常温机械灌注联合基因修饰的干细胞修复小动物器官系统的制作方法

本发明属于医用设备技术领域，尤其是涉及常温机械灌注联合基因修饰的干细胞修复小动物器官系统。

背景技术：

目前，器官移植是治疗同种疾病的重要方法，以肝移植为例，肝移植是治疗多种终末期肝病的最有效手段。随着手术适应症的扩大及手术量的增长，器官短缺成为制约着我国肝移植发展的重要原因。

基于供肝短缺的情形，很多学者开始研究如何扩大供肝来源，其中包括尝试使用以前被认为的不适宜手术的边缘供体。现今，最常用的肝脏体外保存方式是静态冷保存(staticcoldstorage,scs)，scs是在获取器官后灌入uw液(theuniversityofwisconsinsolution)，并将器官浸泡于uw液中，于4℃左右的低温条件下静态保存。scs通过降低细胞活性抑制细胞代谢，并添加抗氧化物质来清除氧自由基以起到保护细胞的作用。虽然scs用于保存质量优秀的健康肝脏时效果稳定可靠，但是在用于保存边缘供体时，术后出现原发性移植肝无功能及多种并发症的概率会增加。鉴于scs的局限性，为改善边缘供体的质量，很多学者研究开发采用常温机械灌注(normothermicmachineperfusion,nmp)用于体外保存供肝。

目前，用于科研使用的动物器官常温机械灌注系统没有统一的标准，大多自制常温机械灌注系统，存在着很多问题，其中主要包括以下几点：

1.温度维持方面，用于保存人体器官的热交换器体积较大不适用于保存小动物器官，采用水浴锅保温调节温度速度慢，且占用空间大，温水易滋生细菌，不利于维持灌注装置的洁净；

2.小动物器官体积小，血管管径狭窄，灌注的难度大且不易控制血管内压力，造成人为损伤；

3.采用气泡清除装置清除灌注液中的气泡，避免造成栓塞，但是不能清除灌注液的固体杂质；

4.装置中的零件都摆放在外部环境中，在使用灌注液时增大了灌注液污染的风险，并且灌注操作程序冗杂。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种结构简单、操作简单、提高器官保存安全性、实时检测保存过程中的器官状态的常温机械灌注联合基因修饰的干细胞修复小动物器官系统。

本发明的技术方案如下：

常温机械灌注联合基因修饰的干细胞修复小动物器官系统，包括壳体、器官仓、与器官仓连接灌注循环管路、过滤装置和氧合装置，所述器官仓、灌注循环管路、过滤装置和氧合装置安装在壳体内，所述器官仓为一密闭空腔，所述器官仓的顶部形成有灌注入口，在底部形成有灌注出口，所述灌注出口与设置在灌注循环管路上的蠕动泵连接，所述蠕动泵的出口端与过滤装置进口端连接以用于持续向过滤装置输送灌注液，所述过滤装置的出口端通过灌注循环管路与氧合装置连接，所述氧合装置的出口端与灌注入口连接以用于将氧合后的灌注液注入器官仓内，在所述灌注循环管路上设有一四通管，所述四通管的四个端口分别连接灌注入口、氧合装置、检测装置和取样口，所述器官仓的外部安装一加热器以用于器官仓内部恒温；

所述氧合装置包括氧气管路和氧合器，所述氧气管路外接氧气罐，在氧气管路上设有氧气调控组件以用于调节灌注液与氧气在氧合器中的含量；

所述检测装置包括检测仪、感压探头和感温探头，所述感温探头设置在器官仓内部，所述感压探头与四通管连接，所述感压探头、感温探头与检测仪电连接以用于监测灌注液温度和器官门脉压力。

在上述技术方案中，在所述灌注循环管路靠近灌注入口段上设有加热夹，且在灌注循环管路上设有保温套。

在上述技术方案中，所述加热器四周为圆型，下面为锥形，加热元件采用镍铬丝，两面包以导热绝缘材料。

在上述技术方案中，所述加热器的厚度为1cm。

在上述技术方案中，所述过滤装置采用微血栓过滤器。

在上述技术方案中，所述器官仓的外部设有仓盖。

在上述技术方案中，所述氧合器采用中空纤维膜式氧合器。

本发明的另一个目的是提供一种基于常温机械灌注联合基因修饰的干细胞修复小动物器官系统的灌注液，在本系统内，灌注液是以ml为单位制备的，灌注液总体积为100ml，包括体积占比10-20％的胎牛血清，dmem/f12培养基60-80ml，15-25ml新鲜全血，最终红细胞比容为10％-15％，在上述组分的基础上再添加以下药物：青霉素50-100u/ml，链霉素50-100μg/ml，肝素2-5u/ml，地塞米松1-2.5μg/ml，前列地尔0.1-0.2μg/ml，胰岛素0.5-1u/ml。

现有的器官机械灌注大多在威廉姆斯e培养基(william’smediume,we)的基础上添加其他物质来作为灌注液，但是申请人发现we培养基不适于骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells,bmmscs)的生存，为了预防干扰会添加万古霉素和庆大霉素，但是这两种抗生素会对干细胞生长有不利影响。

其中对于本发明中涉及到的名词进行解释：

静态冷保存(scs组)；

单纯常温机械灌注(nmp组)；

骨髓间充质干细胞(bmmscs联合nmp组)；

ho-1基因修饰的骨髓间充质干细胞(ho-1/bmmscs联合nmp组)。

本发明具有的优点和积极效果是：

1.单泵-单循环灌注方便控制灌注液总循环量和蠕动速度，充沛氧合与维持温度增加热效应，在灌注循环管路中通过异形的加热器精确调整灌注液温度，并通过感温探头及感压探头实时监测灌注液温度及器官状态。

2.器官仓盖密封器官仓，具有良好的保温作用，避免异物进入灌注液中，污染灌注液。

3.装置设置在壳体内，与外界绝缘，降低污染概率，提高保温效果，切占用空间小，操作简单便捷，方便运输。

4.灌注液中添加的青霉素和链霉素预防干扰且不会对干细胞生长产生影响，再添加ho-1基因修饰的bmmscs，有效增加对损伤器官的修复。

附图说明

图1是本发明的常温机械灌注联合基因修饰的干细胞修复小动物器官系统的结构示意图；

图2是实验期间不同灌注液对干细胞的细胞指数图；

图3是实验期间相同灌注液不同抗菌药对干细胞的细胞指数图；

图4是实验期间不同体外保存方式6h后对受损肝脏保护后的肝脏外观图；

图5是大鼠肝移植术后7d、14d大鼠血清谷丙转氨酶(alt)测量图；

图6是大鼠肝移植术后7d、14d大鼠血清谷草转氨酶(ast)测量图；

图7是大鼠肝移植术后7d光学显微镜下肝脏病理he染色图；

图8是大鼠肝移植术后生存时间图。

图中：

1、器官2、器官仓3、加热器

4、胆汁5、蠕动泵6、灌注循环管路

7、过滤装置8、氧气罐9、氧气调控组件

10、氧气管路11氧合器、12、保温套

13、加热夹14、四通管15、取样口

16、感压探头17、检测仪18、感温探头

19、壳体

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明，决不限制本发明的保护范围。

实施例1

如图所示，本发明的常温机械灌注联合基因修饰的干细胞修复小动物器官系统，包括壳体19、器官仓2、与器官仓2连接灌注循环管路6、过滤装置7和氧合装置，器官仓2、灌注循环管路6、过滤装置7和氧合装置安装在壳体19内，器官仓2为一密闭空腔，器官仓2的顶部形成有灌注入口，在底部形成有灌注出口，灌注出口与设置在灌注循环管路6上的蠕动泵5连接，蠕动泵5的出口端与过滤装置7进口端连接以用于持续向过滤装置7输送灌注液，过滤装置7的出口端通过灌注循环管路6与氧合装置连接，氧合装置的出口端与灌注入口连接以用于将氧合后的灌注液注入器官仓2内，在灌注循环管路6上设有一四通管14，四通管14的四个端口分别连接灌注入口、氧合装置、检测装置和取样口15，器官仓2的外部安装一加热器3以用于器官仓2内部恒温。

上述氧合装置包括氧气管路10和氧合器11，氧气管路10外接氧气罐8，在氧气管路10上设有氧气调控组件9以用于调节灌注液与氧气在氧合器11中的含量；

上述检测装置包括检测仪17、感压探头16和感温探头18，感温探头18设置在器官仓2内部，感压探头16与四通管14连接，感压探头16、感温探头18与检测仪17电连接以用于监测灌注液温度和器官门脉压力。

进一步地说，在灌注循环管路6靠近灌注入口段上设有加热夹13，且在灌注循环管路6上设有保温套12，在灌注循环管路6上均设置了保温套12，利于温度的维持。

进一步地说，本装置的加热器3为可控温的电加热器3，以硅橡胶加热器3定制而成。加热元件采用镍铬丝，两面包以导热绝缘材料，经高温模压成形及老化热处理而成，因此具有很高的可靠性。采用四周为圆型，下面为锥形的加热器3利于稳定维持温度，并可精确调整加热器3的温度，加热器3的厚度为1cm，体积小有利于灌注装置的小型化，在灌注液进入器官前管路外连接加热夹13，并且在所有管路外加保温套12，更利于温度的维持和体外细胞的生长和增殖。在环境温度为20-24℃时，加热器3加热温度为58-65℃，可控制灌注液温度为36.5-38.0℃，为温度控制制定了标准，便于操作。

进一步地说，过滤装置7采用微血栓过滤器，可以清除灌注液中的血栓等固体杂质，同时还可以防止气泡进入灌注液，从而达到去除固体杂质和气泡的双重效果。

其他研究者多采用气泡清除装置清除灌注液中的气泡以防止栓塞，但没有处理固体杂质的装置，本装置采用微血栓过滤器，即清除灌注液中的血栓等固体杂质，同时也防止气泡进入灌注液，达到去除灌注液中固体杂质和气泡的双重效果，功能更加全面。同时，本装置的过滤装置7中的滤网为尼龙材质，孔径为100μm，可以允许红细胞及间充质干细胞顺利通过。

进一步地说，氧合器11采用中空纤维膜式氧合器11，使得血液在中空纤维外流动可减少血液的剪切力，减轻红细胞损伤，有效氧合面积在0.2m²，通过氧合器11使灌注液与氧气对流，氧合能力强以满足器官1的需氧量，且预充量小。

进一步地说，在灌注循环管路6中，只采用一个蠕动泵5控制循环流量及蠕动速度，以充分氧合和维持温度增加热效应，与目前现有技术中采用的双泵-双循环灌注相比，单泵-单循环使用便捷、简单，并且蠕动泵5为循环动力，灌注液只与泵管接触而不会接触泵体，降低了灌注液污染的风险，实验成本低。

小动物器官1体积小，血管管径狭窄，如果采用双循环灌注，一方面增加灌注难度，另一方面很难控制管内压力，造成人为损伤。并且单循环管路操作更加简单，便于快速进行灌注。现有的灌注装置，各项装置部件零散摆放于外部环境中，不利于装置的运输，操作程序冗杂，实验装置未与外界环境隔绝，增加了灌注液污染的风险。

本发明的具体操作如下(以大鼠的肝脏为例)：

(1)在启动本发明的灌注系统前，先使用1l生理盐水重复冲洗灌注系统5次；

(2)通过灌注入口加注灌注液后(灌注液总体积为100ml，主要由体积占比10-20％的胎牛血清，dmem/f12培养基60ml，15ml大鼠新鲜全血(最终红细胞比容为10％-15％左右)组成，在总体积为100ml的前提下，再添加以下药物：青霉素100u/ml、链霉素100μg/ml、肝素5u/ml、地塞米松2.5μg/ml、前列地尔0.2μg/ml和胰岛素1u/ml，且控制灌注液流速为1.5-2ml/min/g；

(3)启动氧合装置，控制氧气流量保持在30ml/min，氧合装置运行30min以排除管路中的气泡；

(4)将肝脏与灌注系统的管路连接，肝脏漂浮在肝脏仓内，灌注液在蠕动泵5的驱动下，经微血栓过滤器过滤，氧合器11使红细胞载氧后经门脉向肝脏灌注，胆管与肝脏仓连接以用于引流收集胆汁4，感压探头16实时检测门脉压力，开始对肝脏进行常温灌注，灌注过程中维持门脉压力为10-14cmh2o；

(5)在达到8h保存时间后，关闭蠕动泵5停止灌注，之后取下肝脏，而后关闭氧合器11及加热器3；

(6)排净灌注循环系统内的灌注液，之后用1l无菌蒸馏水反复冲洗灌注循环系统，直至无血液及杂质残留，而后再加入100ml的1％过氧乙酸溶液对整个灌注装置内部系统浸泡消毒，并用紫外灯照射1h。

在肝脏体外进行常温灌注实验期间，灌注液温度要始终维持在36.5-38℃，且在灌注开始时及开始后每小时从取样口15留取灌注液标本，并留取胆汁4。

其中，在实验期间采用的灌注液为dmem/f12培养基，培养基内含磷酸盐缓冲对，能够维持灌注液的ph值稳定。

如图2所示，使用相同的本发明的常温机械灌注系统时，分别使用we培养基和dmem/f12培养基，其中dmem/f12培养基中的bmmscs生长状态优于we培养基。

灌注液成分方面：(1)灌注液以dmem/f12完全培养基为基础，提供了多种的营养物质，包括葡萄糖、无机盐、多种必需氨基酸氨基酸、维生素等，并且其含有磷酸盐缓冲对，在体外灌注过程中维持ph稳定在7.35-7.45之间，无需额外添加碳酸氢钠调节ph。(2)添加胎牛血清补充蛋白质等营养物质，并调节灌注液的胶体渗透压，使其接近正常的血液胶体渗透压。(3)按照一定比例添加红细胞作为载氧体，能保证器官1的需氧量。(4)添加青霉素、链霉素起到预防感染的作用。(5)添加肝素预防凝血的发生，减少栓塞的风险。(6)添加胰岛素调节细胞对葡萄糖的利用。(7)添加前列地尔改善器官1微循环，抗血小板凝聚。(8)添加地塞米松抗炎、抗内毒素、并增强应激反应，减轻环境变化对器官1的损伤。

如图3所示，在采用相同的培养基情况下，分别采用方案一与方案二的抗菌药，方案一为本发明中使用链霉素与青霉素的抗菌药方案，方案二为使用万古霉素与庆大霉素组合的抗菌药方案，其中方案一使bmmscs生长状态优于方案二。

图4-图8中，a、b、c、d组分别为四种不同体外保存方式，对四种体外保存的名称解释如下：

a：静态冷保存(scs组)；

b：单纯常温机械灌注(nmp组)；

c：骨髓间充质干细胞(bmmscs联合nmp组)；

d：ho-1基因修饰的骨髓间充质干细胞(ho-1/bmmscs联合nmp组)

对照组即a组(scs组)，利用uw液冲净肝脏内血液后，浸泡于uw中，在4℃的环境中低温保存。

如图4所示，a组肝脏肿大，表面有瘀斑；b组肝脏边缘稍圆钝，表面有少许白色点状坏死灶，c组肝脏无水肿，仅在肝叶边缘出现少许白色点状坏死；d组肝脏边缘锐利，无水肿、坏死及瘀斑，由此看出使用本发明的灌注液b、c和d组对肝脏的保护效果均明显优于目前常规应用的静态冷保存(a)组，而c和d组的作用效果更好，以d组最为显著。

如图5所示，d组在大鼠肝移植术后谷丙转氨酶(alt)低于其他三组，说明使用本发明的常温机械灌注系统对于肝脏的修复作用ho-1/bmmscs优于bmmscs，且c组明显优于b组，b组优于a组。

如图6所示，d组在大鼠肝移植术后谷草转氨酶(ast)低于其他三组，说明使用本发明的常温机械灌注系统对肝脏的修复作用最佳。

如图7所示，a组部分肝小叶破坏，干细胞条索排列紊乱，正常结构破坏，部分干细胞肿胀变性，有炎症细胞浸润及坏死灶。

b组肝小叶结构损害交情，轻微炎症细胞浸润，可见散在肝细胞核浓缩、空泡变性、偶见单个肝细胞坏死。

c组肝小叶结构完整，肝细胞条索排列整齐，偶见肝细胞核浓缩，无明显炎症细胞浸润。

d组肝小叶组织结构较完整，肝细胞条索排列整齐，无明显淋巴细胞浸润，未见明显肿胀、变性、坏死。

综上所述，使用本发明的常温机械灌注联合基因修饰的干细胞系统对肝脏的修复效果最好。

如图8所示，a组中位生存期，3d；b组中位生存期，16d；c组中位生存期，45d；d组中位生存期，大于60d，使用本发明的常温机械灌注系统的生存时间最长，证明本系统对肝脏修复效果最好。

实施例2

在实施例1的基础上，肝脏仓的外部设有仓盖以用于密封肝脏仓，防止灌注液被污染而影响灌注实验。

以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的等同变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

为了易于说明，实施例中使用了诸如“上”、“下”、“左”、“右”等空间相对术语，用于说明图中示出的一个元件或特征相对于另一个元件或特征的关系。应该理解的是，除了图中示出的方位之外，空间术语意在于包括装置在使用或操作中的不同方位。例如，如果图中的装置被倒置，被叙述为位于其他元件或特征“下”的元件将定位在其他元件或特征“上”。因此，示例性术语“下”可以包含上和下方位两者。装置可以以其他方式定位(旋转90度或位于其他方位)，这里所用的空间相对说明可相应地解释。

而且，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个与另一个具有相同名称的部件区分开来，而不一定要求或者暗示这些部件之间存在任何这种实际的关系或者顺序。

以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的等同变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。