泊沙康唑在制备用于防治植物病原菌的杀菌剂中的应用的制作方法

本发明属于植物保护技术领域，具体涉及泊沙康唑在制备用于防治植物病原菌的杀菌剂中的应用。

背景技术：

联合国粮农组织(fao)估计，世界上农作物的产量因病虫杂草的危害造成的损失约40％左右(4400-5500亿元)，对树木的影响更是难以估计。通过全世界从事病虫害研究的科学家和各类技术推广人员的工作挽回的损失达到3000-4000亿元。长期以来，化学防治一直是防控植物病害的主要手段。化学农药的大量长期使用不仅导致抗性问题的产生，而且会造成药剂残留，杀伤非靶标生物，污染生态环境，并最终经过生物富集对人体产生危害。为解决以上问题，以植物病原微生物靶标蛋白三维结构设计筛选绿色小分子化合物成为研究热点。

近年来，环境安全问题已引起各界人士的关注，环境的污染、残留和抗药性等问题使人们对绿色小分子化合物产生了很大的兴趣。因此，农业的可持续发展需要一种新的、安全的植物病害防治措施来实现。在这一大环境下，人们迫切需要新型的、绿色环保的杀菌剂的开发和有效利用。

技术实现要素：

本发明的目的是提供了泊沙康唑在制备用于防治植物病原菌的杀菌剂中的应用。本发明首次提出以靶标蛋白三维结构筛选绿色小分子化合物泊沙康唑应用于植物病害的防控。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了泊沙康唑在制备用于防治植物病原菌的杀菌剂中的应用。

进一步的：所述植物病原菌为禾谷镰孢菌、玉米弯孢菌、苹果轮纹病菌、苹果腐烂病菌、细极链格孢菌、尖孢镰刀菌、稻瘟病菌、禾谷丝核菌、灰霉病菌。

进一步的：所述泊沙康唑在杀菌剂中的使用浓度为0.1mg/l-2mg/l。

进一步的：所述泊沙康唑对禾谷镰孢菌的使用浓度为1mg/l-2mg/l，杀菌抑制率为59％-73％。

进一步的：所述泊沙康唑对玉米弯孢菌的杀菌抑制率为80％-87％；所述泊沙康唑对苹果轮纹病菌的杀菌抑制率为61％-83％。

进一步的：所述泊沙康唑对苹果腐烂病菌的使用浓度为0.1mg/l-0.5mg/l，抑制率为85％-100％。

进一步的：所述泊沙康唑对细极链格孢菌的使用浓度为0.3mg/l-2mg/l，抑制率为50％-69％。

进一步的：所述泊沙康唑对尖孢镰刀菌的使用浓度为0.3mg/l-2mg/l，抑制率为26％-49％。

进一步的：所述泊沙康唑对稻瘟病菌的抑制率为59％-82％。

进一步的：所述泊沙康唑对禾谷丝核菌的抑制率为32％-37％；所述泊沙康唑对灰霉病菌的抑制率为71％-85％。

与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：本发明基于禾谷镰孢菌cyp51b蛋白(甾醇脱甲基抑制剂靶标蛋白)三维结构设计筛选合成了小分子化合物泊沙康唑，本发明通过室内药剂敏感性测定，证明了泊沙康唑对重要粮食作物主要病害包括引起小麦赤霉病的禾谷镰孢菌、引起水稻稻瘟病的稻瘟病菌、引起纹枯病的禾谷丝核菌及引起玉米叶斑病的玉米弯孢菌具有良好的抑制活性；而且对引起果蔬主要病害灰霉病的灰霉病菌、对引起苹果轮纹病的轮纹病菌、引起苹果腐烂病的腐烂病菌以及引起果蔬叶斑病的细极链格孢菌具有良好的抑制活性；而且对农业生产上极难防治的土传病害譬如引起枯萎病的尖孢镰刀菌也有较好的抑制活性，其抑菌活性甚至优于传统杀菌剂多菌灵、戊唑醇。

本发明首次提出以靶标蛋白三维结构筛选绿色小分子化合物泊沙康唑应用于植物病害的防控，可以有效解决禾谷镰孢菌和轮纹病菌等植物病原真菌对已有杀菌剂产生抗性，造成防效差的问题，对环境友好，绿色无污染，符合世界卫生组织药剂残留毒性标准，具有广阔的市场应用前景。

附图说明

图1是泊沙康唑不同浓度梯度及传统药剂多菌灵、戊唑醇对禾谷镰孢菌菌丝生长的抑制效果图。

图2是泊沙康唑不同浓度梯度及传统药剂多菌灵、戊唑醇对玉米弯孢菌菌丝生长的抑制效果图。

图3是泊沙康唑不同浓度梯度及传统药剂多菌灵、戊唑醇对苹果轮纹病菌菌丝生长的抑制效果图。

图4是泊沙康唑不同浓度梯度及传统药剂多菌灵、戊唑醇对细极链格孢菌丝生长的抑制效果图。

图5是泊沙康唑不同浓度梯度及传统药剂多菌灵、戊唑醇对苹果腐烂病菌菌丝生长的抑制效果图。

图6是泊沙康唑不同浓度梯度及传统药剂多菌灵、戊唑醇对尖孢镰刀菌菌丝生长的抑制效果图。

图7是泊沙康唑不同浓度梯度及传统药剂多菌灵、戊唑醇对稻瘟病菌菌丝生长的抑制效果图。

图8是泊沙康唑不同浓度梯度及传统药剂多菌灵、戊唑醇对禾谷丝核菌菌丝生长的抑制效果图。

图9是泊沙康唑不同浓度梯度及传统药剂多菌灵、戊唑醇对灰霉病菌菌丝生长的抑制效果图。

其中，ck为阴性对照；0.1、0.3、0.5、1.0、2.0代表不同浓度梯度的泊沙康唑，单位为mg/l；djl0.6、wzc0.125为阳性对照传统药剂多菌灵0.6mg/l、戊唑醇0.125mg/l。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。

实施例1

本发明在interbioscreen数据库(https：//www.ibscreen.com/)，基于禾谷镰孢菌cyp51b蛋白(甾醇脱甲基抑制剂靶标蛋白)三维结构设计筛选到并合成了小分子化合物泊沙康唑。

化学名称：4-[4-[4-[4-[[(3r，5r)-5-(2，4-二氟苯基)-5-(1，2，4-三唑-1-基甲基)氧杂戊环-3-基]甲氧基]苯基]哌嗪-1-基]苯基]-2-[(2s，3s)-2-羟基戊-3-基]-1，2，4-三唑-3-酮；

英文：

4-[4-[4-[4-[[(3r，5r)-5-(2，4-difluorophenyl)-5-(1，2，4-triazol-1-ylmethyl)oxolan-3-yl]methoxy]phenyl]piperazin-1-yl]phenyl]-2-[(2s，3s)-2-hydroxypentan-3-yl]-1，2，4-triazol-3-one，分子式：c37h42f2n8o4，分子量：700.78，结构式如下：

1、试验方法

泊沙康唑对植物病原菌的药剂敏感性均采用菌落生长速率抑制法进行测定。生长速率法又称含毒介质法，特别适用于在培养基上不产孢或者产孢量少且菌丝较密的的供试菌株，符合本次实验的要求。

实验操作过程如下：

(1)活化菌株：将保存管中的禾谷镰孢菌、玉米弯孢菌、苹果轮纹病菌、细极链格孢、苹果腐烂病菌、尖孢镰刀菌、稻瘟病菌、禾谷丝核菌及灰霉病菌等9种植物病原真菌接种在pda平板上，培养3-4d后置于4℃恒温冰箱中备用。

(2)配制母液：分别称取0.0101g泊沙康唑、多菌灵及戊唑醇，用溶剂二甲基亚砜(dmso)配制成浓度为1×10⁴mg/l的母液。

(3)制备带毒平板：将pda培养基加热溶化，冷却至45-50℃，加入母液制成含0.1mg/l、0.3mg/l、0.5mg/l、1.0mg/l和2.0mg/l药液的培养基(对照中加入相应体积的二甲基亚砜)，充分混匀后分别倒入培养皿中冷却。每处理设置3次重复。

(4)接种病原菌：用打孔器(直径为6mm)在预培养的菌落边缘同一圆周上打取菌饼，接入毒板的中央，封口后置于25℃恒温培养箱中培养。

2、数据处理

待对照组的菌落边缘接近皿壁时，采用十字交叉法测量各处理组的菌落直径，并计算生长抑制率。

3、试验结果

泊沙康唑对禾谷镰孢菌、玉米弯孢菌、苹果轮纹病菌、细极链格孢菌、苹果腐烂病菌、尖孢镰刀菌、稻瘟病菌、禾谷丝核菌及灰霉病菌菌落生长速率的影响(图1-9)，供试药剂的浓度及抑制率如表1所示。

表1泊沙康唑对9种病原菌菌丝生长的抑制作用测定结果

从表1和图1-9实验结果可知，本发明所述绿色小分子化合物泊沙康唑对禾谷镰孢菌、玉米弯孢菌、苹果轮纹病菌、细极链格孢、苹果腐烂病菌、尖孢镰刀菌、稻瘟病菌、禾谷丝核菌都有显著抑制作用。而且在0.1mg/l-2mg/l范围内，随着药物浓度升高，抑制效果越明显。

(1)小麦赤霉病菌：赤霉病是一种毁灭性病害，可引起穗腐，造成严重减产和品质降低。随着全球气候变暖、耕作制度和方式的改变，小麦赤霉病不断蔓延扩展，常常造成小麦减产、品质降低，且受侵染的小麦籽粒中含有真菌毒素，可引起人畜中毒和严重疾病。该病菌除危害小麦外，还能侵染大麦、燕麦、水稻、玉米等多种禾本科作物以及鹅冠草等禾本科杂草，此外，还可侵染大豆、棉花、红薯等作物。目前防控小麦赤霉病的主要化学药剂包括多菌灵、戊唑醇等，实验中1mg/l和2mg/l泊沙康唑对禾谷镰孢菌抑菌率为59.06％和72.71％，具有良好的抑制效果。

(2)玉米弯孢菌：玉米弯孢菌可引起玉米叶斑病，根据其症状曾被称为“黄斑病”，主要危害植物叶片，也危害叶鞘和苞叶。玉米叶斑病是玉米生产过程中最主要病害之一，此病害一般使玉米减产20％-30％，个别地块达50％以上，甚至绝产。实验中0.1mg/l泊沙康唑对玉米弯孢菌抑菌率为80.49％，0.125mg/l戊唑醇对玉米弯孢菌抑制率为45.43％，泊沙康唑效果明显优于传统唑类药剂戊唑醇和传统苯并咪唑类药剂多菌灵。

(3)苹果轮纹病菌：苹果轮纹病又名粗皮病、轮纹烂果病，是苹果枝干部和果实上的重要生物灾害，常引起苹果枝干树皮粗糙、局部性坏死和果实腐烂。患病植株坐果率低，导致树体衰弱和产量减少，甚至绝产毁园。近年来，随着易感品种富士苹果的大面积栽培，苹果轮纹病发病率逐年增加，危害面积不断扩大，已成为中国苹果生产中的严重病害，严重威胁着苹果产业的可持续发展。实验中0.1mg/l泊沙康唑对苹果轮纹病菌抑菌率为61.07％，而0.125mg/l戊唑醇对苹果轮纹病菌抑菌率均为48.57％，泊沙康唑效果明显优于传统唑类药剂戊唑醇。

(4)细极链格孢：细极链格孢是能够侵染多种粮食作物、经济作物果蔬的一种病原真菌，也是经济上重要的真菌属之一。大多数种类兼性寄生于植物上，引起多种经济植物病害，造成田间和产后损失。实验中0.5mg/l泊沙康唑对细极链格孢菌抑菌率为60.77％，而0.6mg/l多菌灵对细极链格孢抑菌率为0.91％，泊沙康唑效果明显优于传统药剂多菌灵。实验中0.1mg/l泊沙康唑对细极链格孢菌抑菌率为49.89％，而0.125mg/l戊唑醇对细极链格孢抑菌率为8.84％，泊沙康唑效果明显优于传统药剂戊唑醇。

(5)苹果腐烂病菌：苹果腐烂病是我国苹果的主要病害之一，除危害结果树外，幼树、幼苗也可发病。病轻时引起皮腐烂、树势衰弱，影响苹果的产量和品质。严重时引起主干大枝及整树枯死，甚至毁园，严重制约苹果产业的可持续发展。实验中0.5mg/l泊沙康唑对苹果腐烂病菌抑菌率为100％，而0.6mg/l多菌灵对苹果腐烂病菌抑菌率为100％，泊沙康唑效果略优于传统药剂多菌灵。

(6)尖孢镰刀菌：尖孢镰刀菌是一类既可侵染植物又可在土壤内生存世界性分布的兼性寄生真菌，寄主范围广泛，可引起瓜类、茄科、香蕉、棉、豆科及花卉等100多种植物枯萎病的发生。实验中1mg/l泊沙康唑对尖孢镰刀菌抑制率为35.17％，2mg/l泊沙康唑对尖孢镰刀菌抑制率为49.36％，泊沙康唑具有对尖孢镰刀菌良好的抑制效果。

(7)稻瘟病菌：稻瘟病是水稻重要病害之一，可引起大幅度减产，严重时减产40％～50％，甚至颗粒无收。世界各稻区均匀发生。本病在各地均有发生，其中以叶部、节部发生为多，发生后可造成不同程度减产，尤其穗颈瘟或节瘟发生早而重，可造成白穗以致绝产。实验中0.1mg/l泊沙康唑对稻瘟病菌抑菌率为58.56％，而0.125mg/l戊唑醇对稻瘟病菌抑菌率为10.15％，泊沙康唑效果明显优于传统唑类药剂戊唑醇；实验中0.5mg/l泊沙康唑对稻瘟病菌抑菌率为72.31％，而0.6mg/l多菌灵对稻瘟病菌抑菌率为9.33％，泊沙康唑效果明显优于传统苯并咪唑类药剂多菌灵。

(8)禾谷丝核菌：禾谷丝核菌是引起小麦、大麦、玉米和水稻纹枯病的土传病原真菌。禾谷丝核菌以菌丝和菌核的形式存在，不产生任何形式的分生孢子，生长较慢，颜色较浅。实验中0.1mg/l泊沙康唑对禾谷丝核菌抑菌率为32.10％，而0.6mg/l多菌灵对禾谷丝核菌抑菌率为2.53％，泊沙康唑效果明显优于传统药剂多菌灵。

(9)灰霉病菌：灰霉病菌寄主广泛，可侵染番茄、黄瓜、茄子、菜豆、青椒、芹菜、莴笋、莴苣、葡萄等多种果蔬。实验中0.1mg/l泊沙康唑对灰霉病菌抑菌率为71.23％，而0.6mg/l多菌灵对灰霉病菌抑菌率为29.58％，泊沙康唑效果明显优于传统药剂多菌灵。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。