本发明属于水产养殖繁育技术领域，具体涉及一种凡纳滨对虾胚胎的冷冻保存方法。
背景技术：
凡纳滨对虾(litopenaeusvannamei)，又称南美白对虾，别名白脚虾、凡纳对虾，原产地中南美太平洋海岸水域，适合在热带、亚热带、暖温带、温带海域养殖。凡纳滨对虾是当前世界上养殖产量最高的三大优良品种之一，它具有对水环境抗逆能力强、营养要求低、生长速度快、虾体含肉量高、离水存活时间长和抗病能力强等特点。由于凡纳滨对虾养殖经济效益显著，现已成为世界上养殖规模最大产量最高的对虾品种。
在凡纳滨对虾养殖繁育过程中，如何有效保存人工授精后得到的胚胎是提高凡纳滨对虾养殖效率和经济效益的重要手段，因为鱼虾等渔业资源的繁殖期是季节性的，难以人工控制住，为了满足生产与研究的长期需要，人们可以利用低温保存方法将诸如生长快、抗病力强的优良品种的胚胎在亲本繁殖期保存起来，以备需要时复温取用。将凡纳滨对虾的胚胎冷冻贮存，解冻后用于种苗生产，实现种苗生产的全人工化，降低育苗成本，节省人力和财力，打破时空界限，做到随时育苗和生产，进而提高养成虾的规格和产量。但是由于受到凡纳滨对虾胚胎大小，结构等因素的影响，现阶段少有高效、操作方便的凡纳滨对虾胚胎冷冻保存方法的报道。
技术实现要素：
针对上述不足，本发明提供了一种凡纳滨对虾胚胎的冷冻保存方法，对获得的凡纳滨对虾胚胎进行低温冷冻保存，满足凡纳滨对虾养殖与研究的长期需要，而且操作简单，易于推广应用。
本发明是采用如下技术方案实现的：
一种凡纳滨对虾体胚胎的冷冻保存方法，其包括以下步骤：
a.胚胎冷冻：先用抗冻液对孵化8h的凡纳滨对虾的胚胎进行抗冻处理，然后采用慢速冷冻法或快速冷冻法对胚胎进行冷冻处理；所述的慢速冷冻法是将抗冻处理后的胚胎装入细管封口后置于4℃下，然后按照2℃/min的速度逐渐降低温度至-7℃，渗透平衡4min后进行植冰，然后再渗透平衡4min，接着按照0.4℃/min的速度逐渐降低温度至-35℃，然后投入液氮保存；所述的快速冷冻法是将抗冻处理后的胚胎立即装入细管封口后直接投入液氮保存；
b.胚胎解冻：从液氮中取出细管，迅速浸入30℃的水中，待细管变为透明后立即进行洗脱将胚胎冲洗到培养皿中，然后将胚胎置于孵化桶中进行孵化；所述洗脱是直接洗脱或者逐级洗脱，所述的直接洗脱是用浓度为0.125～0.5mol/l的蔗糖溶液浸泡5min，然后用海水漂洗胚胎2次；所述的逐级洗脱是先用浓度为0.5mol/l的蔗糖溶液浸泡5min，再用浓度为0.25mol/l的蔗糖溶液浸泡5min，接着用浓度为0.125mol/l的蔗糖溶液浸泡5min，然后用海水漂洗胚胎2次。
进一步，步骤a中所述的植冰是用在液氮中预冷的镊子夹住细管10s。
进一步，步骤a中所述的抗冻处理是采用直接法、分步法和逐级法中任意一种方法进行抗冻处理；所述的直接法是将孵化8h的凡纳滨对虾的胚胎直接放入抗冻液中30～90s，然后立即进行冷冻处理；所述的分步法是先按海水:抗冻液为（3～10）:1的体积比将海水和抗冻液均匀混合得到混合液b，然后用混合液b对孵化8h的凡纳滨对虾的胚胎浸泡5min，接着再用抗冻液浸泡30s后，立即进行冷冻处理；所述的逐级法是将孵化8h的凡纳滨对虾的胚胎分别在1/4、1/3、1/2、2/3、1倍的抗冻液梯度溶液中进行渗透平衡，在每一梯度液中平衡5min，共25min后，立即进行冷冻处理。
进一步，步骤a中所述的抗冻液主要包括以下体积份数的组分：甘油25～45份，海水55～60份。
进一步，步骤a中所述的抗冻液还包括体积份数为4～15份的辅助剂，所述的辅助剂为甲醇、乙二醇和丙三醇中的任意一种或几种混合。
进一步，步骤a中所述的抗冻液中还包括以下浓度的组分：牛血清蛋白3mg/ml、聚蔗糖10mg/ml、蔗糖0.5mol/l。
进一步，步骤b中所述的孵化桶的中部设有一层150目的网，以防止胚胎沉底。
进一步，上述的海水是经过常规的紫外线灭菌器灭菌后得到的海水。
本技术方案与现有技术相比较具有以下有益效果：
1、本发明使用甘油作为主要成分，配合甲醇、丙三醇和乙二醇制备适合冷冻处理凡纳滨对虾胚胎的抗冻液，与现有技术中常用的二甲亚砜相比，本发明的抗冻液对凡纳滨对虾胚胎的毒性小，而且与慢速冷冻方法配合使用，冷冻保存的凡纳滨对虾的胚胎成活率高。
2、本发明所配制的冷冻液中还添加了牛血清蛋白、聚蔗糖、蔗糖等非渗透性抗冻剂，针对凡纳滨对虾胚胎的特性，将渗透性抗冻剂和非渗透性剂抗冻剂混合配制使用，一方面提高了抗冻液的胚胎外渗透力和脱出胚胎中水分的能力，防止了胚胎冷冻中过多水份生成冰晶对胚胎细胞的损伤；另一方面降低了单独使用高浓度渗透性抗冻剂对胚胎产生的毒性作用。
3、本发明采用低温冷冻保存方法保存凡纳滨对虾胚胎，保存的胚胎孵化率高，而且操作简单，易于推广应用。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。下列实施例中未注明的具体实验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1：
一种凡纳滨对虾体胚胎的冷冻保存方法，其包括以下步骤：
a.胚胎冷冻：先将孵化8h的凡纳滨对虾的胚胎直接放入抗冻液中30s，然后立即进行冷冻处理，将抗冻处理后的胚胎装入细管封口后置于4℃下，然后按照2℃/min的速度逐渐降低温度至-7℃，渗透平衡4min后进行植冰，然后再渗透平衡4min，接着按照0.4℃/min的速度逐渐降低温度至-35℃，然后投入液氮保存；所述的植冰是用在液氮中预冷的镊子夹住细管10s；所述的抗冻液包括以下体积份数的组分：甘油45份，海水60份；所述的海水是经过常规的紫外线灭菌器灭菌后得到的海水；
b.胚胎解冻：从液氮中取出细管，迅速浸入30℃的水中，待细管变为透明后立即进行洗脱将胚胎冲洗到培养皿中，然后将胚胎置于孵化桶中进行孵化；所述洗脱是用浓度为0.5mol/l的蔗糖溶液浸泡5min，然后用海水漂洗胚胎2次；所述的孵化桶的中部设有一层150目的网，以防止胚胎沉底。
实施例2：
一种凡纳滨对虾体胚胎的冷冻保存方法，其包括以下步骤：
a.胚胎冷冻：先按海水:抗冻液为3:1的体积比将海水和抗冻液均匀混合得到混合液b，然后用混合液b对孵化8h的凡纳滨对虾的胚胎浸泡5min，接着再用抗冻液浸泡30s后，立即进行冷冻处理，将抗冻处理后的胚胎装入细管封口后置于4℃下，然后按照2℃/min的速度逐渐降低温度至-7℃，渗透平衡4min后进行植冰，然后再渗透平衡4min，接着按照0.4℃/min的速度逐渐降低温度至-35℃，然后投入液氮保存；所述的植冰是用在液氮中预冷的镊子夹住细管10s；所述的抗冻液包括以下体积份数的组分：甘油36份，海水55份，甲醇4份；所述的海水是经过常规的紫外线灭菌器灭菌后得到的海水；
b.胚胎解冻：从液氮中取出细管，迅速浸入30℃的水中，待细管变为透明后立即进行洗脱将胚胎冲洗到培养皿中，然后将胚胎置于孵化桶中进行孵化；所述洗脱是用浓度为0.25mol/l的蔗糖溶液浸泡5min，然后用海水漂洗胚胎2次。所述的孵化桶的中部设有一层150目的网，以防止胚胎沉底。
实施例3：
一种凡纳滨对虾体胚胎的冷冻保存方法，其包括以下步骤：
a.胚胎冷冻：先将孵化8h的凡纳滨对虾的胚胎直接放入抗冻液中60s，然后立即进行冷冻处理，将抗冻处理后的胚胎立即装入细管封口后直接投入液氮保存；所述的抗冻液主要包括以下体积份数的组分：甘油30份，海水58份，乙二醇6份；所述的抗冻液中还包括以下浓度的组分：牛血清蛋白3mg/ml、聚蔗糖10mg/ml、蔗糖0.5mol/l；所述的海水是经过常规的紫外线灭菌器灭菌后得到的海水；
b.胚胎解冻：从液氮中取出细管，迅速浸入30℃的水中，待细管变为透明后立即进行洗脱将胚胎冲洗到培养皿中，然后将胚胎置于孵化桶中进行孵化；所述洗脱是直接洗脱用浓度为0.125mol/l的蔗糖溶液浸泡5min，然后用海水漂洗胚胎2次；所述的孵化桶的中部设有一层150目的网，以防止胚胎沉底。
实施例4：
一种凡纳滨对虾体胚胎的冷冻保存方法，其包括以下步骤：
a.胚胎冷冻：先将孵化8h的凡纳滨对虾的胚胎分别在1/4、1/3、1/2、2/3、1倍的抗冻液梯度溶液中进行渗透平衡，在每一梯度液中平衡5min，共25min后，立即进行冷冻处理，将抗冻处理后的胚胎装入细管封口后置于4℃下，然后按照2℃/min的速度逐渐降低温度至-7℃，渗透平衡4min后进行植冰，然后再渗透平衡4min，接着按照0.4℃/min的速度逐渐降低温度至-35℃，然后投入液氮保存；所述的植冰是用在液氮中预冷的镊子夹住细管10s；所述的抗冻液主要包括以下体积份数的组分：甘油33份，海水56份，丙三醇7份；所述的抗冻液中还包括以下浓度的组分：牛血清蛋白3mg/ml、聚蔗糖10mg/ml、蔗糖0.5mol/l；所述述的海水是经过常规的紫外线灭菌器灭菌后得到的海水；
b.胚胎解冻：从液氮中取出细管，迅速浸入30℃的水中，待细管变为透明后立即进行洗脱将胚胎冲洗到培养皿中，然后将胚胎置于孵化桶中进行孵化；所述洗脱是先用浓度为0.5mol/l的蔗糖溶液浸泡5min，再用浓度为0.25mol/l的蔗糖溶液浸泡5min，接着用浓度为0.125mol/l的蔗糖溶液浸泡5min，然后用海水漂洗胚胎2次；所述的孵化桶的中部设有一层150目的网，以防止胚胎沉底。
实施例5：
一种凡纳滨对虾体胚胎的冷冻保存方法，其包括以下步骤：
a.胚胎冷冻：先将孵化8h的凡纳滨对虾的胚胎分别在1/4、1/3、1/2、2/3、1倍的抗冻液梯度溶液中进行渗透平衡，在每一梯度液中平衡5min，共25min后，立即进行冷冻处理，将抗冻处理后的胚胎立即装入细管封口后直接投入液氮保存；抗冻液主要包括以下体积份数的组分：甘油25份，海水57份，丙三醇7份，乙二醇8份；所述的抗冻液中还包括以下浓度的组分：牛血清蛋白3mg/ml、聚蔗糖10mg/ml、蔗糖0.5mol/l；所述的海水是经过常规的紫外线灭菌器灭菌后得到的海水；
b.胚胎解冻：从液氮中取出细管，迅速浸入30℃的水中，待细管变为透明后立即进行洗脱将胚胎冲洗到培养皿中，然后将胚胎置于孵化桶中进行孵化；所述洗脱是用浓度为0.5mol/l的蔗糖溶液浸泡5min，再用浓度为0.25mol/l的蔗糖溶液浸泡5min，接着用浓度为0.125mol/l的蔗糖溶液浸泡5min，然后用海水漂洗胚胎2次；所述的孵化桶的中部设有一层150目的网，以防止胚胎沉底。
实施例6：
一种凡纳滨对虾体胚胎的冷冻保存方法，其包括以下步骤：
a.胚胎冷冻：先按海水:抗冻液为5:1的体积比将海水和抗冻液均匀混合得到混合液b，然后用混合液b对孵化8h的凡纳滨对虾的胚胎浸泡5min，接着再用抗冻液浸泡30s后，立即进行冷冻处理，将抗冻处理后的胚胎装入细管封口后置于4℃下，然后按照2℃/min的速度逐渐降低温度至-7℃，渗透平衡4min后进行植冰，然后再渗透平衡4min，接着按照0.4℃/min的速度逐渐降低温度至-35℃，然后投入液氮保存；所述的植冰是用在液氮中预冷的镊子夹住细管10s；所述的抗冻液包括以下体积份数的组分：甘油40份，海水59份；所述的抗冻液中还包括以下浓度的组分：牛血清蛋白3mg/ml、聚蔗糖10mg/ml、蔗糖0.5mol/l；所述的海水是经过常规的紫外线灭菌器灭菌后得到的海水；
b.胚胎解冻：从液氮中取出细管，迅速浸入30℃的水中，待细管变为透明后立即进行洗脱将胚胎冲洗到培养皿中，然后将胚胎置于孵化桶中进行孵化；所述洗脱是用浓度为0.5mol/l的蔗糖溶液浸泡5min，然后用海水漂洗胚胎2次。所述的孵化桶的中部设有一层150目的网，以防止胚胎沉底。
实施例7：
一种凡纳滨对虾体胚胎的冷冻保存方法，其包括以下步骤：
a.胚胎冷冻：先将孵化8h的凡纳滨对虾的胚胎直接放入抗冻液中90s，然后立即进行冷冻处理，将抗冻处理后的胚胎立即装入细管封口后直接投入液氮保存；所述的抗冻液主要包括以下体积份数的组分：甘油28份，海水57份，乙二醇6份；所述的抗冻液中还包括以下浓度的组分：牛血清蛋白3mg/ml、聚蔗糖10mg/ml、蔗糖0.5mol/l；所述的海水是经过常规的紫外线灭菌器灭菌后得到的海水；
b.胚胎解冻：从液氮中取出细管，迅速浸入30℃的水中，待细管变为透明后立即进行洗脱将胚胎冲洗到培养皿中，然后将胚胎置于孵化桶中进行孵化；所述洗脱是用浓度为0.5mol/l的蔗糖溶液浸泡5min，再用浓度为0.25mol/l的蔗糖溶液浸泡5min，接着用浓度为0.125mol/l的蔗糖溶液浸泡5min，然后用海水漂洗胚胎2次；所述的孵化桶的中部设有一层150目的网，以防止胚胎沉底。
实施例8：
一种凡纳滨对虾体胚胎的冷冻保存方法，其包括以下步骤：
a.胚胎冷冻：先按海水:抗冻液为9:1的体积比将海水和抗冻液均匀混合得到混合液b，然后用混合液b对孵化8h的凡纳滨对虾的胚胎浸泡5min，接着再用抗冻液浸泡30s后，立即进行冷冻处理，将抗冻处理后的胚胎装入细管封口后置于4℃下，然后按照2℃/min的速度逐渐降低温度至-7℃，渗透平衡4min后进行植冰，然后再渗透平衡4min，接着按照0.4℃/min的速度逐渐降低温度至-35℃，然后投入液氮保存；所述的植冰是用在液氮中预冷的镊子夹住细管10s；所述的抗冻液包括以下体积份数的组分：甘油35份，海水57份，丙三醇12份；所述的抗冻液中还包括以下浓度的组分：牛血清蛋白3mg/ml、聚蔗糖10mg/ml、蔗糖0.5mol/l；所述的海水是经过常规的紫外线灭菌器灭菌后得到的海水；
b.胚胎解冻：从液氮中取出细管，迅速浸入30℃的水中，待细管变为透明后立即进行洗脱将胚胎冲洗到培养皿中，然后将胚胎置于孵化桶中进行孵化；所述洗脱是先用浓度为0.5mol/l的蔗糖溶液浸泡5min，再用浓度为0.25mol/l的蔗糖溶液浸泡5min，接着用浓度为0.125mol/l的蔗糖溶液浸泡5min，然后用海水漂洗胚胎2次；所述的孵化桶的中部设有一层150目的网，以防止胚胎沉底。
实施例9：
一种凡纳滨对虾体胚胎的冷冻保存方法，其包括以下步骤：
a.胚胎冷冻：先按海水:抗冻液为10:1的体积比将海水和抗冻液均匀混合得到混合液b，然后用混合液b对孵化8h的凡纳滨对虾的胚胎浸泡5min，接着再用抗冻液浸泡30s后，立即进行冷冻处理，将抗冻处理后的胚胎装入细管封口后置于4℃下，然后按照2℃/min的速度逐渐降低温度至-7℃，渗透平衡4min后进行植冰，然后再渗透平衡4min，接着按照0.4℃/min的速度逐渐降低温度至-35℃，然后投入液氮保存；所述的植冰是用在液氮中预冷的镊子夹住细管10s；抗冻液主要包括以下体积份数的组分：甘油32份，海水55份，丙三醇5份，乙二醇7份；所述的抗冻液中还包括以下浓度的组分：牛血清蛋白3mg/ml、聚蔗糖10mg/ml、蔗糖0.5mol/l；所述的海水是经过常规的紫外线灭菌器灭菌后得到的海水；
b.胚胎解冻：从液氮中取出细管，迅速浸入30℃的水中，待细管变为透明后立即进行洗脱将胚胎冲洗到培养皿中，然后将胚胎置于孵化桶中进行孵化；所述洗脱是用浓度为0.5mol/l的蔗糖溶液浸泡5min，再用浓度为0.25mol/l的蔗糖溶液浸泡5min，接着用浓度为0.125mol/l的蔗糖溶液浸泡5min，然后用海水漂洗胚胎2次；所述的孵化桶的中部设有一层150目的网，以防止胚胎沉底。
按照实施例1～9中所述的方法对获得的胚胎进行冷冻保存5小时后解冻，将解冻后的胚胎进行孵化24h观察孵化结果，统计胚胎成活率和孵化率，具体结果见表1。
表1凡纳滨对虾胚胎的胚胎成活率和孵化率
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。