一种耐高温石花菜的培育方法与流程

本发明涉及一种耐高温石花菜的培育方法，属于石花菜研究与开发应用技术领域。

背景技术：

石花菜(gelidiumamansii)属于红藻门(rhodophyta)真红藻纲(florideae)石花菜目(gelidiales)石花菜科(gelidiaceae)石花菜属(gelidium),藻体呈紫红色或红黄色，直立丛生一般高10-25㎝。石花菜是一种海之珍品，营养成分丰富，含钙、镁、钾、钠和多种无机盐，多糖类等成分，很早以前就为我国沿海群众采集食用。石花菜琼胶含量往往在30％以上，是制造琼胶的主要原料海藻，琼胶亦可以用江蓠、鸡毛菜、紫菜等制取，但就其色泽、透明度、硬度、口感及质量而言都不及石花菜的琼胶制品好。但作为一类重要的经济海藻，石花菜人工养殖尚未形成规模，我国产量主要靠采集野生资源，而过度采集使得野生资源量逐年衰退，造成石花菜资源紧缺。据有关报道，世界各地的石花菜总产量为20000吨，我国年产量不足500吨。目前石花菜已被列为国际紧俏材料，所以推动我国石花菜产业不断蓬勃发展，提高石花菜养殖产量具有广阔的市场前景。

石花菜作为一种世界性红藻，广泛分布于世界三大洋、五大洲。虽然三大洋沿岸都有石花菜的分布，但是太平洋沿岸及其附近岛屿的产量要比大西洋、印度洋的产量大很多。据有关资料介绍，石花菜发源于太平洋的可能性最大。全球现有130多种石花菜，中国沿海分布的石花菜有13种，沿海及岛屿的石花菜分布极广，北起辽东半岛，南至广东、海南，东到台湾沿海都有分布，在众多石花菜种类中，我国主要以养殖栽培石花菜(g.amansii)为主。

石花菜是一种暖温性海藻，具有暖温带的生态特点，对环境条件有一定的要求。同石花菜的生长有关系的主要环境因子有水质、盐度、温度、光照强度、海流以及无机盐类，其中最大的影响因素就是温度。通过对石花菜繁殖生长温度的统计总结：结果表明石花菜的最适生长温度是20-25℃，0℃石花菜停止生长，8℃以上开始生长，但当水温超过27℃，藻体变脆且易折断或腐烂。石花菜生长温度下限较低，可耐受一定低温，但生长温度上限较低，耐高温能力较差。随着夏季温度升高，7、8、9月份海水表层温度可达32℃，为避免高温易引起石花菜腐烂，海区养殖经常要室内度夏，导致养殖成本升高，并严重影响夏茬养殖石花菜的产量，而温度正是影响石花菜生产养殖的决定因素。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明提供一种通过物理诱导高温筛选耐高温石花菜的培育方法，该方法合理易行，应用便捷，能够快速筛选出耐高温石花菜。可使石花菜耐受32℃高温，从而增加夏季海区养殖石花菜耐高温能力，提高夏茬养殖产量，为石花菜养殖带来更高的经济效益。

本发明的第一个目的是提供一种耐高温石花菜的培育方法，包括如下步骤：

(1)选取藻体附着生物少、生长点完整、色泽鲜艳的整颗石花菜，进行培养；

(2)将步骤(1)培养的石花菜通过γ射线辐照处理50～70min，然后暗处理20～25h，更换培养基；

(3)将步骤(2)暗处理后的石花菜置于38～40℃，水浴胁迫25～35min；

(4)将步骤(3)处理后的石花菜置于34～36℃，光照胁迫培养90-100h，收集存活藻体的藻尖；

(5)将步骤(4)收集的藻尖置于20～25℃，光照培养3～5周，4～6天更换一次培养基；

(6)将经过步骤(5)培养后的藻尖置于30～34℃进行光照培养，4～6天更换一次培养基；筛选生长速度快，分枝多的耐高温石花菜。

在本发明中，选择整颗石花菜进行诱变处理，保证了下一步筛选时有足够存活数量的藻尖。

在本发明中，通过采用34～36℃，光照胁迫培养90～100h，较长时间的高温初选，可提高石花菜对温度的适应能力，诱导石花菜获得耐热性。

在本发明中，先采用水浴胁迫，再采用光照胁迫，采用梯度温度胁迫，筛选得到的石花菜耐热性更高，并且生长也比较旺盛。

进一步地，所述的γ射线的辐照剂量为500～900gy。优选700gy，在700gy的诱变剂量照射下石花菜藻体致死率为70-80％，能得到更高的正突变率。

进一步地，在步骤(4)中，光照的条件为光照强度2000～3000lux，光照周期10～14h。

进一步地，在步骤(4)中，所述的藻尖的长度为2～5cm。利用石花菜无性繁殖的生殖方式，随机挑选长度为2-5cm的藻尖，藻尖生长旺盛，可以更快的获得性状明显的突变体。并且可以尽快投入生产使用，大大缩短了养殖周期，提高了经济效益。

进一步地，在步骤(5)中，光照强度为2000～3000lux，光照周期为10～14h。将藻尖置于最适条件下进行培养之后再进行筛选，能够增强突变藻尖的稳定性，更加有利于后期筛选。

进一步地，在步骤(6)中，光照强度为2000～3000lux，光照周期为10～14h。

进一步地，所述的培养基为海水培养基。

本发明的第二个目的是提供所述方法培育得到的耐高温石花菜。

本发明的有益效果是：

本发明的育种方法在诱变处理之后，通过梯度高温胁迫、低温培养、再高温筛选的步骤，能够准确地筛选得到耐高温的石花菜，并且重复性好，合理易行，应用便捷。培育得到的石花菜不仅能在32℃正常生长，而且海区养殖生长速度快。石花菜养殖企业在不改变养殖模式的情况下，诱导培育出的耐高温石花菜突变体可使石花菜养殖企业实现石花菜夏茬正常养殖，使养殖周期延长，可使石花菜企业实现全年生产养殖，极大提高了石花菜产业的经济效益。

附图说明

图1为本发明耐高温石花菜的培育方法的流程图；

图2为普通石花菜藻体最低致死温度曲线；

图3为实施例1筛选得到的耐高温石花菜；

图4为实施例1筛选得到的耐高温石花菜及藻体表面观；其中，a为显微镜下藻体表面外观，b为新生小枝，c为新生的侧假根束；

图5为实施例1筛选得到的耐高温石花菜的耐热性鉴定；

图6为实施例1筛选得到的耐高温石花菜生长速率变化曲线；

图7为实施例2～4筛选得到的耐高温石花菜耐热性鉴定；

图8为实施例2～4筛选得到的耐高温石花菜生长速率变化曲线。

具体实施方式

本发明将根据具体事例做进一步的描述，但其仅为例证性的目的而不祈祷限制性作用。本领域技术人员可由本说明书所解释的内容清楚的了解本发明的特点与功效，本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或运用。

实施例1：

一种耐高温石花菜的筛选培养方法，包括以下步骤：

(1)采集天然生长的石花菜，解剖镜下选择藻体附着生物少，生长点完整、色泽鲜艳的石花菜，使用毛笔刷去附着物；

(2)步骤(1)的藻体经⁶⁰coγ射线在700gy剂量下辐照处理1h，然后暗处理24h，更换培养基；

(3)将步骤(2)暗处理后的石花菜置于39℃，水浴胁迫30分钟；

(4)将步骤(3)处理后的石花菜置于35℃，光照胁迫培养96h进行耐高温初步筛选，收集存活藻体的藻尖，光照强度2500lux，光照时间12h；

(5)将步骤(4)收集的藻尖置于24℃，光照培养4周，5天更换一次培养基，获得初步耐高温石花菜藻尖，培养条件为24℃，光照强度2500lux，光照时间12h；

(6)将经过步骤(5)培养后的藻尖置于32℃进行光照培养，5天更换一次培养基；光照强度2500lux，光照时间12h；筛选生长速度快，分枝多的耐高温石花菜1801。

本实施例筛选得到的耐高温石花菜外观形态：

(1)石花菜梯度温度耐高温初步筛选结果

石花菜诱导处理后在39℃水浴胁迫30min，然后在35℃光照培养箱胁迫培养96h过程中，大部分诱变藻尖出现变绿再变白现象，最终藻尖死亡。但通过观察有藻体颜色仍为紫红色，且有生长迹象，可以断定有突变藻体能存活且耐受高温。筛选得到的存活藻尖如图3所示。

(2)光照培养箱培养结果

1)收集高温胁迫筛选出的存活藻尖，在24℃条件下进行培养，从外观观察发现：有的几天就出现生长现象，有的不生长但颜色不变，有的藻体颜色变绿。不同藻尖的生理状态和生长状态各不相同。

2)四周后，从外观观察：生长旺盛，并有新生小枝的藻尖，暂定为获得的初步耐高温小苗。

(3)石花菜32℃藻尖筛选结果

将筛选获得的初步耐高温小苗置于32℃光照培养箱中培养，筛选获得32℃能正常生长的石花菜。

筛选出的不同藻尖在32℃生长条件下生长状况各有差异，有的藻体变绿再变白，有的藻体部分变绿部分仍为正常颜色并表现出生长现象，有的藻体仍保持藻体颜色正常且表现出生长现象。

通过外观及荧光正置显微镜显微镜对1801进行外观、株长、分枝式、小枝、藻体习性和微观形态观察统计汇总如表1和图4所示。

表11801形态观察统计表

采用普通石花菜作为对照组，1801与对照组石花菜在32℃光照培养箱中，采用相同的培养条件进行培养，观察生长情况，结果如图5所示，对照组在第三天就开始出现藻体变绿、变白现象，最后全部死亡，而1801生长状态一直比较良好。

采用普通石花菜作为对照组，1801与对照组石花菜在南日岛养殖区，采用相同的培养条件进行培养，对照组与1801的平均生长速率变化曲线见图6，其中对照组的日平均生长速率为2.17％，1801的日平均生长速率为3.05％。1801比对照组的日平均生长速率提高了40.5％。

实施例2：

一种耐高温石花菜的筛选培养方法，包括以下步骤：

(1)采集天然生长的石花菜，解剖镜下选择藻体附着生物少，生长点完整、色泽鲜艳的石花菜，使用毛笔刷去附着物；

(2)步骤(1)的藻体经⁶⁰coγ射线在500gy剂量下辐照处理70min，然后暗处理25h，更换培养基；

(3)将步骤(2)暗处理后的石花菜置于38℃，水浴胁迫35分钟；

(4)将步骤(3)处理后的石花菜置于36℃，光照胁迫培养90h进行耐高温初步筛选，收集存活藻体的藻尖，光照强度3000lux，光照时间10h；

(5)将步骤(4)收集的藻尖置于25℃，光照培养3周，4天更换一次培养基，获得初步耐高温石花菜藻尖，光照强度3000lux，光照时间10h；

(6)将经过步骤(5)培养后的藻尖置于32℃进行光照培养，4天更换一次培养基；光照强度3000lux，光照时间10h；筛选生长速度快，分枝多的耐高温石花菜1802。

实施例3：

一种耐高温石花菜的筛选培养方法，包括以下步骤：

(1)采集天然生长的石花菜，解剖镜下选择藻体附着生物少，生长点完整、色泽鲜艳的石花菜，使用毛笔刷去附着物；

(2)步骤(1)的藻体经⁶⁰coγ射线在900gy剂量下辐照处理50min，然后暗处理20h，更换培养基；

(3)将步骤(2)暗处理后的石花菜置于40℃，水浴胁迫25分钟；

(4)将步骤(3)处理后的石花菜置于34℃，光照胁迫培养100h进行耐高温初步筛选，收集存活藻体的藻尖，光照强度2000lux，光照时间14h；

(5)将步骤(4)收集的藻尖置于20℃，光照培养5周，6天更换一次培养基，获得初步耐高温石花菜藻尖，光照强度2000lux，光照时间14h；

(6)将经过步骤(5)培养后的藻尖置于32℃进行光照培养，6天更换一次培养基；光照强度2000lux，光照时间14h；筛选生长速度快，分枝多的耐高温石花菜1803。

实施例4：

一种耐高温石花菜的筛选培养方法，包括以下步骤：

(1)采集天然生长的石花菜，解剖镜下选择藻体附着生物少，生长点完整、色泽鲜艳的石花菜，使用毛笔刷去附着物；

(2)步骤(1)的藻体经⁶⁰coγ射线在700gy剂量下辐照处理60min，然后暗处理24h，更换培养基；

(3)将步骤(2)暗处理后的石花菜置于39℃，水浴胁迫30分钟；

(4)将步骤(3)处理后的石花菜置于34℃，光照胁迫培养90h进行耐高温初步筛选，收集存活藻体的藻尖，光照强度3000lux，光照时间10h；

(5)将步骤(4)收集的藻尖置于24℃，光照培养4周，5天更换一次培养基，获得初步耐高温石花菜藻尖，光照强度3000lux，光照时间10h；

(6)将经过步骤(5)培养后的藻尖置于32℃进行光照培养，5天更换一次培养基；光照强度3000lux，光照时间10h；筛选生长速度快，分枝多的耐高温石花菜1804。

对比例1：

采用以下步骤对石花菜进行筛选：

(1)采集天然生长的石花菜，解剖镜下选择藻体附着生物少，生长点完整、色泽鲜艳的石花菜，使用毛笔刷去附着物；

(2)步骤(1)的藻体经⁶⁰coγ射线在700gy剂量下辐照处理1h，然后暗处理24h，更换培养基；

(3)将步骤(2)处理后的石花菜置于35℃，光照胁迫培养96h进行耐高温初步筛选，收集存活藻体的藻尖，光照强度2500lux，光照时间12h；

(4)将步骤(3)收集的藻尖置于24℃，光照培养4周，5天更换一次培养基，获得初步耐高温石花菜藻尖，培养条件为24℃，光照强度2500lux，光照时间12h；

(5)将经过步骤(4)培养后的藻尖置于32℃进行光照培养，5天更换一次培养基；光照强度2500lux，光照时间12h。

经过上述步骤(1)～(5)的筛选，没有筛选出生长速率，分支多的耐高温石花菜，筛选得到的石花菜只能耐受30℃的培养温度，并且在30℃培养时生长速率缓慢，在25℃培养时，与普通石花菜生长速率接近。

对比例2：

采用以下步骤对石花菜进行筛选：

(1)采集天然生长的石花菜，解剖镜下选择藻体附着生物少，生长点完整、色泽鲜艳的石花菜，使用毛笔刷去附着物；

(2)步骤(1)的藻体经⁶⁰coγ射线在700gy剂量下辐照处理1h，然后暗处理24h，更换培养基；

(3)将步骤(2)暗处理后的石花菜置于39℃，水浴胁迫30分钟；

(4)将步骤(3)处理后的石花菜置于38℃，光照胁迫培养48h进行耐高温初步筛选，收集存活藻体的藻尖，光照强度2500lux，光照时间12h。

采用上述光照胁迫方案进行光照胁迫后，几乎没有收集到存活的藻尖。

对比例3：

采用以下步骤对石花菜进行筛选：

(1)采集天然生长的石花菜，解剖镜下选择藻体附着生物少，生长点完整、色泽鲜艳的石花菜，使用毛笔刷去附着物；

(2)步骤(1)的藻体经⁶⁰coγ射线在700gy剂量下辐照处理1h，然后暗处理24h，更换培养基；

(3)将步骤(2)暗处理后的石花菜置于39℃，水浴胁迫30分钟；

(4)将步骤(3)处理后的石花菜置于32℃，光照胁迫培养100h进行耐高温初步筛选，收集存活藻体的藻尖，光照强度2500lux，光照时间12h；

(5)将步骤(4)收集的藻尖置于24℃，光照培养4周，5天更换一次培养基，获得初步耐高温石花菜藻尖，培养条件为24℃，光照强度2500lux，光照时间12h；

(6)将经过步骤(5)培养后的藻尖置于32℃进行光照培养，5天更换一次培养基；光照强度2500lux，光照时间12h。

经过上述步骤(1)～(6)的筛选，没有筛选得到耐高温的石花菜，石花菜在步骤(6)培养第四天就开始出现藻体变绿、变白现象，最后全部死亡。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。