一种血叶兰组培繁殖方法与流程

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种血叶兰组培繁殖方法。

背景技术：

血叶兰(ludisiadiscolor)又名石蚕，属兰科(orchidaceae)血叶兰属多年生草本植物。血叶兰是高档的观叶观花植物，同时还是名贵药用植物。我国医学书籍《中华本草》、《全国中草药汇编》等均有记载，最早记载于慈济宫保生大帝药签，而今，是海南黎族医生处方的重要药材，药用历史悠久，民间应用广泛。

由于血叶兰具有很好的药用价值，而其种子在自然条件下难以萌发，资源再生慢，加上长期无节制的采挖，资源濒临枯竭。为了更好的保护血叶兰野生资源，应大力发展人工栽培，满足市场需求，保障血叶兰资源的可持续利用。然而关于血叶兰组织培养的快繁技术研究仍然处于初级阶段，在很大程度上阻碍了血叶兰的规模化生产。并且现有的其他兰花品种的组织培养不能直接运用到血叶兰培养上，所以目前急需一种血叶兰组培繁殖方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种育苗优良，培养繁殖快，成苗率高、能获得足量血叶兰种苗的血叶兰组培繁殖方法。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

本发明的血叶兰的组培繁殖方法，包括以下步骤：

a、蒴果消毒和种子萌发：选取无病虫害、长势良好、植株健壮的血叶兰进行人工授粉获得蒴果，选取授粉后20-30天成熟的蒴果清洗后进行消毒处理，将消毒后的蒴果剖开，将种子接种到种子萌发培养基上进行培养，先进行暗培养，培养温度为(25±1)℃，然后再进行常规光照培养，培养温度为(25±1)℃，光照时间为12h/d，光照强度为1500-2000lx，种子萌发形成小苗；所述的种子萌发培养基为：每升含有花宝1号1.5-2.5g、香蕉90-140g、土豆40-80g、肌醇0.05-0.15g、蔗糖10-15g、琼脂5-7g和活性炭1-2g，其余为水，ph值为5.6-5.8；

b、壮苗生根：将小苗转入壮苗生根培养基中，培养温度(25±1)℃，光照时间为12h/d，光照强度为1500-2000lx，获得生根的试管苗；所述的壮苗生根培养基为：每升含有花宝1号2-4g、香蕉90-140g、土豆40-80g、椰汁60-100ml、蛋白胨1-3g、肌醇0.05-0.15g、蔗糖10-15g、琼脂5-7g和活性炭1-2g，其余为水，ph值为5.6-5.8；

c、移栽：将试管苗在自然光下炼苗6-9天，然后取出试管苗并洗净附着在根部的培养基，移栽至培养基质中培养获得血叶兰种苗。

选用无病虫害长势良好的血叶兰植株做母本能降低苗株的发病率，保证在组培过程中不受其他因素的干扰，增加种子萌发成活率。种子由种皮包裹，采用质量分数0.15％的升汞水溶液消毒不会造成种子褐化，消毒15min，可以使消毒效果更好，减少细菌污染的同时，提高成活率。种子萌发过程中先进行暗培养，模拟种子在地下的原始生境，能够使种子在培养过程中逐渐适应培养条件，有利于存活。

所述的选取授粉后20-30天成熟的蒴果清洗后进行消毒处理具体为：选取授粉后20-30天成熟的蒴果，去除表面泥沙，然后用洗洁精清洗干净，置于流水下冲洗30min，在超净工作台上，将蒴果用体积分数75％的酒精水溶液浸泡1min，无菌水冲洗1次，然后浸泡在质量分数0.15％的升汞水溶液中消毒15min，消毒后，用无菌水冲洗5-8次，用无菌滤纸吸干蒴果表面水分。

所述的种子萌发培养基优选为：每升含有花宝1号2g、香蕉120g、土豆50g、肌醇0.1g、蔗糖13g、琼脂6g和活性炭1.5g，其余为水，ph值为5.6。

所述的壮苗生根培养基优选为：每升含有花宝1号3g、香蕉120g、土豆50g、椰汁80ml、蛋白胨2g、肌醇0.1g、蔗糖13g、琼脂6g和活性炭1.5g，其余为水，ph值为5.6。

所述的培养基质优选为椰块，或者椰块和沙石按体积比为1:1混合的混合基质。

本发明通过果荚消毒和种子萌发、壮苗生根和移栽，获得了大量优质的血叶兰种苗。本发明的方法消毒效果好、培养繁殖快、成苗率高，从而能够降低血叶兰在组培过程中的污染率，增大成苗率，提高工作效率。

本发明的有益效果是：通过本发明能对血叶兰进行快速培养繁殖，并且无需添加植物生长调节剂，培养后的血叶兰苗株成苗率高，苗株品质好，栽培后适应性强，作为药用植物安全环保，通过生物技术手段在短时间内，满足了商业化生产的需求，为企业规模化、产业化培养血叶兰提供了技术支持。同时本发明的血叶兰组培繁殖方法消毒效果好，播种无菌率为97％，污染率低，步骤精炼，培养周期短，从而大大提高了成苗率及工作效率，节约了资源。

附图说明：

图1为本发明的血叶兰组培繁殖的流程示意图。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

(1)材料选取：选取无病虫害、长势良好、植株健壮的血叶兰，通过人工授粉获得蒴果；

(2)蒴果预处理：选取授粉后25天成熟的蒴果，用软刷毛将选取的蒴果在水池中进行初步清洗，去除表面泥沙，然后用洗洁精清洗干净，置于流水下冲洗30min；

(3)蒴果消毒：在超净工作台上，将蒴果用体积分数75％的酒精水溶液浸泡1min，无菌水冲洗1次，然后浸泡在质量分数0.15％的升汞水溶液中消毒15min，消毒后，用无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸干蒴果表面水分后放置于培养皿中备用；

(4)种子萌发：将消毒后的蒴果剖开，将种子均匀分布于种子萌发培养基上进行培养，先进行30d的暗培养，培养温度为(25±1)℃，然后再进行常规光照培养60d，培养温度为(25±1)℃，光照时间为12h/d，光照强度为1800lx，种子萌发形成小苗，消毒成功率约95％，萌发率96％；种子萌发培养基为：每升含有花宝1号2g、香蕉120g、土豆50g、肌醇0.1g、蔗糖13g、琼脂6g和活性炭1.5g，其余为水，ph值为5.6；

(5)壮苗生根：种子萌发成苗后，选择带1-2片叶的小苗转入壮苗生根培养基中培养90d，培养温度(25±1)℃，光照时间为12h/d，光照强度为1800lx，试管苗生长至4-5cm高，叶2-4片，根2-4条，生根率为100％；壮苗生根培养基为：每升含有花宝1号3g、香蕉120g、土豆50g、椰汁80ml、蛋白胨2g、肌醇0.1g、蔗糖13g、琼脂6g和活性炭1.5g，其余为水，ph值为5.6；

(6)移栽：当试管苗生长至4-5cm高，根2-4条，叶2-4片时，将试管苗放在自然光下炼苗5天，打开组培瓶瓶盖炼苗2天；然后取出试管苗，用清水洗净附着在根部的培养基，清洗时注意不要损害根部，然后移栽至椰块中，保持湿度和透气，空气湿度为80％，温度为25℃，由此得到血叶兰种苗，移栽成活率为97％。

实施例2：

(1)材料选取：选取无病虫害、长势良好、植株健壮的血叶兰，通过人工授粉获得蒴果；

(2)蒴果预处理：选取授粉后25天成熟的蒴果，用软刷毛将选取的蒴果在水池中进行初步清洗，去除表面泥沙，然后用洗洁精清洗干净，置于流水下冲洗30min；

(3)蒴果消毒：在超净工作台上，将蒴果用体积分数75％的酒精水溶液浸泡1min，无菌水冲洗1次，然后浸泡在质量分数0.15％的升汞水溶液中消毒15min，消毒后，用无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸干蒴果表面水分后放置于培养皿中备用；

(4)种子萌发：将消毒后的蒴果剖开，将种子均匀分布于种子萌发培养基上进行培养，先进行30d的暗培养，培养温度为(25±1)℃，然后再进行常规光照培养60d，培养温度为(25±1)℃，光照时间为12h/d，光照强度为1800lx，种子萌发形成小苗，消毒成功率约93％，萌发率95％；种子萌发培养基为：每升含有花宝1号2.5g、香蕉110g、土豆40g、肌醇0.05g、蔗糖14g、琼脂5g和活性炭1.8g，其余为水，ph值为5.6；

(5)壮苗生根：种子萌发成苗后，选择带1-2片叶的小苗转入壮苗生根培养基中培养90d，培养温度(25±1)℃，光照时间为12h/d，光照强度为1800lx，试管苗生长至4-5cm高，叶2-4片，根2-4条，生根率为100％；壮苗生根培养基为：每升含有花宝1号4g、香蕉110g、土豆40g、椰汁70ml、蛋白胨3g、肌醇0.05g、蔗糖14g、琼脂5g和活性炭1.8g，其余为水，ph值为5.6；

(6)移栽：当试管苗生长至4-5cm高，根2-4条，叶2-4片时，将试管苗放在自然光下炼苗5天，打开组培瓶瓶盖炼苗2天；然后取出试管苗，用清水洗净附着在根部的培养基，清洗时注意不要损害根部，然后移栽至椰块和沙石按体积比为1:1混合的混合基质中，保持湿度和透气，空气湿度为80％，温度为25℃，由此得到血叶兰种苗，移栽成活率为约94％。

实施例3：

(1)材料选取：选取无病虫害、长势良好、植株健壮的血叶兰，通过人工授粉获得蒴果；

(2)蒴果预处理：选取授粉后25天成熟的蒴果，用软刷毛将选取的蒴果在水池中进行初步清洗，去除表面泥沙，然后用洗洁精清洗干净，置于流水下冲洗30min；

(3)蒴果消毒：在超净工作台上，将蒴果用体积分数75％的酒精水溶液浸泡1min，无菌水冲洗1次，然后浸泡在质量分数0.15％的升汞水溶液中消毒15min，消毒后，用无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸干蒴果表面水分后放置于培养皿中备用；

(4)种子萌发：将消毒后的蒴果剖开，将种子均匀分布于种子萌发培养基上进行培养，先进行30d的暗培养，培养温度为(25±1)℃，然后再进行常规光照培养60d，培养温度为(25±1)℃，光照时间为12h/d，光照强度为1800lx，种子萌发形成小苗，消毒成功率约95％，萌发率92％；种子萌发培养基为：每升含有花宝1号1.5g、香蕉140g、土豆60g、肌醇0.08g、蔗糖12g、琼脂7g和活性炭1.3g，其余为水，ph值为5.6；

(5)壮苗生根：种子萌发成苗后，选择带1-2片叶的小苗转入壮苗生根培养基中培养90d，培养温度(25±1)℃，光照时间为12h/d，光照强度为1800lx，试管苗生长至4-5cm高，叶2-4片，根2-4条，生根率为100％；壮苗生根培养基为：每升含有花宝1号2g、香蕉140g、土豆60g、椰汁60ml、蛋白胨1g、肌醇0.08g、蔗糖12g、琼脂7g和活性炭1.3g，其余为水，ph值为5.6；

(6)移栽：当试管苗生长至4-5cm高，根2-4条，叶2-4片时，将试管苗放在自然光下炼苗5天，打开组培瓶瓶盖炼苗2天；然后取出试管苗，用清水洗净附着在根部的培养基，清洗时注意不要损害根部，然后移栽至椰块和沙石按体积比为1:1混合的混合基质中，保持湿度和透气，空气湿度为80％，温度为25℃，由此得到血叶兰种苗，移栽成活率为约93％。

实施例4：

(1)材料选取：选取无病虫害、长势良好、植株健壮的血叶兰，通过人工授粉获得蒴果；

(2)蒴果预处理：选取授粉后25天成熟的蒴果，用软刷毛将选取的蒴果在水池中进行初步清洗，去除表面泥沙，然后用洗洁精清洗干净，置于流水下冲洗30min；

(3)蒴果消毒：在超净工作台上，将蒴果用体积分数75％的酒精水溶液浸泡1min，无菌水冲洗1次，然后浸泡在质量分数0.15％的升汞水溶液中消毒15min，消毒后，用无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸干蒴果表面水分后放置于培养皿中备用；

(4)种子萌发：将消毒后的蒴果剖开，将种子均匀分布于种子萌发培养基上进行培养，先进行30d的暗培养，培养温度为(25±1)℃，然后再进行常规光照培养60d，培养温度为(25±1)℃，光照时间为12h/d，光照强度为1800lx，种子萌发形成小苗，消毒成功率约93％，萌发率94％；种子萌发培养基为：每升含有花宝1号2.5g、香蕉100g、土豆50g、肌醇0.1g、蔗糖15g、琼脂7g和活性炭1g，其余为水，ph值为5.6；

(5)壮苗生根：种子萌发成苗后，选择带1-2片叶的小苗转入壮苗生根培养基中培养90d，培养温度(25±1)℃，光照时间为12h/d，光照强度为1800lx，试管苗生长至4-5cm高，叶2-4片，根2-4条，生根率为100％；壮苗生根培养基为：每升含有花宝1号2g、香蕉100g、土豆50g、椰汁80ml、蛋白胨1g、肌醇0.1g、蔗糖15g、琼脂7g和活性炭1g，其余为水，ph值为5.6；

(6)移栽：当试管苗生长至4-5cm高，根2-4条，叶2-4片时，将试管苗放在自然光下炼苗5天，打开组培瓶瓶盖炼苗2天；然后取出试管苗，用清水洗净附着在根部的培养基，清洗时注意不要损害根部，然后移栽至椰块中，保持湿度和透气，空气湿度为80％，温度为25℃，由此得到血叶兰种苗，移栽成活率为约94％。

实施例5：

(1)材料选取：选取无病虫害、长势良好、植株健壮的血叶兰，通过人工授粉获得蒴果；

(2)蒴果预处理：选取授粉后25天成熟的蒴果，用软刷毛将选取的蒴果在水池中进行初步清洗，去除表面泥沙，然后用洗洁精清洗干净，置于流水下冲洗30min；

(3)蒴果消毒：在超净工作台上，将蒴果用体积分数75％的酒精水溶液浸泡1min，无菌水冲洗1次，然后浸泡在质量分数0.15％的升汞水溶液中消毒15min，消毒后，用无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸干蒴果表面水分后放置于培养皿中备用；

(4)种子萌发：将消毒后的蒴果剖开，将种子均匀分布于种子萌发培养基上进行培养60d，先进行30d的暗培养，培养温度为(25±1)℃，然后再进行常规光照培养，培养温度为(25±1)℃，光照时间为12h/d，光照强度为1800lx，种子萌发形成小苗，消毒成功率约94％，萌发率92％；种子萌发培养基为：每升含有花宝1号1.5g、香蕉90g、土豆80g、肌醇0.13g、蔗糖11g、琼脂6g和活性炭2g，其余为水，ph值为5.6；

(5)壮苗生根：种子萌发成苗后，选择带1-2片叶的小苗转入壮苗生根培养基中培养90d，培养温度(25±1)℃，光照时间为12h/d，光照强度为1800lx，试管苗生长至4-5cm高，叶2-4片，根2-4条，生根率为100％；壮苗生根培养基为：每升含有花宝1号3g、香蕉90g、土豆80g、椰汁90ml、蛋白胨3g、肌醇0.13g、蔗糖11g、琼脂6g和活性炭2g，其余为水，ph值为5.6；

(6)移栽：当试管苗生长至4-5cm高，根2-4条，叶2-4片时，将试管苗放在自然光下炼苗5天，打开组培瓶瓶盖炼苗2天；然后取出试管苗，用清水洗净附着在根部的培养基，清洗时注意不要损害根部，然后移栽至椰块和沙石按体积比为1:1混合的混合基质中，保持湿度和透气，空气湿度为80％，温度为25℃，由此得到血叶兰种苗，移栽成活率为约92％。

实施例6：

(1)材料选取：选取无病虫害、长势良好、植株健壮的血叶兰，通过人工授粉获得蒴果；

(2)蒴果预处理：选取授粉后25天成熟的蒴果，用软刷毛将选取的蒴果在水池中进行初步清洗，去除表面泥沙，然后用洗洁精清洗干净，置于流水下冲洗30min；

(3)蒴果消毒：在超净工作台上，将蒴果用体积分数75％的酒精水溶液浸泡1min，无菌水冲洗1次，然后浸泡在质量分数0.15％的升汞水溶液中消毒15min，消毒后，用无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸干蒴果表面水分后放置于培养皿中备用；

(4)种子萌发：将消毒后的蒴果剖开，将种子均匀分布于种子萌发培养基上进行培养60d，先进行30d的暗培养，培养温度为(25±1)℃，然后再进行常规光照培养，培养温度为(25±1)℃，光照时间为12h/d，光照强度为1800lx，种子萌发形成小苗，消毒成功率约93％，萌发率94％；种子萌发培养基为：每升含有花宝1号2g、香蕉130g、土豆70g、肌醇0.15g、蔗糖10g、琼脂5g和活性炭1.8g，其余为水，ph值为5.6；

(5)壮苗生根：种子萌发成苗后，选择带1-2片叶的小苗转入壮苗生根培养基中培养90d，培养温度(25±1)℃，光照时间为12h/d，光照强度为1800lx，试管苗生长至4-5cm高，叶2-4片，根2-4条，生根率为100％；壮苗生根培养基为：每升含有花宝1号4g、香蕉130g、土豆70g、椰汁100ml、蛋白胨2g、肌醇0.15g、蔗糖10g、琼脂5g和活性炭1.8g，其余为水，ph值为5.6；

(6)移栽：当试管苗生长至4-5cm高，根2-4条，叶2-4片时，将试管苗放在自然光下炼苗5天，打开组培瓶瓶盖炼苗2天；然后取出试管苗，用清水洗净附着在根部的培养基，清洗时注意不要损害根部，然后移栽至椰块中，保持湿度和透气，空气湿度为80％，温度为25℃，由此得到血叶兰种苗，移栽成活率为约95％。

实施例7：

(1)材料选取：选取无病虫害、长势良好、植株健壮的血叶兰，通过人工授粉获得蒴果；

(2)蒴果预处理：选取授粉后20天成熟的蒴果，用软刷毛将选取的蒴果在水池中进行初步清洗，去除表面泥沙，然后用洗洁精清洗干净，置于流水下冲洗30min；

(3)蒴果消毒：在超净工作台上，将蒴果用体积分数75％的酒精水溶液浸泡1min，无菌水冲洗1次，然后浸泡在质量分数0.15％的升汞水溶液中消毒15min，消毒后，用无菌水冲洗8次，用无菌滤纸吸干蒴果表面水分后放置于培养皿中备用；

(4)种子萌发：将消毒后的蒴果剖开，将种子均匀分布于种子萌发培养基上进行培养，先进行30d的暗培养，培养温度为(25±1)℃，然后再进行常规光照培养60d，培养温度为(25±1)℃，光照时间为12h/d，光照强度为1500lx，种子萌发形成小苗，消毒成功率约92％，萌发率91％；种子萌发培养基为：每升含有花宝1号2g、香蕉120g、土豆50g、肌醇0.1g、蔗糖13g、琼脂6g和活性炭1.5g，其余为水，ph值为5.8；

(5)壮苗生根：种子萌发成苗后，选择带1-2片叶的小苗转入壮苗生根培养基中培养90d，培养温度(25±1)℃，光照时间为12h/d，光照强度为1500lx，试管苗生长至4-5cm高，叶2-4片，根2-4条，生根率为100％；壮苗生根培养基为：每升含有花宝1号3g、香蕉120g、土豆50g、椰汁80ml、蛋白胨2g、肌醇0.1g、蔗糖13g、琼脂6g和活性炭1.5g，其余为水，ph值为5.8；

(6)移栽：当试管苗生长至4-5cm高，根2-4条，叶2-4片时，将试管苗放在自然光下炼苗7天，打开组培瓶瓶盖炼苗1天；然后取出试管苗，用清水洗净附着在根部的培养基，清洗时注意不要损害根部，然后移栽至椰块中，保持湿度和透气，空气湿度为85％，温度为22℃，由此得到血叶兰种苗，移栽成活率为87％。

实施例8：

(1)材料选取：选取无病虫害、长势良好、植株健壮的血叶兰，通过人工授粉获得蒴果；

(2)蒴果预处理：选取授粉后30天成熟未开裂的蒴果，用软刷毛将选取的蒴果在水池中进行初步清洗，去除表面泥沙，然后用洗洁精清洗干净，置于流水下冲洗30min；

(3)蒴果消毒：在超净工作台上，将蒴果用体积分数75％的酒精水溶液浸泡1min，无菌水冲洗1次，然后浸泡在质量分数0.15％的升汞水溶液中消毒15min，消毒后，用无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸干蒴果表面水分后放置于培养皿中备用；

(4)种子萌发：将消毒后的蒴果剖开，将种子均匀分布于种子萌发培养基上进行培养60d，先进行30d的暗培养，培养温度为(25±1)℃，然后再进行常规光照培养，培养温度为(25±1)℃，光照时间为12h/d，光照强度为2000lx，种子萌发形成小苗，消毒成功率约92％，萌发率90％；种子萌发培养基为：每升含有花宝1号2g、香蕉120g、土豆50g、肌醇0.1g、蔗糖13g、琼脂6g和活性炭1.5g，其余为水，ph值为5.6；

(5)壮苗生根：种子萌发成苗后，选择带1-2片叶的小苗转入壮苗生根培养基中培养90d，培养温度(25±1)℃，光照时间为12h/d，光照强度为2000lx，试管苗生长至4-5cm高，叶2-4片，根2-4条，生根率为100％；壮苗生根培养基为：每升含有花宝1号3g、香蕉120g、土豆50g、椰汁80ml、蛋白胨2g、肌醇0.1g、蔗糖13g、琼脂6g和活性炭1.5g，其余为水，ph值为5.6；

(6)移栽：当试管苗生长至4-5cm高，根2-4条，叶2-4片时，将试管苗放在自然光下炼苗5天，打开组培瓶瓶盖炼苗2天；然后取出试管苗，用清水洗净附着在根部的培养基，清洗时注意不要损害根部，然后移栽至椰块中，保持湿度和透气，空气湿度为75％，温度为28℃，由此得到血叶兰种苗，移栽成活率为90％。