一种抗病番茄砧木根系分泌物收集液及其对青枯病菌的抑制方法与流程

本发明涉及蔬菜代谢产物提取和抗病栽培技术领域，尤其涉及一种抗病番茄砧木根系分泌物收集液及其对青枯病菌的抑制方法。

背景技术：

番茄(solanumlycopersicummill.)是我国广泛栽培的果菜之一，由于不合理的耕作和水肥供给，导致土壤连作障碍情况加剧，近年来土传病害发生严重。青枯病是由青枯雷尔氏菌(ralstoniasolanacearume.f.smith，以下简称青枯菌)引起的一种土传性维管束病害，常造成茄科作物的大面积萎蔫死亡。由于青枯菌特有的生活习性和传播特性，使用常规的化学药剂难以防治，给番茄生产造成了极大的威胁。植物在受到逆境胁迫时会通过调控自身的次生代谢途径来应对不利环境的影响，利用植物或微生物的次生代谢产物来防控土传病害逐渐成为研究热点。当植物根系受到病原菌侵染时，根部次生代谢物质的合成增加可以防御病原菌的侵袭，根系分泌物是植物根部主要的次生代谢产物。有研究表明，番茄抗病砧木的根系分泌物具有一定的化感潜力，能够对土壤中的青枯菌的生长和增殖产生抑制作用，从而提高番茄对青枯病的抗性。因此，可利用番茄抗病砧木的根系分泌物来防控青枯病，推广应用于生产中。

目前根系分泌物的收集方法包括土培法、基质培法及营养琼脂培养法，然而这些方法操作复杂，收集量小，难以推广。

技术实现要素：

本发明的目的在于：针对上述存在的问题，提供一种抗病番茄砧木根系分泌物收集液及其对青枯病菌的抑制方法，用于抑制青枯菌的生长和增殖，从而降低番茄青枯病的发病率。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种抗病番茄砧木根系分泌物收集液，所述的抗病番茄砧木根系分泌物收集液用于抑制青枯病菌。

较佳地，本发明提供了一种抗病番茄砧木根系分泌物收集液对青枯病菌的抑制方法，包括抗病番茄砧木根系分泌物的收集、青枯菌的培养及根系分泌物抑菌作用鉴定。

较佳地，所述抗病番茄砧木根系分泌物收集液的收集方法，包括如下步骤：

(1)将供试番茄砧木品种用50孔穴盘育苗；

(2)播种后待幼苗长至三叶一心时转于营养钵中培养，统一进行水肥管理；

(3)幼苗生长至现蕾期后，分别用清水和去离子水将植株根系清洗干净后放入水培槽中进行水培；

(4)连续通气培养10h后即得植株根系分泌物收集液，浓缩后将浓缩液过0.22μm细菌过滤器，保存于4℃条件下备用，即得。

较佳地，所述供试番茄砧木品种为番砧1号和/或茄砧21号。

较佳地，在步骤(3)，所述水培在人工气候室内进行，保持室内光源光暗期16h/8h，昼夜温度26℃/20℃，相对湿度50-60％。

较佳地，所述青枯菌的抑制为对高感青枯病的植株，使用抗病番茄砧木根系分泌物收集液进行灌根抑制。

较佳地，所述灌根的具体方法为，使用抗病番茄砧木根系分泌物收集液对高感青枯病的番茄进行灌根，每株施加20ml，每隔3d施加一次，连续施加3次。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

(1)本发明的抗病番茄砧木根系分泌物的收集方法操作简单方便，采用水培的方法收集效率高，安全环保，可重复利用；

(2)利用抗病番茄砧木根系分泌物收集液抑制青枯病菌，安全环保，成本低，提供的试验方法能够直观反映抗病番茄砧木根系分泌物对病原菌的抑制作用；在生产中应用抗病砧木的根系分泌物可有效抑制土壤中青枯病菌的生物活性，从而减少或延缓番茄的发病；

(3)本发明采用na培养基和ttc培养基分别作为青枯菌的扩繁培养基和鉴定培养基，其组分均为辅助成分，蛋白胨和酸水解酪蛋白为青枯菌的生长和繁殖提供了氮源，牛肉膏和葡萄糖提供了氨源和碳源，琼脂本身无营养价值，用于加速培养基的凝固；ttc可以使青枯菌在培养基中呈现为中间粉红色、边缘乳白色的特异性菌落，用于对青枯菌的鉴定。

附图说明

图1为实施例1中抗病番茄砧木根系分泌物对青枯菌的抑制效果图；

图2为图1的数据体现图；

图3为实施例2的数据体现图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下举出优选实施例，对本发明进一步详细说明。然而，需要说明的是，说明书中列出的许多细节仅仅是为了使读者对本发明的一个或多个方面有一个透彻的理解，即便没有这些特定的细节也可以实现本发明的这些方面。

实施例1

一种抗病番茄砧木根系分泌物对青枯菌的抑制方法，制备方法如下：

(1)抗病番茄砧木根系分泌物的收集：

1)将不同供试番茄砧木品种用50孔穴盘育苗，育苗基质按泥炭：椰糠：珍珠岩＝2:1:1配制，定期补充水肥；供试番茄砧木品种为“番砧1号”(no.1)、“茄砧21号”(no.21)，对照为高感青枯病番茄品种粉贝贝(fb)；

2)播种后待三叶一心时转至营养钵中培养，基质与所述步骤1中一致，统一进行水肥管理；

3)幼苗生长至现蕾期后收集根系分泌物，每品种取10株健壮幼苗，将苗小心地从营养钵中取出，尽量避免伤根；用自来水充分洗去根上附着的基质，然后用去离子水冲洗两遍，洗净后放入遮光处理的小塑料桶中，加入500ml去离子水没过根系；

4)将收集装置移至人工气候室中，设置光源光期16h/暗期8h，室内昼夜温度26℃/20℃，相对湿度50-60％；将充气软管插入去离子水中，连续10h通气培养后即得植株的根系分泌物收集液；

5)不同品种根系分泌物收集液经定容、过滤后，统一调整成相同浓度0.05g/ml(指每ml收集液中含0.05g鲜根重的根系分泌物)，置于4℃冰箱中保存备用。

(2)青枯菌的培养：

1)选用na培养基作为青枯菌的扩繁培养基，其组分和含量如下：牛肉膏3.0g、蛋白胨5.0g、葡萄糖10.0g、琼脂15.0g；

2)上述各组分混匀后加入1l去离子水，充分搅拌溶解后分装至锥形瓶中，瓶口用硅胶塞密封，包上一层牛皮纸并用绳扎紧；

3)将锥形瓶置于高压灭菌器中，以0.103mpa，121℃高压蒸汽灭菌20min；

4)将灭菌完成的培养基倒入无菌培养皿(90mm)中，待其自然凝固后划线接种青枯菌。密封培养皿，置于温度为28℃的培养箱中扩繁2d，4℃条件下保存、备用。

(3)根系分泌物抑菌试验：

1)挑取扩繁培养的青枯菌菌体，用无菌水稀释至od600＝1.0，梯度稀释至浓度为1×10^-4cfu/ml，4℃条件下保存、备用；

2)抑菌试验培养基的配制：a.ttc基础培养基的配置，其组分和含量如下：葡萄糖5.0g、蛋白胨10.0g、酸水解酪蛋白1.0g、琼脂18.0g，后续步骤同na培养基配制方法一致；b.灭菌完成的ttc基础培养基晾凉至55℃，加过滤灭菌的1％的2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2，3，5-triphenvltetrazolium，ttc)水溶液，使终浓度为0.005％，摇匀即得ttc培养基；c.在无菌培养皿中倒入9ml晾凉至40℃的ttc培养基，分别加入1ml过滤灭菌的fb、no.1和no.21的根系分泌物收集液，摇匀，待其自然凝固，以加入无菌水的培养基作为对照组(ck)；

3)取0.1ml所述步骤1中的青枯菌菌液滴到培养皿中，用玻璃凃棒在培养基上均匀涂布，密封培养皿，置于温度为28℃的培养箱中培养2d，重复3次；

4)2d后统计每皿菌落数，计算相对抑菌率。

青枯菌相对抑菌率＝(对照皿菌落数量-处理皿菌落数量)/对照皿菌落数量×100

结果分析：

参见图1为实施例1中抗病番茄砧木根系分泌物对青枯菌的抑制效果，图2为图1的数据体现图。以ck作为参照计算青枯菌相对抑菌率，采用抗病砧木根系分泌物配制成的培养基可显著抑制青枯菌的增殖，参见图2，no.1和no.21的相对抑菌率分别为7.69％和10.53％，而fb则促进了青枯菌的增殖，相对抑菌率为-10.32％，图中小写字母表示p＝0.05水平下的差异显著性，下同。若提高砧木根系分泌物的浓度，则其抑制效果增强。

实施例2

抗病砧木根系分泌物对提高番茄对青枯病抗性的作用，实施方法如下：

青枯菌接种试验：1)以高感青枯病的番茄为试材，在72孔穴盘中播种育苗，待幼苗长至三叶一心后移苗至营养钵中培养，统一进行水肥管理。2)缓苗3d后开始用不同品种植株的根系分泌物灌根，每株施加20ml，每隔3d施加一次，连续施加3次。每处理灌根30株，3次重复。3)一周后采用伤根灌注法接种青枯菌，每钵灌入菌液15ml。4)接种青枯菌后，连续观察30d，统计各处理的发病率和病情指数。

根据植株发病情况将病情级别分为5级。0级：无症状；1级：1片叶萎蔫；2级：2-3片叶萎蔫；3级：除顶部2-3片叶外，其他叶片均萎蔫；4级：全株叶片萎蔫，植株死亡。

发病率(％)＝(发病株数/接种总株数)×100

病情指数＝∑(病情级别×该病级株数)/(病情最高级别×接种总株数)×100

结果分析：从图3可以看出，与ck相比，用抗病番茄砧木no.1和no.21的根系分泌物灌根后，番茄青枯病的发病率和病情指数显著降低，fb则与ck差异不大，说明抗病砧木的根系分泌物能够提高番茄对青枯病抗性。若采用浓缩技术提高根系分泌物的浓度，抗病效果更好。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。