一种明叶藓原丝体和配子体的快速繁殖方法与流程

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种明叶藓原丝体和配子体无菌快速繁殖方法。

技术背景：

苔藓植物是现存陆生植物中最大的类群之一，仅次于被子植物，隶属于高等植物中较为低等的类群。由于苔藓植物本身个体微小、结构简单，多数苔藓类植物的叶片仅由一层细胞构成使得其对环境变化及人类活动的影响极为敏感。环境的日益恶化、生境的破坏，导致苔藓植物生长、生存受到严重的影响。另外，苔藓植物由于其美观性、新颖性以及其娇小如绒、青翠常绿的特性，深受消费者喜爱。苔藓盆景、苔藓瓶园、苔藓小品、苔藓墙等苔藓产品具有巨大的经济价值和市场潜力。但是，由于市场上的很多苔藓都来自于野生环境，野生苔藓的过度采挖利用，导致苔藓植物的生存与发展受到严重威胁，物种多样性丧失速度更快。目前商业化的苔藓种类极少，为保护野生的苔藓资源，筛选一些适合商业化大规模人工种植的苔藓迫在眉睫。此外，结合组织培养和遗传育种手段对市场上的现有苔藓进行改良，选育更加适合商业化的苔藓新品种，对野生苔藓种质资源多样性的保护以及苔藓产业的健康快速发展具有重要的意义。对野生苔藓进行组织培养，能够大量快速扩繁野生苔藓，为苔藓改良及应用提供技术支持。

明叶藓(vesiculariamontagnei(bel.)broth.)，属植物界苔藓植物门藓纲真藓亚纲灰藓目灰藓科明叶藓属明叶藓种。明叶藓是目前苔藓市场上的主用苔藓之一，植物体中等大，茎匍匐，交织丛生，亮绿色或暗绿色。目前还没有关于明叶藓原丝体和配子体无菌快速繁殖方法的相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种利用植物组织培养技术快繁明叶藓原丝体和配子体的方法，以填补现有的技术空白，能够实现人工大量快速扩繁明叶藓配子体和原丝体。本发明通过组织培养的方式，建立明叶藓快繁体系，既可为改良明叶藓遗传性状提供大量实验材料，也可为应用明叶藓进行园艺组景、园林绿化等提供丰富种源。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

一种明叶藓原丝体和配子体的快速繁殖方法，该方法包括下述步骤：明叶藓孢蒴消毒后，制成孢子悬浮液，取孢子悬浮液接种于lq培养基中培养，孢子萌发产生原丝体，原丝体进行继代和扩大培养，获得数量众多的新生配子体，采用匀浆仪打磨粉碎明叶藓原丝体或/和配子体，将粉碎后的苔藓悬浮液接种到lq培养基上培养。

如所述的一种明叶藓原丝体和配子体的快速繁殖方法，其中明叶藓孢蒴消毒的方法为：野外采集的明叶藓孢蒴用无菌水冲洗30min，冲洗干净后，将孢蒴放入10％次氯酸钠中消毒7min，最后用无菌水清洗5遍。

如所述的一种明叶藓原丝体和配子体的快速繁殖方法，其中所述的lq培养基配方为mgso4.7h2o1μm，kh2po418.4μm，kno310μm，feso4.7h2o45μm；cuso4.5h2o0.22μm，h3bo310μm，cocl2.6h2o0.23μm，na2moo4.2h2o0.1μm，znso4.7h2o0.19μm，mncl2.4h2o2μm，ki0.17μm，ammounimtartrate5mm，cacl25mm，sucrose29mm，agar0.9％。

如所述的一种明叶藓原丝体和配子体的快速繁殖方法，其中所选取的实验材料为已成熟且孢子未散出的孢蒴。

如所述的一种明叶藓原丝体和配子体的快速繁殖方法，其中明叶藓的大量快速繁殖采用匀浆仪打磨粉碎原丝体和配子体，0.1g明叶藓材料混合10ml无菌水，粉碎后将苔藓悬浮液接种到lq培养基上培养。

如所述的一种明叶藓原丝体和配子体的快速繁殖方法，其中所述的匀浆机快繁打磨参数为15s/次，5次/材料。

如所述的一种明叶藓原丝体和配子体的快速繁殖方法，该方法包括以下步骤：野外采集明叶藓的孢蒴，进行表面消毒：用无菌水冲洗30min，将泥土灰尘冲洗干净，在1.5ml无菌离心管中加入1ml10％次氯酸钠和一个孢蒴，浸泡消毒7分钟，消毒后用无菌水清洗5遍，用无菌移液器枪头破碎孢蒴，将孢子释放于1ml无菌水中，用移液器反复吸打使孢子均匀的悬浮在无菌水中，制成孢子悬浮液，取孢子悬浮液接种于lq培养基中，在温度为25℃，光强为60-80μmolphotonsm^-2s^-1，光周期为16小时光照8小时黑暗的培养箱中培养，接种7天后，孢子萌发，14天获得大量原丝体，原丝体培养40天获得大量成熟配子体，采用匀浆仪打磨粉碎明叶藓原丝体或配子体，制成苔藓悬浮液，将粉碎后的苔藓悬浮液接种到lq培养基上培养。采用匀浆仪打磨粉碎原丝体或/和配子体，0.1g明叶藓材料混合10ml无菌水，粉碎后将苔藓悬浮液接种到lq培养基上培养。其中所述的匀浆机快繁打磨参数为15s/次，5次/材料。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

本发明首次建立了人工扩繁明叶藓原丝体和配子体的方法，填补了现有技术空白。

本发明可以在短时间内大量扩繁明叶藓，为明叶藓在实际生产应用中提供丰富的种源，也可以为明叶藓的种质改良提供大量的实验材料和技术保障。

附图说明：

图1为明叶藓孢子悬浮液接种到培养基上后，明叶藓孢子萌发、原丝体、成熟配子体形态的照片；

图2为明叶藓不同成熟度的孢蒴，本发明中选择的是图2中所示的孢蒴。图2中是未成熟的孢蒴，是蒴帽已掉的孢蒴，是蒴齿打开，孢子已散出的孢蒴。

图3为明叶藓配子体在a)培养基(见具体实施方式)上，配子体假根颜色发红、数量增多的照片。

图4为明叶藓孢子接种后7、14、40天的照片。

具体实施方式

下面结合附图，用本发明的实施例对本

技术实现要素：
作进一步详细的说明，但并不以此来限定本发明。

实施例1：

本发明的一种明叶藓原丝体和配子体的快速繁殖方法，包括以下步骤：野外采集明叶藓的孢蒴，进行表面消毒：用无菌水冲洗30min，将泥土灰尘冲洗干净，在1.5ml无菌离心管中加入1ml10％次氯酸钠和一个孢蒴，浸泡消毒7分钟，消毒后用无菌水清洗5遍，用无菌移液器枪头破碎孢蒴，将孢子释放于1ml无菌水中，用移液器反复吸打使孢子均匀的悬浮在无菌水中，制成孢子悬浮液，取孢子悬浮液接种于lq培养基中，在温度为25℃，光强为60-80μmolphotonsm^-2s^-1，光周期为16小时光照8小时黑暗的培养箱中培养，接种7天后，孢子萌发，14天获得大量原丝体，原丝体培养40天获得大量成熟配子体，采用匀浆仪打磨粉碎明叶藓原丝体或配子体，制成苔藓悬浮液，将粉碎后的苔藓悬浮液接种到lq培养基上培养。采用匀浆仪打磨粉碎原丝体和配子体，0.1g明叶藓材料混合10ml无菌水，粉碎后将苔藓悬浮液接种到lq培养基上培养。其中所述的匀浆机快繁打磨参数为15s/次，5次/材料。

本发明使用实验材料为明叶藓(vesiculariamontagnei(bel.)broth.)，采集地点是云南昆明，具体位置是alt.1942m，北纬25°8ˊ16〞，东经102°44ˊ38〞。

采集野外生长的明叶藓孢蒴，进行表面消毒，具体方法为明叶藓孢蒴用无菌水冲洗30min；冲洗干净后，在1.5ml无菌离心管中加入1ml10％次氯酸钠和一个孢蒴，消毒7min，消毒后用无菌水清洗5遍。

用无菌移液器枪头破碎孢蒴，将孢子释放于1ml无菌水中，用移液器反复吸打使孢子均匀的悬浮在无菌水中，制成孢子悬浮液。每皿培养基中接种200μl孢子悬浮液，将培养皿置于光照培养箱中进行培养，培养条件为温度25℃，光强为80μmolphotonsm^-2s^-1，光周期为16小时光照8小时黑暗。

按照常规方法制备适宜明叶藓孢子萌发的培养基，培养基配方组成为以下3种：a)mgso4.7h2o1μm，kh2po418.4μm，kno310μm，feso4.7h2o45μm；cuso4.5h2o0.22μm，h3bo310μm，cocl2.6h2o0.23μm，na2moo4.2h2o0.1μm，znso4.7h2o0.19μm，mncl2.4h2o2μm，ki0.17μm，ammounimtartrate5mm，agar0.9％，cacl25mm，sucrose58mm；b)mgso4.7h2o1μm，kh2po418.4μm，kno320μm，feso4.7h2o45μm；cuso4.5h2o0.22μm，h3bo310μm，cocl2.6h2o0.23μm，na2moo4.2h2o0.1μm，znso4.7h2o0.19μm，mncl2.4h2o2μm，ki0.17μm，ammounimtartrate5mm，agar0.9％，cacl25mm；c)mgso4.7h2o1μm，kh2po418.4μm，kno320μm，feso4.7h2o45μm；cuso4.5h2o0.22μm，h3bo310μm，cocl2.6h2o0.23μm，na2moo4.2h2o0.1μm，znso4.7h2o0.19μm，mncl2.4h2o2μm，ki0.17μm，ammounimtartrate5mm，agar0.9％，cacl25mm，sucrose58mm。

孢子接种后每天用光学显微镜和倒置荧光显微镜观察孢子的萌发情况。a)和c)培养基上的明叶藓孢子萌发率和原丝体生长情况无明显差异，b)培养基上的明叶藓孢子几乎没有萌发。比较上述结果可知在培养基添加sucrose有助于明叶藓孢子萌发以及原丝体的生长。比较上述结果确定a)培养基配方较适合明叶藓孢子萌发及原丝体生长。

明叶藓配子体用a)培养基培养时，出现配子体假根发红、数量增多的现象(见附图3)，进一步筛选适宜明叶藓配子体正常生长的培养基，设置三种不同的sucrose浓度：15mm、29mm、44mm。培养结果显示sucrose浓度为15mm时，明叶藓配子体生长较慢，配子体纤细柔弱；sucrose浓度为29mm时，明叶藓配子体生长正常；sucrose浓度为44mm时，明叶藓配子体假根数量较多。比较上述结果可知适宜明叶藓配子体培养的sucrose浓度为29mm。在此培养基上明叶藓孢子萌发、原丝体生长、配子体生长均正常，故在本发明中，均采用同一种培养基培养明叶藓，培养基命名为lq，培养基配方为：mgso4.7h2o1μm，kh2po418.4μm，kno310μm，feso4.7h2o45μm；cuso4.5h2o0.22μm，h3bo310μm，cocl2.6h2o0.23μm，na2moo4.2h2o0.1μm，znso4.7h2o0.19μm，mncl2.4h2o2μm，ki0.17μm，ammounimtartrate5mm，agar0.9％，cacl25mm，sucrose29mm。

采用匀浆仪打磨粉碎原丝体和配子体可以大量快速繁殖明叶藓，具体方法为0.1g明叶藓材料混合10ml无菌水，粉碎后将苔藓悬浮液接种到lq培养基上培养。