及它们的潜在遗传构建体(例如质粒)的动员和传播。在这个优选的实施方案中，一种或多种已知稳定asrna或动员遗传构建体例如质粒的基因可以被过表达以延长其寿命并促进在宿主生物/细胞/组织内的移动。
本发明的另一个优选实施方案可以是提供叶和根的内生和外生细菌，其可以进一步被基因工程化以表达非编码rna分子，例如asrna和grna。基因修饰的内生细菌的非限制性实例可以包括在亚科中的那些：酸杆菌、放线细菌、α-变形菌、armatimonadetes、拟杆菌、β-变形菌、deltaproteobacteria、firmicutes、γ-变形菌和tm7。在一个优选的实施方案中，可以用人工产生的遗传构建体，例如可以产生异源asrna多核苷酸的质粒，转化外生细菌。同样，可以构建这样的质粒以通过结合可转移到其他细菌，这在某些情况下可以允许广泛的环境接种。
在另一个实施方案中，非编码rna分子，例如异源asrna多核苷酸，可以由工程化和/或基因修饰的细菌递送，所述细菌诱导细胞内连接的形成，尤其是在非最佳环境条件下，或在周围环境缺少某些必需营养素的条件下。以这种方式，细菌可以形成纳米管，以在相连的细胞之间交换营养，遗传物质和其他化学信号，从而帮助在微生物群落内分配代谢功能。在该实施方案中，可以对营养缺陷型细菌进行基因修饰以诱导纳米管的形成，所述纳米管可以允许将asrna从供体细菌直接传播至靶标或受体细菌。在另一个实施方案中，可以对营养缺陷型细菌进行基因修饰以诱导纳米管的形成，这可以允许将编码asrna的遗传构建体散布到缺乏人工遗传构建体的靶细菌上。在这种配置中，在某些环境或营养缺乏的条件下，递送细菌可以向社区中的其他细菌传播asrna和/或编码asrna的遗传构建体，例如质粒。这种作用可能有助于损害大量致病细菌中特定靶基因的表达。
在该实施方案中，这样的遗传构建体可以包括转录调节部分，例如启动子、终止子、共激活子和共阻遏子，以及可以在原核以及真核系统中被调节的类似控制元件。这样的系统可以允许控制系统内表达的异源asrna多核苷酸或其他非编码rna分子的类型、时间和数量。其他实施方案可包括可通过外部因素诱导的遗传构建体，例如细胞中特定蛋白质或化合物的存在，例如响应病原体产生的应激相关蛋白质，或甚至是病原体产生的蛋白质和其他前体化合物等。
在另一个优选的实施方案中，本发明的技术可以包括系统和方法，通过该系统和方法可以将产生一个或多个非编码rna分子(例如异源asrna多核苷酸)的遗传转化的叶和根内生细菌和外生细菌传递至目标植物门和/或物种，其中非编码rna分子可转移至致病细菌并失活和/或抑制目标病原基因的表达。在某些实施方案中，可以利用对诸如一种门甚至某些物种特异的微生物的选择，例如细菌。在另一个实施方案中，非编码rna分子的转录激活和促进可能取决于某些因素的存在，这些因素可能对一种门甚至某一种植物或草食动物物种具有特异性。例如，在某些实施方案中，非编码rna，例如asrna分子可以在递送分子的内生或外生细菌中，在组成型、诱导型、异源或同源基因启动子/终止子对的控制下，在质粒和/或bac上编码“bac”。在另外的实施方案中，可以将用于生成asrna的遗传构建体整合到供体、天然存在的宿主和/或靶致病细菌的细菌基因组中。
在某些实施方案中，可以对内生或肠细菌进行基因修饰以产生非编码rna分子，例如异源asrna多核苷酸，其可以靶向赋予对某些病原菌耐药性的特定基因。在疾病情况下，非编码rna分子可能会干扰一个或多个与细菌致病性相关的靶基因，以及赋予耐药性的基因。在该实施方案中，在植物和动物系统中对细菌病原体的治疗可以通过共生细菌的作用完成，该共生细菌产生异源的asrna多核苷酸和/或grna，它们会破坏一个或多个单独与mdr相关的基因，或者与传统的抗生素或其他药理化合物结合使用。下表6中提供了与致病细菌中的mdr有关的基因靶标的实例。下表7中包括可以用本发明技术靶向的动物病原体的例子。这样的列表仅是示例性的，并且不应以任何方式解释为限制。
如上所述，在一个优选的实施方案中，一种或多种异源asrna多核苷酸可以通过基因修饰的细菌被递送到虾的目标宿主/种群，所述基因修饰的细菌可以自然地或被配置为与虾定居和/或共生。在这个实施方案中，一旦定居在宿主中，修饰细菌的垂直传播就可以传递到宿主的后代，从而自然地将病原性抗性复制到后代。在某些实施方案中，表达一种或多种异源asrna多核苷酸的基因修饰细菌可在虾的整个生命周期中定居。例如，表达一种或多种异源asrna多核苷酸的基因修饰的供体细菌可以在虾上定居，而该虾是：卵、无节幼体、原生动物、mysis、幼虫后阶段或成年。在该实施方案中，定殖的细菌可以表达异源asrna多核苷酸，其可以被指导从供体细菌表达和运输，并被受体病原体细菌吸收并抑制表达或一种或多种必需基因。此外，这些定居细菌已永久和/或暂时成为宿主天然微生物组的一部分，在某些情况下，可通过肠从最早的幼体阶段到成年阶段连续递送异源asrna多核苷酸，从而提供病原体特异性mrna在宿主的整个生命周期中下调必不可少的病原体基因。此外，由于供体细菌载体可能是宿主微生物组中已经天然存在的一部分，因此其存在可能不会对生物体、环境或最终消费者构成任何风险。
本发明的技术可以包括用于产生宿主特异性细菌，尤其是宿主特异性肠型或共生细菌的方法和技术，所述宿主特异性肠型或共生细菌可以充当针对影响水生生物的细菌病原体的异源asrna多核苷酸的合适的供体载体。作为示例性模型，虾可以用作目标宿主。然而，如本领域普通技术人员可以理解的，这样的方法和技术可以应用于多种不同的生物。
如本文所用，术语“水产养殖”包括在受控条件下的水生生物的养殖。
如本文所用，术语“水生生物”和/或“水生动物”包括在淡水或盐水中生长的生物。水生生物/动物包括脊椎动物，无脊椎动物，节肢动物，鱼，软体动物，包括虾(例如对虾、penaeusesculentu、白对虾、南美蓝对虾、西方对虾、日本对虾、南美白对虾、斑节对虾、中国对虾、阿兹特库斯对虾、桃红对虾、印度对虾和墨吉对虾、加州对虾、短沟对虾、斑节对虾、盐水丰年虾、淡水虾等)、螃蟹、牡蛎、扇贝、对虾蛤、软骨鱼类(例如海鯛、鲑、bass、鲈鱼、罗非鱼、鲇鱼、鲑科、鲤鱼、鲇鱼、黄尾鱼、鲤鱼斑马鱼、美国红鱼等)、甲壳类动物等。虾还包括在水产养殖中养殖的虾。
术语“益生菌”是指可以在宿主上定植足够长的时间以探究治疗或有效量的异源asrna多核苷酸的微生物，例如细菌。益生菌可以包括内共生细菌，或可以永久性地暂时定居于动物(例如水生生物)的天然菌群。益生菌生物还可以包括藻类和真菌，例如酵母。
细菌载体的具体例子包括细菌(例如球菌和棒状杆菌)、丝状藻类和碎屑。在宿主的所有生命周期中可以是内源的可转化细菌载体细胞的具体实施方案可以包括本文列出的所有那些。另外的实施方案可以包括一种或多种选自本文列出的实例的细菌菌株。自然地，这样的列表不是排他的，并且仅是副转基因细菌菌株的某些优选实施方案的示例。
本发明可以包括用于在共生供体细菌物种或菌株中表达grna的新颖系统和方法，其可以被crispr/cas9系统用来破坏表达crispr/cas9基因的致病细菌中的靶基因。通常，crispr/cas9可通过共表达对要靶向的基因和核酸内切酶cas9特异的grna来产生敲除或破坏靶基因。通常，参照图12，crispr可以由两个部分组成：grna和与crispr相关的非特异性核酸内切酶(cas9)。grna可以是由支架序列组成的短合成rna，可以允许cas9结合，并带有20个核苷酸的间隔区或靶向序列，该序列定义了要修饰的基因组靶标。在一个优选的实施方案中，可以对示例性细菌(例如共生细菌，共生共生细菌)进行基因修饰，以产生一种或多种靶向病原性或其他靶基因遗传序列的grna，这些grna可以与靶细菌的自然存在的cas9核酸内切酶结合。在另一个优选的实施方案中，示例性细菌，例如内生和/或肠细菌可以被基因修饰以产生一种或多种靶向病原性或其他靶基因遗传序列的grna，并可以与靶细菌的天然cas9核酸内切酶结合。
如本文所用，术语“反义rna”或“asrna”是指作为单链寡核苷酸的rnai剂。在典型的asrna中，单链与全部或部分靶mrna互补。asrna的互补性可以与特定基因转录本的任何部分互补，即与5'非编码序列、3'非翻译序列、内含子或编码序列互补。可以将asrna引入细胞以通过与其互补碱基并物理阻碍翻译机制来抑制互补mrna的翻译。反义rna与互补的mrna靶序列退火，并且由于核糖体接近或核糖体阅读的位阻，mrna靶序列的翻译被破坏。反义rna机制不同于rna干扰(rnai)，rnai是一种相关过程，在该过程中，双链rna片段(dsrna，也称为小干扰rna(sirna))触发催化介导的基因沉默，最典型的方法是靶向rna诱导的沉默复合物(risc)以结合并降解mrna。asrna分子链与mrna或dna退火可导致双链rna，杂合rna/dna双链体或细胞中的核糖核酸酶类似前体trna的双链rna，或通过反义化合物本身切割靶rna。
如本文所用，弧菌是具有弯曲杆形状的革兰氏阴性，兼性厌氧细菌的属，其中弧菌sp.指示弧菌属内的物种。在一些实施方案中，弧菌属可以包含以下任何一种或多种弧菌，并且可包含所有可能的组合：adaptatus、产气克氏杆菌、aestivus、aestuarianus、噬琼胶菌、albensis、alfacsensis、溶藻菌、鳗弧菌、areninigrae、artabrorum、atlanticus、atypicus、azureus、巴西诺卡菌、bubulus、calviensis、campbellii、casei、chagasii、乱弧菌、cincinnatiensis、coralliilyticus、crassostreae、cyclitrophicus、diabolicus、diazotrophicus、ezurae、费氏弧菌、河弧菌、fortis、弗尼斯弧菌、gallicus、gazogenes、gigantis、halioticoli、哈维氏弧菌、hepatarius、hippocampi、hispanicus、霍利斯弧菌、ichthyoenteri、indicus、kanaloae、lentus、litoralis、火神弧菌、mediterranei、metschnikovii、拟态弧菌、mytili、需钠弧菌、navarrensis、neonates、neptunius、nereis、nigripulchritudo、病海鱼弧菌、orientalis、pacinii、副溶血弧菌、pectenicida、penaeicida、pomeroyi、ponticus、proteolyticus、rotiferianus、红色红曲菌、rumoiensis、杀鲑弧菌、scophthalmi、灿烂弧菌、superstes、tapetis、tasmaniensis、tubiashii、创伤弧菌、wodanis和xuii。
如本文所用，短语“宿主”或“靶宿主”是指携带致病性病原体的生物或种群，或易受致病性病原体影响的生物或种群。“宿主”或“靶宿主”可以进一步包括能够携带引起疾病的病原体的生物或种群。
如本文所用，术语“控制”和/或“生物控制”是指减少和/或调节病原体/疾病的进程和/或传播。
如本文所用，“疫苗”是指导致主动和被动免疫的组合物。多核苷酸及其表达的基因产物都在本文中称为疫苗。包括被配置为表达异源rna多核苷酸的经处理细菌的饲料也可以是疫苗。将经处理的饲料喂养给动物可以是疫苗接种。
如本文所用，短语“饲料”是指作为饲料方案的一部分引入的动物可消耗材料，或者在水生动物的情况下直接应用于水中。“经处理的饲料”是指经配置以表达干扰细菌的经处理的细菌处理的饲料。
如本文所用，术语“核酸”是指核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的聚合物。通常，“核酸或”核酸剂”聚合物以单链或双链形式存在，但也已知形成包含三条或更多链的结构。术语“核酸”包括天然存在的核酸聚合物以及包含已知核苷酸类似物或修饰的骨架残基或键的核酸，所述核酸类似物或修饰的骨架残基或键是合成的、天然存在的和非天然存在的，其具有与参考核酸相似的结合特性，并且以与参考核苷酸相似的方式被代谢。示例性的类似物包括但不限于硫代磷酸酯，氨基磷酸酯，甲基膦酸酯，手性甲基膦酸酯、2-o-甲基核糖核苷酸和肽核酸(pna)。“dna”、“rna”、“多核苷酸”、“多核苷酸序列”、“寡核苷酸”、“核苷酸”、“核酸”、“核酸分子”，“核酸序列”、“核酸片段”和“分离的核酸片段”在本文可互换使用。
当涉及例如细胞或核酸、蛋白质或载体时，术语“重组”表示该细胞、生物体、核酸、蛋白质或载体已通过引入异源核酸或蛋白质或天然核酸或蛋白质的改变已被修饰，或者该细胞源自如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞可以表达在细胞的天然(非重组或野生型)形式中找不到的基因，或表达会异常表达、过度表达、表达不足或根本不表达的天然基因。
术语“基因修饰”、“生物转化”、“转基因”、“转化”、“转化”和“转染”在含义上与“重组”相似。“转化”、“转基因”和“转染”是指多核苷酸向宿主生物的基因组或细胞中的转移。多核苷酸的这种转移可导致多核苷酸的遗传稳定遗传或使多核苷酸保留在染色体外(未整合到细胞的染色体中)。遗传稳定的遗传可能潜在地要求转基因生物或细胞在一段时间内经历一种或多种条件，这些条件需要转录部分或全部转移的多核苷酸才能使转基因生物或细胞生存和/或生长。转化到细胞中但未整合到宿主染色体中的多核苷酸仍作为表达载体保留在细胞内。为了使表达载体保留在细胞或细胞的后代中，可能需要在一定的生长或环境条件下使细胞生长。此外，为了发生表达，可能需要将生物体或细胞保持在一定条件下。包含重组多核苷酸的宿主生物或细胞可被称为“转基因”或“转化的”生物或细胞，或简称为“转化体”，以及重组生物或细胞。
术语“载体”是指可以将dna、rna、蛋白质或多肽引入宿主的某些方式。待引入宿主的多核苷酸、蛋白质和多肽本质上可以是治疗性或预防性的；可以编码或为抗原；本质上可以是监管的等。载体种类繁多，包括病毒、质粒、噬菌体、粘粒和细菌。
“表达载体”是能够在选择的宿主细胞或生物中复制的核酸。表达载体可以复制为自主结构，或者可以全部或部分整合到宿主细胞染色体或细胞器的核酸中，或者可以用作将外来dna传递到细胞的穿梭载体，从而与宿主细胞基因组一起复制。因此，表达载体是能够在选定的宿主细胞、细胞器或生物体中复制的多核苷酸，例如质粒、病毒、人工染色体、核酸片段，并且表达载体上的某些基因(包括目的基因)被转录并翻译成细胞、细胞器或生物体内的多肽或蛋白质；或本领域已知的任何合适的构建体，其包含“表达盒”。相反，如本文实施方案中所述，“盒”是含有本发明表达载体的一部分的多核苷酸。盒的使用有助于表达载体的组装。表达载体是复制子，例如质粒、噬菌体、病毒、嵌合病毒或粘粒，并且其包含与表达控制序列可操作连接的所需多核苷酸序列。
当表达控制序列控制和调节该多核苷酸序列的转录和/或翻译时，该多核苷酸序列“可操作地连接至一个或多个表达控制序列”(例如，启动子和任选的增强子)。如本文所用，短语“基因产物”是指rna分子或蛋白质。此外，术语“基因”有时可以指遗传序列、该基因的转录的和可能修饰的mrna、或该mrna的翻译蛋白。
本教导考虑根据所选病原体物种，例如弧菌的物种、靶向同系物和直系同源物。同源序列包括直向同源序列和旁系同源序列。术语“旁系同源的”涉及导致旁系同源基因的物种的基因组内的基因复制。术语“直系同源”由于祖先关系而涉及不同生物中的同源基因。因此，直系同源物是在给定两个物种的最后一个共同祖先中源自单个祖先基因的进化对应物(kooninevandgalperinmy(sequence-evolution-function:computationalapproachesincomparativegenomics.boston:kluweracademic；2003.chapter2,evolutionaryconceptingeneticsandgenomics.availablefrom:www.ncbi.nlm.nih.gov/books/nbk20255/)，因此具有相同功能的可能性很高。因此，直系同源物通常起着与另一物种的原始物种相似的作用。
同源性(例如，同源性百分比、序列同一性+序列相似性)可以使用计算成对序列比对的任何同源性比较软件来确定。如本文所用，在两个核酸或多肽序列的上下文中的“序列同一性”或“同一性”包括提及两个序列中比对时相同的残基。当使用序列同一性百分比来表示蛋白质时，会认识到不相同的残基位置通常会因保守的氨基酸取代而有所不同，其中氨基酸残基被具有类似化学性质(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基取代，并且因此不会改变分子的功能特性。如果序列在保守取代中不同，则可以向上调整序列同一性百分比以校正取代的保守性质。通过这种保守取代而不同的序列应具有“序列相似性”或“相似性”。进行该调整的手段是本领域技术人员众所周知的。通常，这涉及将保守取代计为部分错配而不是全部错配，从而增加序列同一性百分比。因此，例如，在相同氨基酸的评分为1，非保守取代的评分为零的情况下，保守取代的评分为零至1。计算保守取代的得分，例如，根据henikoffs和henikoffjg的算法[aminoacidsubstitutionmatricesfromproteinblocks.proc.natl.acad.sci.u.s.a.1992,89(22):10915-9]。
根据一个具体的实施方案，同源序列与这里提供的序列(核酸或氨基酸序列)至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或甚至相同。在50％-99％之间的任何seqidno1-4的同源序列可以包括在本发明的某些实施方案中。
病原体基因产物的表达下调可以被监测，例如通过直接检测基因转录物(例如通过pcr)，通过检测由基因编码的多肽(例如通过western印迹或免疫沉淀)，通过检测由基因编码的多肽的生物活性(例如，催化活性、配体结合等)，或通过监测宿主的变化(例如，宿主的运动性降低等)。另外，或者可替代地，可以通过测量宿主中与未用本发明的试剂处理的野生型(即对照)宿主相比的病原体水平(例如细菌水平等)来监测病原体基因产物的表达下调。
如本文所用，术语“干扰rna分子”或“干扰rna”是指能够抑制或“沉默”病原体中靶基因表达的rna多核苷酸。在某些实施方案中，“干扰rna分子”或“干扰rna”可包括asrna或异源asrna。抑制性rna序列与靶基因转录物的部分可以大于90％相同或什至100％相同。备选地，rna的双链体区可以在功能上定义为能够在严格条件下(例如400mmnacl，40mmpipesph6.4、1mmedta，60℃杂交12磅/小时；然后洗涤)与一部分靶基因转录物杂交的核苷酸序列。与靶基因转录物互补的单链核苷酸序列的长度可以是至少约18、19、21、25、50、100、200、300、400、491、500、550、600、650、700、750、800、900、1000或更多个碱基。在本发明的一些实施方案中，双链核苷酸序列的长度为约18至约530个或更长的核苷酸。
应当注意，asrna可以根据编码靶基因转录物的dna的核酸序列来定义，并且应当理解，与基因编码序列相对应的asrna序列包含该基因编码序列的rna互补序列，或转录为rna的该基因的其他序列。
例如，为了使目的mrna的表达沉默，可以如下选择适合用于本发明的一些实施方式的asrna的合成。首先，扫描包括3'utr和5'utr的mrna序列。其次，使用任何序列比对软件，例如可从ncbi服务器获得的blast软件(wwwdotncbidotnlmdotnihdotgov/blast/)，将mrna序列与合适的基因组数据库进行比较。滤出与其他编码序列具有显着同源性的mrna序列中的推定区域。选择合格的靶序列作为asrna合成的模板。优选的序列是与基因组中的其他基因几乎没有同源性的序列，以减少“脱靶”效应。
应当理解，本发明的一些实施方案的rna沉默剂不必限于仅包含rna的那些分子，而是还涵盖化学修饰的核苷酸和非核苷酸。
根据一个实施方案，所述asrna特异性地靶向选自seqidno.3或其同源物变体的基因。
如本文所用，术语“异源的”是指外源的、非天然存在于供体、宿主、病原体的天然细胞中或引入了asrna的细胞中(例如通过整合的位置，或在细胞内非自然发现)。
根据一个具体的实施方案，用于异源asrna多核苷酸或供体的载体是细菌。在其他实施方案中，供体是藻类细胞。根据本发明的教导，可以使用各种藻类，因为它们是多种宿主的重要组成部分，这些宿主机会性地以微生物以及小型水生动物如轮虫为食。可以根据本教导使用的藻类的实例包括但不限于蓝绿藻以及绿藻。特别地，集星藻、镰形纤维藻、螺旋纤维藻、aphanochaete线虫、衣藻sp.、椭圆小球藻、蛋白核小球藻、颜色缤纷小球藻、chlorococcumhypnosporum、短刺顶棘藻、acerosum新月藻、closteriopsisacicularis、coccochlorispeniocystis、crucigenialauterbomii、四足十字藻、coronastrumellipsoideum、葡萄孢属鼓藻、角丝鼓藻、空球藻、gloeocystisgigas、golenkiniaminutissima、goniummulticoccum、微绿球藻、oocystismarssonii、卵胞藻、oocystispusilla、palmellatexensis、实球藻、paulschulziapseudovolvox、pediastrumclathratum、盘星藻、单角盘星藻、planktosphaeriagelatinosa、polyedriopsisspinulosa、pseudococcomyxaadhaerans、quadrigulaclosterioides、辐球藻、scenedesmusbasiliensis、草原水绵、staurastrumgladiosum、tetraedronbitridens、trochisciahystrix.蓝绿细菌项圈藻、螺旋鱼腥藻、膨胀色球藻、cylindrospermumlicheniforme、bucapsissp.(u.texasno.1519)、lyngbyaspiralis、铜绿微囊藻、泡沫节球藻、nostoclinckia、oscillatorialutea、phormidiumfaveolarum、钝顶螺旋藻。
在另一个实施方案中，可以将包含被配置为表达asrna的基因修饰细菌的组合物配制成可进一步被配置为分散到环境中的水分散性颗粒或粉末。在又一个实施方案中，本发明的组合物还可包含可湿性粉剂、喷雾剂、乳剂、胶体、水溶液或有机溶液、粉剂、丸剂或胶体浓缩物。可以将组合物的干燥形式配制成在润湿时立即溶解，或者以控制释放、持续释放或其他时间依赖性方式溶解。替代地或另外地，该组合物可以包含水溶液。这样的水溶液或悬浮液可以以浓缩的储备溶液的形式提供，该浓缩的储备溶液在施用前被稀释，或者作为一种可供立即使用的稀释溶液。这样的组合物可以以多种方式配制。通过与各种惰性材料例如无机矿物(有机硅或硅衍生物、页硅酸盐、碳酸盐、硫酸盐、磷酸盐等)或植物性材料(粉状玉米芯、稻壳、核桃壳等)混合，它们可以用作可湿性粉剂、颗粒剂或粉剂。含有转基因细菌的制剂或组合物可以包括铺展剂-佐剂、稳定剂、其他农药添加剂或表面活性剂。液体制剂可以用作泡沫、悬浮液、乳油等。成分可以包括神学剂、表面活性剂、乳化剂、分散剂或聚合物。
可包含表达异源rna多核苷酸的基因修饰的共生门细菌的本发明组合物可用于动物或其他宿主中病原体的生物防治。这样的应用包括向宿主施用有效量的组合物，该组合物从供体表达足够的异源rna多核苷酸，所述异源rna多核苷酸可以被运出供体并被靶病原体吸收，从而干扰靶必需基因的表达，从而控制病原体和/或病原体疾病对宿主的影响。
本发明的组合物可用于体内控制病原体基因表达。这样的应用包括对靶宿主例如虾施用有效量的组合物，其抑制宿主携带的病原体，减少或消除宿主中的疾病状态，并使病原体不可转移到例如宿主群体中。因此，不管使用何种方法，表达异源rna多核苷酸的基因修饰共生门细菌的量可以以有效量杀灭或抑制病原体的方式应用，其变化取决于诸如待控制的具体宿主、病原体的类型、在某些情况下待处理的水源、环境条件以及该组合物的施用方法、速率和数量等因素。用于环境、全身或叶面施用的组合物的浓度将根据特定制剂的性质、施用方式、环境条件和杀生物活性的程度而广泛变化。
根据一些实施方案，以有效减少或抑制至少一种病原体基因产物表达的量提供异源asrna多核苷酸。如本文所用，“抑制量”或“有效量”或“治疗有效量”是指足以将靶基因下调(减少其表达)至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或更高、例如60％、70％、80％、90％、甚至最高100％的asrna的量。所有范围包括在具体说明的范围之间的范围。
如本文所用，术语“基因”或“多核苷酸”是指任意长度的单核苷酸或核酸残基的聚合物。多核苷酸可以包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或其类似物，并且可以是双链或单链的。多核苷酸可以包含修饰的核酸(例如，甲基化的)、核酸类似物或非天然存在的核酸，并且可以被非核酸残基中断。例如，多核苷酸包括任何序列的基因、基因片段、cdna、分离的dna、mrna、trna、rrna和分离的rna、重组多核苷酸、引物、探针、质粒和载体。定义中包括已被修饰的核酸聚合物，无论是天然修饰还是通过干预修饰。
如本文中所使用的，术语“大约”或“大概”是指±10％。每当在本文中指示数值范围时，其意图包括在指示范围内的任何引用数字(分数或整数)。短语“在第一指示数字和第二指示数字之间的范围/范围和从第一指示数字到第二指示数字的范围/范围”在本文中可互换使用，并且意在包括第一和第二指示数字以及它们之间的所有小数和整数。
术语“包括”、“包含”、“含有”、“具有”及其缀合物表示“包括但不限于”。术语“由……组成”是指“包括并限于”。术语“基本上由……组成”是指所述组合物、方法或结构可以包括另外的成分、步骤和/或部分、但前提是附加成分、步骤和/或部分不会实质性改变所要求保护的组合物、方法或结构的基本和新颖特征。
如本文所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数引用，除非上下文另外明确指出。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可以包括多种化合物，包括其混合物。
在整个申请中，本发明的各种实施方案可以以范围格式呈现。应当理解，范围格式的描述仅是为了方便和简洁，而不应被解释为对本发明范围的不灵活的限制。因此，应该认为范围的描述已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，对范围(例如1到6)的描述应视为已明确公开了子范围，例如1到3、1到4、1到5、2到4、2到6、3至6等，以及该范围内的单个数字，例如1、2、3、4、5和6。这与范围的广度无关。
如本文所用，术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和过程，包括但不限于化学、药理、生物学、生化和医学领域的从业人员由已知的方式、手段、技术和过程所知或易于开发的那些方式、手段、技术和过程。如本文所用，术语“治疗”包括消除、基本上抑制、减慢或逆转病情的进展，基本上改善病情的临床或美学症状或基本上防止病情的临床或美学症状的出现。
如本文所用，“共生”或“共生体”通常是指作为宿主的共生体的细菌。它也可能包括细菌，这些细菌会在宿主的整个生命周期中持续存在，无论是内部还是外部，而且还可能水平传播到宿主的后代或卵中。共生菌还可以包括在宿主细胞外部甚至在宿主的组织、淋巴或分泌物中定居的细菌。内共生体通常是指内部共生体的一个亚组。
如本文所用，“转基因”是指生活在靶宿主生物体内的天然存在或共生细菌内部的rna多核苷酸的产生，所述rna多核苷酸被设计为抑制靶宿主或病原体基因的表达。
本发明利用分子生物学领域的常规技术。公开本发明的一般使用方法的基本文献包括greenandsambrook,4thed.2012,coldspringharborlaboratory；kriegler,genetransferandexpression:alaboratorymanual(1993)；andausubeletal.,eds.,currentprotocolsinmolecularbiology,1994-current,johnwiley&sons。除非另有说明，否则根据常规用法使用技术术语。分子生物学中常用术语的定义可能在例如下列文献中找到：benjaminlewin,genesix,出版于oxforduniversitypress,2007(isbn0763740632)；krebs,etal.(eds.),theencyclopediaofmolecularbiology,出版于blackwellscienceltd.,1994(isbn0-632-02182-9)；androberta.meyers(ed.),molecularbiologyandbiotechnology:acomprehensivedeskreference,出版于vchpublishers,inc.,1995(isbn1-56081-569-8)。
现在参考以下实施方案将更容易理解一般描述的本发明，这些实施方案仅出于说明本发明实施方案的某些方面的目的而包括在内。所述实例无意于限制本发明，如本领域技术人员将从以上教导和以下实例中认识到的，其他技术和方法可以满足权利要求，并且可以在不脱离所要求保护的本发明的范围的情况下被采用。确实，尽管已经参考本发明的优选实施方案具体示出和描述了本发明，但是本领域技术人员将理解，在不脱离所附权利要求所涵盖的本发明的范围的情况下，可以在形式和细节上进行各种改变。
实施方案
为了证明通过供体细菌表达和递送的asrna对受体致病细菌中细菌基因表达的转基因调控，本发明人进行了以下一系列实验。首先，本发明人使用绿色荧光蛋白(gfp)作为报告基因，以定量靶向asrna抑制的基因的表达水平，并表明将表达gfp的细菌(受体)与表达特异性针对gfp的asrna的细菌(供体)共培养会导致受体菌株中gfp荧光水平降低。
其次，本发明人设计了在一般病原体哈维氏弧菌中靶向必需基因dam的asrna，并证明了表达asrna-dam的细菌能够抑制弧菌中的dam表达并改变依赖于dam的弧菌性状，从而导致抑制弧菌细菌种群和致病状态。编码dam基因的哈维氏弧菌dam基因参与dna甲基化、dna错配修复、dna复制调控和基因表达调控。dam还参与了许多细菌毒力途径的调控(julio，2001年)。
最后，本发明人将表达靶向于弧菌dam基因的asrna-dam的肠杆菌属sp(ag1)引入感染了哈维氏弧菌的秀丽隐杆线虫中，以确认细菌间的asrna介导的宿主病原体系统中必需基因表达的调节，导致致病细菌种群的大量减少。
实施方案1：与表达asrna-gfp的供体细菌菌株共培养后，表达gfp的细菌中的gfp荧光水平降低.
本发明人证明可以通过本文所述的新型转基因系统减少示例性的gfp荧光。如本领域技术人员所理解的，gfp通常被用作蛋白质表达水平的报告基因。此外，存在特征良好的asrna序列，当gfp和asrna-gfp(被鉴定为seqidno.2)在同一细菌细胞中表达时，已显示出其抑制gfp荧光。在此，本发明人利用与gfp编码序列的开头互补的已知的asrna序列，来确定当不同细菌中表达gfp和asrna-gfp时，该asrna是否会抑制gfp荧光，并进一步稳定为asrna环，侧翼为互补的富含gc的dsrna茎。如本文一般所示，本发明人证明，这种茎环结构可以确定受体细菌中是否存在dsrna特异性核酸酶rnaseiii，是否会影响asrna茎环结构沉默靶rna-gfp的有效性。为此目的，本发明人在这些实验中使用了野生型rnaseiiiag1菌株和rnaseiii缺陷型ht-115大肠杆菌菌株作为受体细菌。
如图1所示，为了评估供体细菌中asrna-gfp的产生是否会降低受体细菌中gfp的表达，本发明人一起共同培养了供体和受体细菌菌株。在供体和受体细菌菌株共培养4-7小时后，在表达gfp的细菌中测量gfp荧光的相对水平，该菌株表达特异的asrna-gfp或靶向埃及伊蚊的cop1基因(被鉴定为seqidno.4)的非特异的asrna。缺乏rnaseiii的大肠杆菌ht-115菌株和野生型rnaseiiiag1细菌均用于表达gfp，以检查rnaseiii的存在是否会影响受体细菌中发夹asrna-gfp结构的保存。在ag1和rnaseiii缺陷型大肠杆菌ht-115中，与表达asrna-gfp的供体细菌共培养4小时后，gfp荧光水平降低了约15％。阴性对照供体菌株是表达非特异性rna(ht27ns)的大肠杆菌ht-27。本发明人没有观察到该菌株对受体菌株中gfp表达的影响，这表明在与表达asrna-gfp的供体菌株共培养的受体菌株中观察到的gfp表达降低是由于将asrna-gfp递送至受体菌株并随后部分沉默了gfp表达。(见图1)。
实施方案2：通过肠杆菌spag1表达的特异性asrna-dam减少哈维氏弧菌中dam基因的表达.
如前所述，本发明提供了一种通过在宿主中生长的工程细菌递送的特异性asrna靶向抑制致病细菌中必需基因表达的鲁棒方法。如下所示，示例性病原体哈维氏弧菌可靶向必需基因表达。
哈维氏弧菌是机会病原菌。许多弧菌是水产养殖动物的常见病原体，例如虾、牡蛎、虾、龙虾和许多鱼类。控制与弧菌有关的疾病是水产养殖发展的重要措施。编码脱氧腺苷甲基化酶的哈维氏弧菌(dna腺嘌呤甲基转移酶)基因是asrna介导的基因沉默以抑制细菌种群生长和细菌发病机理的示例性靶标。如图2所示，dam是弧菌中必不可少的基因，它参与dna的错配修复、复制的调控和基因表达的调控。dam还参与许多细菌毒力途径的调节。
实施方案3：弧菌与表达asdam的ag1的共培养导致弧菌适应性降低和生物膜形成降低.
dam(dna腺嘌呤甲基转移酶)基因在弧菌dna复制中起重要作用。因此，dam蛋白水平的降低应导致细菌复制减少，结果细胞生长减少。为了确定供体细菌中产生的asrna-dam是否会影响受体细菌中的群体生长，本发明人共培养了供体细菌和受体细菌，然后进行了群体生长。在液体培养和琼脂平板上与表达asrna-dam的供体细菌菌株(ag1)共培养24小时后，比较弧菌细胞的数量。将混合细菌培养物以连续10倍稀释度的50mg/l利福霉素接种在lb琼脂平板上。如图3a-b所示，由于仅弧菌菌株对利福霉素具有抗性，因此该平板接种使本发明人能够区分供体和受体菌株，并确定递送至弧菌的asrna-dam对其生长的影响。如图所示，本发明人观察到用表达asrna-dam的供体细菌培养时弧菌细胞数减少了3倍，而当在液体培养基中生长时，表达模拟asrna的对照与在琼脂表面上生长时相比减少了2倍。
接下来，本发明人确定了dam蛋白表达的抑制是否影响了受体细菌中与病程相关的性状的表达。具体而言，本发明人监测了生物膜的形成；与细菌的高级发病机理有关的过程。为了评估混合培养中生物膜的形成，本发明人共培养了供体和受体细菌24小时。然后使用结晶紫染色方法测量生物膜的形成，以定量生物膜的水平。本发明人表明，相对于对照，表达asrna-dam的供体细菌将弧菌中生物膜的形成减少了50％(图3c)。由于dam参与生物膜形成的调控，因此生物膜形成的减少归因于在存在表达asrna-dam的细菌的情况下弧菌中dam蛋白的表达减少。
实施方案4：由于弧菌与ag1-asrna-dam共同生长的结果，总的n6-甲基腺苷(6ma)dna甲基化降低.
除了在上述实施方案中证明了由于dam功能的抑制导致弧菌细胞适应性降低之外，本发明人还证明了弧菌dna的甲基化也降低了。为确定弧菌与表达肠杆菌ag1的asrna-dam的共培养是否对弧菌基因组dna的dna甲基化有影响，使用对6ma修饰的腺嘌呤特异的一抗进行斑点印迹实验。
首先，本发明人分析了大肠杆菌、哈维氏菌和肠杆菌属的基因组dna的相对甲基化状态。本发明人发现，与其他细菌的dna相比，哈维氏弧菌dna被高度甲基化(参见图4a)。为了证明ag1细菌表达的asrna-dam的存在会影响弧菌dna甲基化的水平，从琼脂表面上生长的混合细菌培养物(例如，弧菌和ag1-asrna-dam；弧菌和ag1-asrna-gfp)中纯化细菌dna，并使用甲基化特异性抗体通过点印迹分析来评估dna甲基化，例如本文一般描述。如图4c所示，本发明人观察到来自表达asrna-dam的弧菌和肠杆菌(供体)ag1的dna分离共培养的dna的免疫应答信号强度的降低(参见图4b)。与ag1-asrna-dam共生长后获得的dna的甲基化比阴性非特异性对照(ag1-asrna-gfp)获得的信号低30％。因此，本发明人已经证明，在与ag1-asrna-dam共同生长之后，弧菌的基因组dna具有显着降低的甲基化。
实施方案5：dna甲基化水平的降低是由于弧菌dna甲基化的降低.
为了证实总体甲基化水平的降低是由于-asrna-dam对dam合成的特异性抑制所致，本发明人使用具有差异甲基化敏感性的限制性核酸内切酶mboi和dpni对弧菌基因组dna进行了甲基化敏感性限制性dna分析。例如，mboi仅切割未达dam甲基化的dna，相应地，细胞中对dam活性的抑制导致消化混合物中未消化片段的浓度降低。相反，dpni仅切割dam甲基化的dna，而dna甲基化状态的降低将导致未消化的dna片段积聚。
通过qpcr定量未消化的dna片段的产量。测定中所用的特异弧菌弧菌特异的寡核苷酸示于下表4，其设计原理示于图5a。简而言之，对于甲基化敏感的限制性酶切分析，本发明人选择了高度甲基化的复制起点oric。dpni/mboi限制性酶切位点的oric无效区域被用作qpcr的内部对照。设计了分别包含3个和7个dam甲基化位点(dpni/mboi)的两个引物对oric5'和oric3'，以评估整个oric区域的甲基化状态。
如图5所示，本发明人证明了在dna甲基化降低的情况下，mboi未消化片段的丰度降低了(在3'片段的情况下为5倍(见图5b))。相应地，dpni片段的丰度增加了2-4倍(见图5c)。结果证实，弧菌与ag1-asrna-dam共同生长导致弧菌细胞中dam活性受到抑制，这与oric的dna甲基化状态降低有关，从而导致弧菌细菌生长减少。
实施方案6：弧菌与ag1-asdam的共生长导致dammrna的减少.
为了影响弧菌dna的甲基化状态，asrna-dam必须进入弧菌细胞并改变dam蛋白的活性和/或浓度。在此，本发明人将asrna-dam设计为与dammrna的起始密码子和潜在的核糖体结合位点重叠。相应地，在一个优选的实施方案中，asrna-dam可以通过阻止dam的翻译和/或通过促使mrna降解而起作用。为了建立asrna-dam的潜在机制，本发明人研究了总rna中dammrna的浓度。如图6所示，与与表达非特异性asrna-gfp的细菌进行对照共培养相比，在与表达asrna-dam的肠杆菌ag1共培养的弧菌中观察到的dammrna降低了两倍。qpcr实验的结果证实，与表达ag1的asrna-dam共培养的弧菌细胞中的dnaa-mrna水平比表达ag1的asrna-gfp共培养的弧菌细胞低3倍。结果，本发明人证明了与在肠杆菌ag1中表达的dam基因的5′末端互补的反义rna正进入弧菌细胞，并通过破坏dammrna而抑制了dam蛋白的合成。
实施方案7：在宿主-病原体系统中通过肠杆菌属spag1表达的特异性asrna减少哈维氏弧菌中dam基因的表达.
本发明人确定，细菌递送的asrna也可以抑制目的基因在生活在宿主真核生物中的靶向肠细菌中的表达。如图7中总体所示，本发明人使用秀丽隐杆线虫作为示例性宿主模型进行了体内实验。秀丽隐杆线虫感染哈维氏弧菌，然后喂食表达asrna-dam或表达asrna-gfp的肠杆菌ag120小时。然后从秀丽隐杆线虫中提取总rna，并使用下表3中鉴定的相同引物通过qpcr评估dammrna的水平。由于引物仅对弧菌dam和gyrb基因(rna标准)具有特异性，因此总rna中存在秀丽隐杆线虫和ag1rna不会影响qpcr分析。本发明人发现，与喂食表达非特异性asrna-gfp的秀丽隐杆线虫ag1细菌相比，喂食表达asrna-dam的肠杆菌ag1的秀丽隐杆线虫的弧菌坝的表达低6倍(见图7)。
材料与方法
表达asrna的盒设计
由nakashima等人(2006)开发的用于生成反义rna(asrna)的配对末端(pt)rna稳定设计用于创建表达asrna的盒。在特定asrna序列的两侧添加了38bp长的侧翼反向gc延伸片段，形成了发夹结构，末端带有asrna-环。将ecorv和xhoi限制性酶切位点添加到侧翼倒位末端，以方便将不同的asrna序列克隆到盒中。将rrnb终止子(来自rrnbe.coli基因的终止子)置于表达asrna的表达盒末端一个207bp长的连接序列之后，然后使用xbai和hindiii限制性位点在pupp启动子的控制下将该表达盒克隆到pad-43-25质粒中(见图8)。
gfp荧光测量：
供体细菌(ht27-asgfp和ht27-cop1)和细菌受体(ht115-pgfp或ag1-pad-43-25)菌株分别在含有5mg/ml氯霉素的lb(thermo-fisher，12780052)中生长过夜，然后以供体/受体的比例从5：1到10：1混合用于共培养实验。将混合细菌培养物共培养1至7小时，并通过tecanm200平板读数器进行荧光测量。对每种处理方法分析了3个独立的实验，每个实验有8个技术重复。使用在485nm处激发和在528nm处发射来测量转化了pad-43-25的细菌中的gfp荧光，在400nm激发波长和520nm发射波长下测量ht115-pgfp细胞中gfpuv诱导的荧光。
细胞计数测定：
通过细胞计数测定来确定治疗前后的弧菌适应性：
液体培养实验中的共培养：将vibrio-rifr(asrna受体菌株)和ag1-asrna-dam1或ag1-asrna-gfp1(asrna供体菌株)在lbs培养基(10g/l细菌色氨酸，5g/l酵母提取物，20g/lnacl，50mmtris-hclph7.5)中生长过夜，稀释至od(600nm)为0.2-0.4并且以5/1的供体/受体的比例混合。混合培养物在28℃下生长24小时，然后以5μl10倍系列稀释液的50mg/l利福霉素接种在琼脂lbs板上。在细胞计数之前，细菌在28℃下生长过夜。进行了3次独立实验以进行此分析。
在琼脂表面上共生长：将5μl过夜供体菌株和5μl受体菌株同时滴在lbs琼脂平板上，并在28℃下生长24h。然后从琼脂层上切下混合细菌斑点，将其溶于pbs中，并以10倍系列稀释的50mg/l利福霉素将5μl平板接种在琼脂lbs板上。此分析使用了8个独立的实验。
生物膜形成测定
哈维氏弧菌和ag1-pad-pt-dam1或ag1-pad-pt-gfp1在lbs培养基中生长过夜，稀释至od6000.2-0.4，以供体/受体的比例为5/1混合。然后将100μl混合培养物添加到96孔板的孔中(针对每种处理方法，分析了3个独立的实验，每个实验中有8个技术重复项)，并在28℃不振摇的情况下孵育24小时。孵育后，按照o'toole(o'toole，2011)所述的规程，用结晶紫将细菌生物膜染色，并在550nm的tecan读板器上测量吸光度。
n6-甲基腺苷(6ma)点印迹分析
通过点印迹法，使用抗n6-甲基腺嘌呤(6ma)的dna的小鼠抗体，通过斑点印迹法测量细菌dna中的6ma丰度。使用omega细菌dna纯化试剂盒纯化细菌dna。然后用8m尿素将dna稀释至100ng/μl的浓度。通过在95℃下加热3分钟使dna样品变性。变性后立即将样品在冰上冷却，以防止二级结构重新形成。将2μl重复样品涂在amershamhybond-n+膜(gehealthcare)上。通过使用stratalinker2400运行两次自动交联程序，将dna与膜进行uv交联。所有步骤均在室温下进行。pbst(137mmnacl，12mm磷酸盐，2.7mmkcl，ph7.4和0.1％吐温20)洗涤后，将1：1000稀释的小鼠抗6ma一抗(synapticsystems；212b11)在室温下孵育2小时。在过量的pbst中洗涤3分钟后，将膜在hrp偶联的抗小鼠igg二抗(thermo)中孵育，然后在过量的pbst中洗涤3次，持续30分钟。最终，使用supersignalwestduraextendeddurationsubstrate(thermoscientific；34075)将抗体信号可视化。为了确认相等的dna负载量，将同一膜用sybrgreen荧光染料染色，并使用geldoceasy成像仪(biorad)观察dna。将定量的6ma水平标准化为加载的dna量。使用3-8个独立的生物样品和2-3个技术重复重复点印迹分析。来自点印迹图像的信号通过imagej进行定量，并成为统计分析的主题。使用sigmaplot绘制结果。
qrt-pcr.
通过定量实时pcr(qrt-pcr)测量弧菌细胞中的相对基因表达。使用omegae.z.n.a细菌rna试剂盒分离总rna。通过使用mx3000pqpcr系统(agilenttechnologies)进行实时pcr扩增。使用
限制性消化分析
为了确定弧菌起源oric的甲基化状态，用特定的限制性核酸内切酶独立切割基因组dna，以识别6ma的存在与否。细菌基因组dna使用omegae.z.n.a.细菌dna试剂盒。在37℃下使用每种限制酶5u(mboi，仅切割未甲基化的dna和dpni，仅切割甲基化的dna(热))分别消化500ngdna3小时。为了确定限制性酶切后仍完整的dna片段的相对丰度，使用powerupsybrgreenmastermix试剂盒(appliedbiosystems)进行qpcr。基因特异性引物在下表2中列出。使用无甲基化的dna片段的水平作为标准化的内部参考，确定特定dna片段的相对水平。
秀丽隐杆线虫测定.
秀丽隐杆线虫被用作模型动物，以研究宿主病原体系统中异源表达的asrna对弧菌中基因表达水平的影响。秀丽隐杆线虫n2菌株在25℃的固态标准线虫生长培养基(ngm)平板上生长，并喂入大肠杆菌op50。然后通过在平板上空的ngm板使蠕虫在dauer阶段同步化。然后将同步的dauer培养物转移到带有哈维弧菌的ngm平板中48小时。然后将蠕虫用m9缓冲液洗涤3次，重悬并分成两半，一个镀在ag1-asdamngm板上，第二个镀在ag1-asgfp板上。用ag1细菌喂养20小时后，将线虫用m9洗涤3次，将两倍体积的rnaprotectbacteria试剂(qiagen)添加到缓冲液中，然后通过用金属网格强烈涡旋破坏蠕虫，释放出肠道细菌，并用于总rna提取。如上所述，通过定量实时pcr(qrt-pcr)测量弧菌细胞中的相对dam基因表达。
数据分析.
从至少三个独立的实验中计算出平均值(sem)的平均值和标准误。所有其他数据均通过sigmaplot的anova测试进行了分析。在p值＜0.05时，接受实验组之间差异的显着性。
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表
表1.细菌菌株.
表2：基因特异性引物.
表3：qrt-pcr中使用的寡核苷酸.
表4：用于qpcr分析的寡核苷酸.
表5：示例性供体肠细菌.
acidimicrobiia
actinobacteria
alphaproteobacteria
anaerolineae
bacilli
bacteroidia
betaproteobacteria
clostridia
deltaproteobacteria
epsilonproteobacteria
flavobacteriia
fusobacteria
gammaproteobacteria
mollicutes
opitutae
oscillatoriophycideae
phycisphaerae
planctomycetia
rubrobacteria
sphingobacteriia
synechococcophycideae
thermomicrobia
verrucomicrobiae
表6：致病细菌中与mdr相关的基因靶标.
表7-可以用本发明技术靶向的动物病原体的实例.
序列表
seqidno.1(asrna-dam)
cuuuuucaucuacugcucuaucuaucgaccaaaaauuaaggcugcggaauguaacauau
seqidno.2(asrna-gfp)
uaauucaacaagaauugggacaacuccagugaaaaguucuucuccuuuacucau
seqidno.3(vibriodam基因)
atgaaaaagcaacgagcctttcttaagtgggcaggaggcaaatacggtctggttgaagacatccaacgtcatttaccaccggctcgaaagctagttgaaccctttgttggtgctggctcggtttttctaaataccgactatgaccactatctactggcggatattaaccccgacctgattaatctctataacttactaaaagagcgtcctgaagagtacatctcagaagcgaagcgctggtttgttgcagagaacaatcgcaaagaagcgtacttgaatattcgcgccgagtttaataaaacggatgacgtgatgtaccgctcgttggcgttcctatacatgaaccgctttggctttaatggcttatgtcgttataacaaaaaaggcggctttaatgtcccgtttggttcttacaaaaagccttatttcccagaagcggagctagaattctttgctgaaaaagccaagaaagcgacgttcgtatgtgaaggttacccagaaacgttcagtcgagcgcgtaaaggcagcgtggtttattgcgatccaccgtacgcaccgttgtcgaacacggcgaactttacctcttatgctggcaacggctttacgctggatgatcaagctgcattggctgatattgcagagaaagccgcaactgaacgtggtatccctgttctgatctcaaaccatgacacgacattaacgcgtcgcctttatcatggtgcggagcttaatgtcgtaaaagtgaagcgaaccatcagtcgtaatggcagtggtcgtaataaagttgacgagttgctggcgctatttcgtgcacctgacgcggacaaatctgactcttaa
seqidno.4(rna-cop1)
cccttcacaaacctggagaaaacgtccgtgctgcaggaaacgcggatgtttaacgagaccccggtcaatgcccgcaagtgtacccacatcctgacgaagattctgtatttgatcaatcagggagaacaactgggttccagagaggccaccgaatgtttc
序列表
<110>卵石实验室公司
<120>细菌基因表达的跨生物调节
<130>90115.00210
<150>us62/509,272
<151>2017-05-22
<160>4
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>59
<212>rna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<221>
<222>
<223>对应于vibrioharveyidam基因的反义rna（antisensernacorrespondstovibrioharveyidamgene）
<400>1
cuuuuucaucuacugcucuaucuaucgaccaaaaauuaaggcugcggaauguaacauau59
<210>2
<211>54
<212>rna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<221>
<222>
<223>对应于绿色荧光蛋白（gfp）基因的反义rna（antisensernacorrespondstogreenfluorescentprotein(gfp)gene）
<400>2
uaauucaacaagaauugggacaacuccagugaaaaguucuucuccuuuacucau54
<210>3
<211>840
<212>dna
<213>vibrioharveyi
<400>3
atgaaaaagcaacgagcctttcttaagtgggcaggaggcaaatacggtctggttgaagac60
atccaacgtcatttaccaccggctcgaaagctagttgaaccctttgttggtgctggctcg120
gtttttctaaataccgactatgaccactatctactggcggatattaaccccgacctgatt180
aatctctataacttactaaaagagcgtcctgaagagtacatctcagaagcgaagcgctgg240
tttgttgcagagaacaatcgcaaagaagcgtacttgaatattcgcgccgagtttaataaa300
acggatgacgtgatgtaccgctcgttggcgttcctatacatgaaccgctttggctttaat360
ggcttatgtcgttataacaaaaaaggcggctttaatgtcccgtttggttcttacaaaaag420
ccttatttcccagaagcggagctagaattctttgctgaaaaagccaagaaagcgacgttc480
gtatgtgaaggttacccagaaacgttcagtcgagcgcgtaaaggcagcgtggtttattgc540
gatccaccgtacgcaccgttgtcgaacacggcgaactttacctcttatgctggcaacggc600
tttacgctggatgatcaagctgcattggctgatattgcagagaaagccgcaactgaacgt660
ggtatccctgttctgatctcaaaccatgacacgacattaacgcgtcgcctttatcatggt720
gcggagcttaatgtcgtaaaagtgaagcgaaccatcagtcgtaatggcagtggtcgtaat780
aaagttgacgagttgctggcgctatttcgtgcacctgacgcggacaaatctgactcttaa840
<210>4
<211>159
<212>dna
<213>aedesaegypti
<400>4
cccttcacaaacctggagaaaacgtccgtgctgcaggaaacgcggatgtttaacgagacc60
ccggtcaatgcccgcaagtgtacccacatcctgacgaagattctgtatttgatcaatcag120
ggagaacaactgggttccagagaggccaccgaatgtttc159
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