利用水杨酸诱导植物叶片黄酮类和萜内酯类化合物积累的方法和应用与流程

本发明涉及的是生物技术领域，尤其涉及一种利用水杨酸诱导植物叶片黄酮类和萜内酯类化合物积累的方法和应用。

背景技术：

水杨酸(salicylicacid,sa)，化学名称为邻羟基苯甲酸，酚酸类物质，是植物体内普遍存在的一类信号分子和新型的植物激素，在许多生理反应和基因表达方面发挥着重要的调控作用。水杨酸的复合物进入植物体内后，通过水解作用形成水杨酸并发挥作用。水杨酸作为一种与抗逆有关的植物激素，能够进入植物细胞内，调控植物次生代谢途径并对植物的次生代谢产物的合成和积累产生重要影响。当病原体侵染植物时，内源sa可以快速响应，并通过调节细胞内抗氧化酶系统和防御蛋白的合成来抵抗外界胁迫。外源喷施的水杨酸可作为诱导子提高次生代谢产物相关酶活性以及相关基因的表达量，开启ca²⁺、h⁺通道，促进植物次生代谢物的合成。例如，研究证明，施用外源sa可以对丹参(salviamiltiorrhizabge.)、苦橙(citrusaurantiuml.)、甘菊(matricariachamomilla)等药用植物中的活性物质的合成起到促进的作用。但是，目前关于水杨酸对次生代谢产物的影响大多集中在水杨酸浓度调节控制上，对于其它调控因素，尚无文献报道。

银杏(ginkgobilobal.)是我国重要的药用树种，每年可以产出数以万吨的银杏叶，银杏叶提取物(egb)被广泛用于治疗心脑血管疾病的药品的研制。egb主要成分包括黄酮类化合物(槲皮素、山奈酚、异鼠李素)和萜内酯类化合物(银杏内酯a、银杏内酯b、银杏内酯c和白果内酯)。egb生物合成过程受到遗传物质的调控，光照强度、光质、温度、水分、养分等外界环境因子也会对egb的合成与积累产生重要影响。在环境因子对egb产生影响的过程中，植物激素作为重要的胞内信号分子，与转录因子相互作用，从而影响防御基因的表达和促进egb的合成与积累。

银杏细胞的悬浮培养试验结果表明，外源sa直接或间接增加了细胞中白果内酯、银杏内酯a和银杏b的合成，并刺激了这些次生代谢产物释放到培养基中。虽然已有基于细胞系的试验研究，但是体外培养获得egb的方式还未实现产业化。目前egb的主要来源于银杏叶片的加工提取。如何通过合理地施用外源sa来提高银杏叶片egb的产量，已成为叶用银杏产业发展过程中迫切需要解决的关键问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种利用水杨酸诱导植物叶片黄酮类和萜内酯类化合物积累的方法和应用，以研究出一种利用水杨酸诱导植物叶片黄酮类和萜内酯类化合物积累的最佳处理参数，提高银杏叶提取物中有效成分的含量。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种利用水杨酸诱导植物叶片黄酮类和萜内酯类化合物积累的方法，步骤包括：在植物叶片细胞完全成熟时，利用50-100mg/l的水杨酸溶液喷施植物叶片1-2次，每次喷适量以植物叶片全部湿润为标准。

进一步优选地，当喷施次数为1-2次时，水杨酸浓度越高，对植物黄酮的积累效果越好，更进一步地，利用100mg/l的水杨酸溶液喷施植物叶片2次，对植物叶片总黄酮及其组分促进效果最佳。

进一步优选地，利用80mg/l的水杨酸溶液喷施植物叶片1次，对植物叶片萜内酯类化合物的合成与积累效果最佳。

进一步优选地，所述水杨酸溶液的配置方法，包括：先用无水乙醇溶液溶解固体水杨酸，然后加入吐温，最后用蒸馏水稀释，其中，乙醇的终体积分数为2-5％，吐温的终体积分数为0.02-0.05％。

进一步优选地，所述植物叶片为银杏叶片。

本发明还提供了上述利用水杨酸诱导植物叶片黄酮类和萜内酯类化合物积累的方法在制备银杏叶提取物中的应用，具体为，根据上述方法，利用水杨酸处理银杏叶片，再通过常规方法提取制备银杏叶提取物。

本发明的原理为：水杨酸主要通过影响植物黄酮合成上游c4h酶、4cl酶活性，来调节植物黄酮的合成与积累；通过影响植物萜内酯合成上游hmgr酶活性，来调节植物萜内酯的合成与积累。本发明首次探讨了水杨酸处理次数对黄酮类和萜内酯类化合物合成与积累的影响，发现1-2次的喷施次数对两种化合物都有促进左右，喷施次数的增加(3-4次)对两类化合物的合成与积累有抑制作用。最后，结合对水杨酸浓度的调节，获得了一种最佳处理参数，可最大程度提高黄酮类和萜内酯类化合物在植物叶片中积累的含量。

本发明相比现有技术具有以下优点：本发明提供了一种利用水杨酸诱导植物叶片黄酮类和萜内酯类化合物积累的方法，该方法简单易行、成本低、无污染、稳定高效，采用本发明方法调控后获得的黄酮类和萜内酯类化合物含量高，其中槲皮素、山奈酚、异鼠李素、总黄酮、银杏萜内酯a、银杏萜内酯b和总萜内酯含量与对照相比分别提高了23.37％、19.96％、22.18％、18.90％、9.34％、25.56％、11.24％。

附图说明

图1为黄酮标准品溶液的高效液相色谱图；

图2为银杏叶样品中黄酮类物质的液相色谱图；

图3为水杨酸对槲皮素含量的影响结果柱状图；

图4为水杨酸对山萘酚含量的影响结果柱状图；

图5为水杨酸对异鼠李素含量的影响结果柱状图；

图6为水杨酸对总黄酮含量的影响结果柱状图

图7为萜内酯标准品高效液相色谱图；

图8为银杏叶样品中萜内酯高效液相色谱图；

图9为水杨酸对银杏内酯c含量的影响结果柱状图；

图10为水杨酸对白果内酯含量的影响结果柱状图；

图11为水杨酸对银杏内酯a含量的影响结果柱状图；

图12为水杨酸对银杏内酯b含量的影响结果柱状图；

图13为水杨酸对总萜内酯含量的影响结果柱状图。

具体实施方式

1、材料

本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。

2、方法

2.1配置水杨酸溶液

先用无水乙醇溶解固体水杨酸后，加入tween20，再用蒸馏水稀释，其中乙醇的终体积分数为2-5％，tween20的终体积分数为0.02-0.05％。

按照上述方法配置0-100mg·l^-1不同浓度梯度的水杨酸溶液进行后续试验，获得0mg/l(ck)、50mg/l(sa1)、80mg/l(sa2)、100mg/l(sa3)四种浓度梯度的水杨酸溶液。

2.2试验处理

选用江苏省泰兴市10年生大佛指嫁接银杏树为供试材料，试验采用完全随机试验设计，用质量浓度分别为0、50、80、100mg·l^-1的水杨酸溶液分别喷施在银杏叶片上，直至整株叶片全部湿润(每个处理喷施量为1000-1200ml)。每个处理3株，每个处理重复3次。于2016年7月19日开始第一次喷施各浓度梯度的水杨酸，然后隔7天进行第一次采样，采完后再次喷施水杨酸溶液，7天后进行第二次采样，一共喷施四次，采四次样。每次采样时间固定在下午4点钟，分别在固定方向位置取各处理成熟叶片装入冰盒，带回后置于超低温冰箱保存。

2.3不同处理次数和浓度下的水杨酸溶液对银杏黄酮合成上游酶活性的影响

2.3.1银杏黄酮合成上游酶活性的测定

2.3.1.1银杏黄酮合成上游pal酶活性的测定

称取剪碎的银杏叶样1g，加0.2mol·l^-1,ph8.8硼酸缓冲液3ml和0.1gpvp，冰浴下研磨，匀浆于4℃下10000r/min下离心15min，取上清液加入2ml硼酸缓冲液、0.02mol·l^-1的l-苯丙氨酸1ml,在30℃水浴锅温育30分钟，然后在290nm处测定od值。以吸光度变化0.1od为一个酶活单位u。

2.3.1.2银杏黄酮合成上游c4h酶活性的测定

称取剪碎的银杏叶样0.2g，加入0.1mol·l^-1ph7.6的磷酸缓冲液5ml(含0.25mol·l^-1蔗糖、0.5mmol·l^-1edta、2mmol·l^-1巯基乙醇)冰浴下研磨，匀浆液于4℃下12000r/min离心30分钟，吸取上清酶液0.2ml，加入0.1mol·l^-1磷酸缓冲液(ph7.6)3ml、50mmol·l^-1肉桂酸0.2ml、4.0mg/10mlnadph3ml，置于30℃水浴锅温育30min，最后用6mol·l^-1的盐酸0.2ml终止反应体系，用naoh溶液调ph到11，在340nm下测定od值，以吸光度变化0.01od为一个酶活单位u。

2.3.1.3银杏黄酮合成上游4cl酶活性的测定

称取剪碎的银杏叶样0.5g，加入0.2mol·l^-1ph8.0的tris-hcl缓冲液5ml(含15mmol·l^-1的巯基乙醇及10％的甘油)冰浴下研磨，匀浆液于4℃10000r/min离心20分钟，吸取上清酶液150ul，加入0.1mol·l^-1ph8.0的tris-hcl缓冲液3ml(含0.2mmol·l^-1对香豆酸，5mmol·l^-1atp，0.3mmol·l^-1coa，5mmol·l^-1mgso4·7h2o)，置于40℃水浴锅温育10min，最后用6mol·l^-1的盐酸0.5ml终止反应体系，在333nm处测定od值，以吸光度变化0.01od为一个酶活性单位u。

采用spss24.0和excel2016统计分析软件对试验数据进行处理和方差分析，运用duncan法进行多重比较。

2.3.2结果及分析

2.3.2.1水杨酸对银杏黄酮合成上游pal酶活性的影响

测定结果如下表1所示：

表1：水杨酸对银杏叶片pal活性的影响

由表1可知，sa喷施一次和两次时，各浓度处理下的pal活性均高于对照，喷施两次时，各浓度处理与对照pal活性相比分别提高了12.50％、16.98％、9.84％，方差分析及多重比较表明，sa1、sa2、sa3浓度处理与对照pal活性差异达显著水平(f＝10.822,p<0.05)。喷施三次和四次时，各浓度处理下的pal活性均低于对照，方差分析及多重比较表明，sa1、sa2、sa3浓度处理均与对照pal活性差异不显著(p>0.05)。说明喷施次数为1-2次时，水杨酸促进pal酶活性增强，随着喷施次数的增加，水杨酸抑制pal酶活性。

2.3.2.2水杨酸对银杏黄酮合成上游c4h酶活性的影响

测定结果如下表2所示：

表2：水杨酸对银杏叶片c4h活性的影响

由表2可知，总体上，各喷施次数，sa喷施浓度越高，c4h酶活性越低(喷施一次，sa1处理除外)。喷施一次时，各浓度处理与对照c4h酶活性相比分别提高了15.05％、21.00％、5.62％，方差分析及多重比较表明，sa1、sa2、sa3浓度处理与对照及sa处理间c4h活性差异达显著水平(f＝35.87,p<0.05)。喷施两次时，sa1浓度处理c4h酶活性显著高于对照和sa2、sa3浓度处理(p<0.05)。喷施三次、四次时，sa1浓度处理c4h酶活性均高于对照，但与对照差异都不显著(p>0.05)，其他浓度处理c4h酶活性均低于对照。

2.3.2.3水杨酸对银杏黄酮合成上游4cl酶活性的影响

测定结果如下表3所示：

表3：水杨酸对银杏叶片4cl活性的影响

由表3可知，喷施一次和两次时，sa各浓度处理4cl酶活性均高于对照，水杨酸喷施浓度越高，4cl酶活性越高，喷施三次和四次时，sa各浓度处理4cl酶活性均低于对照，水杨酸喷施浓度越高，4cl酶活性越低。喷施一次时，sa3浓度处理4cl酶活性显著高于对照(p<0.05)。喷施两次时，各浓度处理与对照4cl活性相比分别提高了5.51％、9.04％、8.98％，方差分析及多重比较表明，sa1、sa2、sa3浓度处理与对照4cl酶活性差异达显著水平(f＝9.93,p<0.05)。喷施三次和四次时，sa2、sa3浓度处理4cl酶活性显著低于对照(p<0.05)。

2.3.3结论

pal酶和c4h酶是调控代谢产物流向苯丙烷代谢途径所有分支的关键酶。本试验结果表明：水杨酸喷施银杏叶片时，喷施次数为一次和两次时，水杨酸促进pal酶活性的增强，喷施浓度越高，pal酶活性越高，随着喷施次数的增加，水杨酸各喷施浓度抑制pal酶活性，即前期促进、后期抑制；水杨酸喷施银杏叶片时，喷施浓度越高，c4h酶活性越低。相关性分析表明，水杨酸喷施银杏叶片时，黄酮类化合物的生物合成机制有时不依赖于pal活性，pal酶活性与总黄酮含量没有显著相关性，c4h酶活性与总黄酮及其组分呈极显著正相关。

4cl酶是苯丙烷代谢途径控制进入黄酮、木质素等下游分支的关键酶。本试验结果表明，水杨酸喷施银杏叶时，4cl活性与总黄酮含量同步增减。相关性分析表明，水杨酸喷施银杏叶片时，4cl酶活性与总黄酮含量呈显著正相关(r＝0.599)。

综上，水杨酸可能主要通过调控c4h酶和4cl酶活性，使苯丙烷代谢途径进入类黄酮等分支，从而促进银杏黄酮的合成与积累。

2.4不同处理次数和浓度下的水杨酸溶液对银杏萜内酯上游hmgr酶活性的影响

2.4.1mva途径hmgr酶的提取及酶活力测定

称取银杏叶片0.5g，迅速用蒸馏水洗净表面杂质，吸水纸吸干水分。匀浆液选取pbs(ph7.2-7.4，浓度为0.01mol·l^-1)冰浴条件下匀浆(或者进行液氮碾磨)匀浆的比例选取10％，相当于1g组织加9ml的匀浆液来进行匀浆，离心取上清，离心转速选用5000r/min，时间是15分钟，吸取上清液待检。

活性检测采用植物羟甲基戊二酸单酰辅酶a还原酶(hmgr)elisa检测试剂盒进行检测。

采用spss24.0和excel2016统计分析软件对试验数据进行处理和方差分析，运用duncan法进行多重比较。

2.4.2结果及分析

测定结果如下表4所示：

表4：水杨酸对银杏叶中hmgr活性的影响

由表4可知，sa喷施次数对hmgr酶活性影响不大，各喷施次数，各浓度处理下的hmgr酶活性都低于对照。喷施一次、四次时，sa2浓度处理的hmgr酶活性高于其他浓度处理。喷施两次时，各浓度处理与对照hmgr酶活性相比分别下降了13.87％、12.17％、10.62％，方差分析及多重比较表明，sa1、sa2、sa3浓度处理与对照hmgr酶活性差异达显著水平(f＝14.355,p<0.05)。喷施三次时，各浓度处理与对照hmgr酶活性相比分别下降了23.75％、8.87％、3.89％，方差分析及多重比较表明，sa1、sa2、sa3浓度处理与对照、sa2、sa3浓度处理与sa1浓度处理hmgr酶活性差异达显著水平(f＝39.093,p<0.05)。

2.4.3结论

hmgr酶是萜类化合物合成甲羟戊酸途径(mva)中第一个关键酶，连同nadph催化3-羟基-3-甲基戊二酰coa生成甲羟戊酸，这是萜类合成途径中一个重要的调节点。本试验结果显示，总体上，水杨酸均抑制hmgr酶活性。但高浓度的水杨酸可以提高hmgr基因的表达，促进hmgr酶活性，从而调节植物萜内酯的合成与积累。

2.5不同处理次数和浓度下的水杨酸溶液对银杏黄酮类化合物含量的影响

目前，已从银杏叶片中分离鉴定出多种黄酮类化合物，其中单黄酮类就有32种，双黄酮类有6种，儿茶素类有6种，其他黄酮类化合物有2种(原花青素和原翠雀素)，总计40余种。其中单黄酮类苷元(图2-1)主要为槲皮素(quercetin)、山柰黄素(keampferol)和异鼠李素(isorhamnetin)3种，银杏所含的黄酮苷主要是由单、双和三糖苷及其香豆素酰基糖苷三种苷元化合而成，糖元主要有葡萄糖和鼠李糖。这三种也是银杏叶及其提取物的主要活性成分，其含量是质量控制检测的主要指标。

2.5.1黄酮类物质含量的测定

各处理的叶片用信封分别装好，杀青后置于60℃烘箱烘至恒质量，粉碎机粉碎后过40目筛，干燥保存。参考《中华人民共和国药典》中银杏叶黄酮的提取和测定的方法(hplc)进行测定。

精确称量银杏粉末1g，用9mm定圈滤纸包好，置于索氏提取器中，加石油醚回流2小时除杂，再加甲醇回流4小时提取，保留提取液用旋转蒸发仪蒸干，甲醇-25％盐酸(4：1)混合液25ml分次洗脱旋蒸烧瓶内壁残留，收集洗脱液继续用索氏提取器加热回流30分钟，冷却后转移至50ml容量瓶中，用色谱纯甲醇定容，液相色谱条件：以甲醇-0.4％磷酸溶液(56:44)为流动相，检测波长为360nm。

总黄酮醇苷的含量＝(槲皮素含量+山柰酚含量+异鼠李素含量)×2.51

采用spss24.0和excel2016统计分析软件对试验数据进行处理和方差分析，运用duncan法进行多重比较。

2.5.2结果与分析

以黄酮苷元(槲皮素、山奈酚、异鼠李素)对照品浓度x(mg.l^-1)为横坐标，峰面积为y为纵坐标，绘制标准曲线，得到如下线性回归方程：

表5：银杏黄酮标准品的线性回归方程

黄酮标准品溶液的高效液相色谱图和银杏叶样品中黄酮类物质的液相色谱图如图1、2所示。水杨酸对银杏黄酮类物质含量的影响如图3-6所示。

如图3所示，sa喷施一次和两次时，各浓度处理下的槲皮素含量均高于对照(喷施两次，sa1处理除外)，喷施两次时，sa2、sa3浓度处理与对照槲皮素含量相比分别提高了20.14％、23.37％，方差分析及多重比较表明，sa2、sa3浓度处理与对照槲皮素含量差异达显著水平(f＝9.28,p<0.05)。喷施三次和四次时，各浓度处理下的槲皮素含量均低于对照(喷施三次，sa1处理除外)，各浓度处理槲皮素含量与对照差异均不显著(p>0.05)。

如图4所示，sa喷施一次时，喷施浓度越高，山奈酚含量越高，各浓度处理与对照山奈酚含量差异不显著(p>0.05)。喷施两次时，各浓度处理与对照山奈酚含量相比分别提高了19.96％、6.89％、8.49％，方差分析及多重比较表明，sa1浓度处理与对照和sa2、sa3浓度处理山奈酚含量差异达显著水平(f＝7.906,p<0.05)。喷施三次和四次时，各浓度处理山奈酚含量均低于对照，喷施三次时，各浓度处理与对照山奈酚含量相比分别降低了15.06％、20.79％、19.62％，方差分析及多重比较表明，sa1、sa2、sa3浓度处理与对照山奈酚含量差异达显著水平(f＝13.128,p<0.05)。

如图5所示，sa喷施一次和两次时，各浓度处理下的异鼠李素含量均高于对照，喷施一次时，各浓度处理与对照异鼠李素含量相比分别提高了9.33％、7.29％、13.19％，方差分析及多重比较表明，sa1、sa2、sa3浓度处理与对照异鼠李素含量差异达显著水平(f＝10.362,p<0.05)。喷施两次时，各浓度处理与对照异鼠李素含量相比分别提高了13.60％、10.96％、22.18％，方差分析及多重比较表明，sa1、sa2、sa3浓度处理与对照异鼠李素含量差异达显著水平(f＝7.789,p<0.05)。喷施三次和四次时，各浓度处理与对照异鼠李素含量差异不显著(p>0.05)。

如图6所示，sa喷施一次和两次时，各浓度处理下的总黄酮都高于对照，喷施浓度越高，总黄酮含量越高。喷施一次时，各浓度处理与对照总黄酮相比分别提高了1.69％、7.92％、12.01％,方差分析及多重比较表明，sa2、sa3浓度处理与对照总黄酮含量差异达显著水平(f＝6.995,p<0.05)。喷施两次时，各浓度处理与对照总黄酮相比分别提高了7.92％、14.11％、18.90％，方差分析及多重比较表明，sa2、sa3浓度处理与对照总黄酮含量差异达显著水平(f＝8.129,p<0.05)。喷施三次和四次时，各浓度处理下的总黄酮含量均低于对照，各浓度处理与对照及各浓度处理间总黄酮含量差异不显著(p>0.05)。

2.5.3结论

本试验结果表明，水杨酸喷施银杏叶片时，喷施次数为一次和两次时，促进银杏总黄酮、槲皮素、异鼠李素的合成，浓度越高促进效果越明显；随着喷施次数的增加，水杨酸对银杏总黄酮、槲皮素、山奈酚、异鼠李素表现为抑制，浓度越高，抑制效果越明显。总体上，喷施一次和两次，100mg·l-1的水杨酸对银杏叶黄酮的合成促进效果较好。

2.6不同处理次数和浓度下的水杨酸溶液对银杏萜内酯类化合物含量的影响

目前，以从银杏叶中鉴定分离出8种萜内酯化合物，分为银杏内酯(ginkgolides)与白果内酯(bilobalide)。银杏内酯属于二萜内酯，其化学结构由一个叔丁基和6个五元环组成，其中三个是五元内酯环，两个是五元碳环，一个是四氢呋喃环，按照官能团不同可将银杏内酯分为ga、gb、gc、gj、gm、gk、gl7种。白果内酯属于倍半萜内酯(bb)，它是在银杏叶片中唯一发现的倍半萜内酯化合物，其化学结构类似于银杏内酯，含有三个五元内酯环和一个五元碳环。

2.6.1萜内酯类化合物含量的测定

各处理的叶片用信封分别装好，杀青后置于60℃烘箱烘至恒质量，粉碎机粉碎后过40目筛，干燥保存。参考《中华人民共和国药典》中银杏叶黄酮的提取和测定的方法(hplc)进行测定。

精确称量银杏粉末约1g，用9mm定圈滤纸包好，置于索氏提取器中，加石油醚回流1小时除杂，再加甲醇回流6小时提取，保留提取液用旋转蒸发仪蒸干，用甲醇分次洗脱旋蒸烧瓶内壁残留转移至10ml容量瓶中，超声处理30分钟，冷却，用甲醇定容，然后吸取5ml上清液，过酸性氧化铝柱，使用25ml甲醇洗脱，收集洗脱液，再次蒸干，用5ml甲醇分次洗脱旋蒸烧瓶内壁残留转移至10ml容量瓶中，加水约4.5ml，超声处理30分钟，冷却，用色谱纯甲醇定容。液相色谱条件：以甲醇-四氢呋喃-水(25:10:65)为流动相；蒸发光散射检测器检测。

总萜内酯含量＝银杏内酯c+白果内酯+银杏内酯a+银杏内酯b。

采用spss24.0和excel2016统计分析软件对试验数据进行处理和方差分析，运用duncan法进行多重比较。

2.6.2结果与分析

以萜内酯(银杏内酯c、白果内酯、银杏内酯a、银杏内酯b)标准品浓度的自然对数x为横坐标，峰面积的自然对数y为纵坐标，绘制标准曲线，得到如下线性回归方程：

表6银杏萜内类酯标准品的线性回归方程

萜内类酯标准品溶液的高效液相色谱图和银杏叶样品中萜内酯类物质的液相色谱图如图7、8所示。水杨酸对银杏萜内酯类物质含量的影响如图9-13所示。

如图9所示，总体上，sa喷施次数对银杏内酯c含量影响较小，各浓度处理下的银杏内酯c含量均低于对照(喷施四次，sa3处理除外)，喷施浓度越高，银杏内酯c含量越高，喷施一次、两次、三次时，各浓度处理的银杏内酯c含量均显著低于对照(p<0.05)。喷施两次时，各浓度处理与对照银杏内酯c含量相比分别降低了41.96％、45.57％、23.11％，方差分析及多重比较表明，sa1、sa2、sa3浓度处理与对照、sa3浓度处理与sa1、sa2浓度处理银杏内酯c含量差异达显著水平(f＝31.324,p<0.05)。喷施四次时，各浓度处理与对照银杏内酯c含量差异不显著(p>0.05)。

如图10所示，总体上，sa喷施次数对白果内酯含量影响较小，各喷施次数、各浓度处理下的白果内酯含量均低于对照。喷施一次时，喷施浓度越高，白果内酯含量越低。喷施两次、三次和四次时，喷施浓度越高，白果内酯含量越高(喷施四次，sa3处理除外)，喷施两次和三次时，sa1、sa2、sa3浓度处理白果内酯含量均显著低于对照(p<0.05)。

如图11所示，sa喷施一次时，sa2浓度处理下的银杏内酯a含量显著高于对照和mj1、mj3浓度处理(p<0.05)。喷施两次、三次、四次时，喷施浓度越高，银杏内酯a含量越低。喷施两次和三次时，sa1浓度处理的银杏内酯a含量高于对照，sa2、sa3浓度处理的银杏内酯a含量低于对照。喷施四次时，sa1、sa2、sa3浓度处理银杏内酯a含量均显著低于对照(p<0.05)。

如图12所示，sa喷施一次和两次时，各浓度处理下银杏内酯b含量均高于对照，喷施一次时，sa2浓度处理银杏内酯b含量显著高于对照和sa1、sa3浓度处理(p<0.05)。喷施两次时，各浓度处理与对照银杏内酯b含量相比分别提高了19.37％、49.86％、25.90％，方差分析及多重比较表明，sa1、sa2、sa3浓度处理与对照及sa处理间银杏内酯b含量差异达显著水平。sa喷施三次和四次时，各浓度处理下银杏内酯b含量均低于对照，sa3浓度处理银杏内酯b含量显著低于对照和sa1、sa2浓度处理(p<0.05)。

如图13所示，总体上，各喷施次数，各喷施浓度的水杨酸均抑制银杏总贴内酯含量。喷施一次时，sa2浓度处理的总萜内酯含量显著高于对照和sa1、sa3浓度处理(p<0.05)，sa1、sa3浓度处理的总萜内酯含量低于对照。喷施两次时，sa2浓度处理的总萜内酯含量高于对照，sa1、sa3浓度处理的总萜内酯含量低于对照。喷施三次和四次时，各浓度处理总萜内酯含量均显著低于对照(p<0.05)。

2.6.3结论

本试验结果表明，水杨酸喷施银杏叶片时，喷施一次时，80mg·l^-1的水杨酸对银杏内酯a、银杏内酯b、总萜内酯含量有显著的促进作用。随着喷施次数的增加，水杨酸对总萜内酯及其组分均表现为抑制。

综上所述，水杨酸通过激发苯丙烷途径关键酶c4h酶活性和4cl酶活性参与调节银杏黄酮的合成与积累，通过抑制甲羟戊酸途径hmgr酶活性参与调控银杏萜内酯的合成与积累。本试验中首次验证了喷洒次数对调节银杏黄酮和萜内酯合成与积累效果的影响，再通过调节水杨酸浓度，最终获得能够提高目标产物合成与积累的最佳参数。本发明也启示我们可以使用某些抑制剂来降低黄酮和萜内酯合成路径中其他分支的代谢来促进黄酮和萜内酯的合成。

以上为本发明一种详细的实施方式和具体的操作过程，是以本发明技术方案为前提下进行实施，但本发明的保护范围不限于上述的实施例。