一种利用桔梗花药培养诱导愈伤组织的方法与流程

本发明属于植物学领域，具体涉及一种利用桔梗花药培养诱导愈伤组织的方法。

背景技术：

桔梗platycodongrandiflorum(jacq.)a.dc.属于桔梗科、桔梗属多年生双子叶草本植物，为我国的大宗药材，需求量大，是一种药、食、赏兼用植物。桔梗根部入药，其主要活性成分是皂苷，具有镇咳、抗炎、降血压、降血糖、减肥、抗肿瘤、提高人体免疫力等广泛的药理活性。

桔梗主要采用种子或无性扦插繁殖，但种子繁殖存在生产周期长，产量低，种子发芽率不高，扦插枝条成活率又很低，严重限制了生产的发展。

组织培养技术在桔梗品种改良、种质保存、快速繁殖、基因转移等多方面得到广泛应用。桔梗组织在离体培养条件下，体细胞染色体更易发生各种变异，基因突变的频率也大为提高，这极大丰富了桔梗遗传资源，为药用植物改良开辟了新的途径。利用组织培养快繁技术可为桔梗栽培提供足量优质种苗；另外开展桔梗组织培养技术的研究，还可为桔梗其他方面的研究提供各种符合要求的材料。桔梗的茎尖、茎段和叶片离体材料均可诱导分化再生植株。

李玉芬、弭晓菊利用组织培养技术对桔梗不同外植体根、茎、叶进行愈伤组织诱导及植株再生过程研究，成功地诱导桔梗产生愈伤组织并获得了分化苗。发现外植体根、茎、叶愈伤组织诱导的频率不同，并筛选出最佳的愈伤组织诱导的培养基及苗分化培养基。朱玉灵等对桔梗的茎尖、茎段、叶片进行离体培养和植株再生试验研究。舒娈、高山林的实验结果表明，桔梗试管苗可以较容易地诱导出愈伤组织，并且愈伤组织保持着较强的再分化能力。杨耀文、钱子刚等用上胚轴作为外植体进行桔梗组织培养的研究。向邓云以下胚珠、茎尖、茎段和根尖为外植体对桔梗愈伤组织诱导及不定芽形成进行了研究。结果表明在ms+2.4-d3.0mg/l+6-ba0.2mg/l的培养基上，下胚轴愈伤组织可形成丛生芽，不定芽分化能力较强；根尖愈伤组织芽分化能力次之；茎尖和茎段愈伤组织无芽分化。

桔梗花属于两性花，据文献报道和套袋自交试验表明，在自然状态下桔梗的自交结实率低，结实主要靠异花授粉。桔梗的遗传育种研究进展缓慢，通过花药培养得到单倍体植株，再经染色体加倍得到纯合体，从中选出的优良纯系后代不分离,表现整齐一致,可缩短育种年限。在诱导频率较高时，单倍体能在植株上较充分地显现重组的配子类型，可提供新的遗传资源和选择材料。

愈伤组织是进行植物快速繁殖、原生质体制备、转基因研究中一个重要载体，可为其倍性育种、组培快繁、体细胞杂交、无性系变异以及遗传转化提供良好的试验材料，最终为桔梗的遗传改良提供重要基础。以往对桔梗不同外植体根、茎、叶进行愈伤组织诱导研究。桔梗花药大，数量多、开花期较长，为其进行花药培养提供了充分的材料，但国内外未见利用桔梗进行花药培养的相关报告。

技术实现要素：

为解决现有技术的不足，本发明提供了一种利用桔梗花药培养诱导愈伤组织的方法。

本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种利用桔梗花药培养诱导愈伤组织的方法，包括以下步骤：晴天午后采集未开放花蕾，用湿纱布包好，装入封口袋中黑暗环境下4℃低温预处理24h-48h，将花蕾用自来水加吐温20冲洗20min，75%乙醇浸泡30s，1%升汞消毒8-10min，在超净工作台无菌条件下用无菌水冲洗3-5遍，解剖镜下剥取花药，接种在培养基上；所述培养基为ms培养基，添加蔗糖30g/l、琼脂6g/l、激素，ph值为5.8，120-125℃下灭菌20min；所述激素为6-ba和/或2,4-d、naa，所述6-ba浓度为0mg.l^-1-2.0mg.l^-1；所述2,4-d浓度为0mg.l^-1-2.0mg.l^-1；所述naa浓度为0mg.l^-1-0.2mg.l^-1；花药愈伤组织诱导期间进行黑暗培养，温度为25±1℃。

本发明提供的方法可在白花桔梗花药培养中应用。

本发明提供的方法在白花桔梗花药培养中应用时，所述激素为1.0mg.l^-16-ba和2.0mg.l^-12,4-d。

本发明提供的方法在白花桔梗花药培养中应用时，所述低温预处理的时间为48h。

本发明提供的方法可在紫花桔梗花药培养中应用。

本发明提供的方法在紫花桔梗花药培养中应用时，所述激素为1.0mg.l^-16-ba、1.0mg.l^-12,4-d和0.2mg.l^-1naa。

本发明提供的方法在紫花桔梗花药培养中应用时，所述低温预处理的时间为24-48h。

本发明的有益效果为：本发明提供了一种利用桔梗花药培养诱导愈伤组织的方法，本发明的方法愈伤组织起动早，诱导率高，愈伤组织体积大，质地紧密。本发明为桔梗花药培养、单倍体育种、诱变育种等提供了基础。

附图说明

图1是图示低温预处理的不同时间对愈伤组织诱导的影响。

具体实施方式

实施例1桔梗花药培养诱导愈伤组织的试验

no.1材料与方法

no.1.1试验材料

试验材料品种为白花桔梗（即bhjg）和紫花桔梗（即zhjg），来自于山东农业大学药用植物园。

no.1.2试验方法

晴天午后采集未开放花蕾，用湿纱布包好，装入封口袋中黑暗环境下4℃保存1d（温度预处理材料除外），将花蕾用自来水加吐温20冲洗20min，75%乙醇浸泡30s，1%升汞消毒8-10min，在超净工作台无菌条件下用无菌水冲洗3-5遍，解剖镜下剥取花药，接种在培养基上。接种密度为15个花药/瓶，每处理三次重复，每重复三瓶。

以ms培养基为诱导培养基，添加蔗糖30g/l，琼脂6g/l，ph值为5.8，120-125℃下灭菌20min。花药愈伤组织诱导期间进行黑暗培养，温度为25±1℃。30d后调查愈伤组织诱导率和组织块大小、质量，期间每一周观察一次愈伤组织生长情况。愈伤组织诱导率（%）=（形成愈伤组织数/接种花药数）×100%。

no.1.2.1不同激素配比及浓度对愈伤组织诱导的影响

分别以紫花桔梗和白花桔梗为试验材料，取单核靠边期的花药为外植体，分别接种在含6-ba、2,4-d、naa不同浓度组合的愈伤组织诱导培养基上。接种后30d统计各处理的愈伤组织诱导率。三种激素均设三个水平，分别是：6-ba：0mg.l-1、1.0mg.l-1、2.0mg.l-1；2,4-d：0mg.l-1、1.0mg.l-1、2.0mg.l-1；naa：0mg.l-1、0.1mg.l-1、0.2mg.l-1。采用l9（33）正交试验设计（表1、2）。

no.1.2.2不同温度处理对愈伤组织诱导的影响

以白花和紫花桔梗为供试材料，将采集的花蕾用湿纱布包裹，进行4℃低温处理1d、2d、3d，30d后比较各基因型诱导率高低。

no.2结果与分析

no.2.1不同激素处理对白花桔梗花药培养产生愈伤组织的影响

以单核靠边期的花药为外植体，花药培养中常用的6-ba、2,4-d、naa为外源激素，设置不同的水平进行试验。从表1看出，不添加任何外源激素的处理1诱导出愈率为0，而培养基中加入外源激素都能够显著的提高出愈率，通过对三种外源激素出愈率的极差比较发现针对于不同基因型材料，激素的影响大小不同。对于白花桔梗6-ba的作用最大，其次为2,4-d，naa的作用最小，说明6-ba在白花桔梗花药培养中的影响显著。不同的激素组合和浓度配比对桔梗愈伤组织诱导效果也不同。

接种的花药置于25℃、自然光照条件下培养20d后，有的花药周围开始出现淡黄色的愈伤组织，刚开始愈伤组织生长缓慢，但以后逐渐加快，过45d后中等愈伤组织大小与火柴头相等。

接种45d后调查发现，在添加1.0mg.l-16-ba+2.0mg.l-12,4-d即处理6的培养基中，白花桔梗愈伤组织诱导率最高，达到了88.9%，同时，白花桔梗在处理6的培养基中愈伤组织起动时间最早，花药膨大且颜色淡黄，然后在两端出现火柴头似的白点，质地紧密且体积最大，为白花桔梗的最佳激素组合。而在其他激素组合处理下，诱导出的愈伤组织颜色为黄色或黄褐色，质地松散且体积较小，白色雪花状的愈伤较多。

表1不同激素处理对白花桔梗花药培养产生愈伤组织的影响

no.2.2不同激素处理对紫花桔梗花药培养产生愈伤组织的影响

从表2看出，不添加任何外源激素的处理1诱导出愈率为0，而培养基中加入外源激素都能够显著的提高出愈率。通过对三种外源激素出愈率的极差比较发现，对于紫花桔梗2，4-d的作用最大，其次为naa，6-ba的作用最小。

接种的花药置于25℃、自然光照条件下培养20d后，有些花药周围开始出现淡黄色的愈伤组织，刚开始愈伤组织生长缓慢，但以后逐渐加快，过45d后中等愈伤组织大小与火柴头相等。

接种45d后调查发现，在添加1.0mg.l^-16-ba+1.0mg.l^-12,4-d+0.2mg.l^-1naa即处理5的培养基中，紫花桔梗愈伤组织诱导率最高，达到了97.8%，同时，紫花桔梗在处理5的培养基中愈伤组织起动早，质地紧密且体积最大，为紫花桔梗的最佳激素组合。

表2不同激素处理对紫花桔梗花药培养产生愈伤组织的影响

激素在桔梗花药愈伤组织诱导中起关键作用，试验所设的不同组合的激素中，添加1.0mg.l^-16-ba+2.0mg.l^-12,4-d的培养基上白花桔梗愈伤组织诱导率最高，质量最好，最高出愈率为88.9%；添加1.0mg.l^-16-ba+1.0mg.l^-12,4-d+0.2mg.l^-1naa的培养基上紫花桔梗愈伤组织诱导率最高，质量最好，最高出愈率为97.8%。

no.2.3不同基因型对花药培养产生愈伤组织的影响

花药培养诱导愈伤组织的难易，不同的基因型存在很大的差异。本实验的两个基因型材料，在小孢子发育处于单核靠边期的花药进行愈伤组织的诱导时均能诱导出愈伤组织（表3），但愈伤组织诱导率差异较大，表明桔梗花药培养中基因型对花药愈伤组织的产生具有很大的影响。在供试的两个不同基因型的材料中，紫花桔梗诱导率较高，属于较易诱导出愈伤组织的基因型。长出的愈伤组织大多颜色淡黄，质地紧密。白花桔梗愈伤组织诱导率较低，与紫花桔梗差异显著，且诱导出的愈伤颜色且诱导出的愈伤组织质地松散，白色雪花状的较多。

表3不同基因型对愈伤组织诱导的影响

no.2.4不同预处理温度对愈伤组织诱导率的影响

低温预处理的作用主要是能够提供一个更合适的环境以利于愈伤组织的诱导，很多植物的花药经过低温预处理后培养效果较不经低温预处理的效果好。从图1可以看出，将小孢子发育时期处于单核靠边期的花蕾经过低温（4℃）预处理24h、48h、72h后，均能诱导出愈伤组织。低温处理两天，达最高诱导率，与未经低温处理的差异显著。说明小孢子发育处于单核靠边期的花药进行低温预处理的适宜时间是48h。另外也可以看出紫花桔梗出愈率比白花桔梗对低温处理时间的敏感性小。