一种利用β-罗勒烯提高黄花蒿中青蒿素产量的方法与流程

本发明属于青蒿素生产和提取技术领域，尤其涉及一种利用β-罗勒烯提高黄花蒿中青蒿素产量的方法。

背景技术：

青蒿素是从黄花蒿(artemisiaannual.)中提取的一种有过氧基团的倍半萜内酯药物，是已知的最好的治疗疟疾的药物，自2002年世界卫生组织(wto)推荐青蒿素治疗疟疾以来，以青蒿素为基础的联合疗法(act)已成为80多个流行国家恶性疟原虫感染疟疾的一线治疗方法(who(2015)changesinmalariaincidenceandmortality.in:whoglobalmalariarogramme-worldmalariareport2015:worldhealthorganization；who(2017)changesinmalariaincidenceandmortality.in:whoglobalmalariarogramme-worldmalariareport2017:worldhealthorganization.)。自20世纪70年代发现青蒿素以来，青蒿素在疟疾高危地区拯救了超过10亿人的生命(who(2017)changesinmalariaincidenceandmortality.in:whoglobalmalariarogramme-worldmalariareport2017:worldhealthorganization.)。但是，全球青蒿素的产量还是不能完全满足防治疟疾的需求，主要有两个原因：一是黄花蒿的青蒿素含量低，大约为0-0.8％干重(xie,d.-y.,ma,d.-m.,judd,r.,andjones,a.l.(2016).artemisininbiosynthesisinartemisiaannuaandmetabolicengineering:questions,challenges,andperspectives.phytochemistryrev15:1093-1114.)；二是黄花蒿是一种大田作物，一年收获一次，易受到不利天气因素、病虫害等的影响，产量波动很大。正是青蒿素的来源有限和生产的不稳定性，使得每年青蒿素的产量不能完全满足进行联合治疗所需求的量，这个缺口成为了每年导致约45万人死亡的主要和直接的原因之一。目前，生产上黄花蒿的平均含量在0.8％(干重)左右(xie,d.-y.,ma,d.-m.,judd,r.,andjones,a.l.(2016).artemisininbiosynthesisinartemisiaannuaandmetabolicengineering:questions,challenges,andperspectives.phytochemistryrev15:1093-1114.)，因为在大田生产生产条件下，除开品种本身，还受到气候、土壤、病虫害和人为因素的不利影响，加之疟疾发病区域主要在东南亚与非洲这些经济不发达地区，联合国每年需要大量采购低成本低价格的青蒿素，但是实际需求完全不能得到满足。为了解决这一问题，在过去的几十年里，人们投入了大量人力物力来试图解决这个问题，比如通过育种手段来选育青蒿素高含的材料(grahamia,besserk,blumers,braniganca,czechowskit,eliasl,gutermani,harveyd,isaacpg,khanam.(2010)thegeneticmapofartemisiaannual.identifieslociaffectingyieldoftheantimalarialdrugartemisinin.science327:328–331)；利用代谢工程的方法，让烟草与酵母来产生青蒿素或其衍生物(turconi,j.,griolet,f.,guevel,r.,oddon,g.,villa,r.,geatti,a.,hvala,m.,rossen,k.,goller,r.,andburgard,a.(2014).semisyntheticartemisinin,thechemicalpathtoindustrialproduction.orgprocessresdev,18:417-422；shenq.,zhangl.,liaoz.,wangs.,yant.,ship.,lium.,fux.,panq.,wangy.,lvz.,lux.,zhangf.,jiangw.,may.,chenm.,haox.,lil.,tangy.,lvg.,zhouy.,sunx.,brodeliusp.e.,rosej.k.c.,andtangk.(2018).thegenomeofartemisiaannuaprovidesinsightintotheevolutionofasteraceaefamilyandartemisininbiosynthesis.mol.plant.11,776–788.)；比尔梅琳达盖茨基金会于2017年底再次支持50吨规模的前体物质转化为青蒿素的化学方法，但是，这些方法因为各自存在的技术局限，到目前还没能解决低价青蒿素短缺的现实。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种利用β-罗勒烯提高黄花蒿中青蒿素产量的方法，所述方法操作简单，能够显著增加黄花蒿中青蒿素的含量，并且生产周期短。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

一种利用β-罗勒烯提高黄花蒿中青蒿素产量的方法，用β-罗勒烯处理黄花蒿植株1～3d。

优选的，所述黄花蒿植株为从播种开始计算，生长21d以上的黄花蒿植株。

优选的，所述黄花蒿植株为从播种开始计算，生长21d的黄花蒿植株。

优选的，所述处理为将所述黄花蒿植株置于挥发有β-罗勒烯的密闭空间。

优选的，所述β-罗勒烯在密闭空间中的浓度为1～30μmol/l。

优选的，所述β-罗勒烯在密闭空间中的浓度为5～20μmol/l。

优选的，所述β-罗勒烯的挥发通过将所述β-罗勒烯滴加至35～45℃预热后的载玻片上实现。

优选的，所述β-罗勒烯处理黄花蒿植株的时间为1.5～2.5d。

本发明的有益效果：本发明提供的利用β-罗勒烯提高黄花蒿中青蒿素产量的方法，用β-罗勒烯处理黄花蒿植株1～3d；方法非常简单，能够实现工业化的操作，同时所述方法能够显著增加黄花蒿植株中青蒿素的含量，所述黄花蒿植株中青蒿素的含量可达2.5％(干重)，而常规的利用黄花蒿生产青蒿素的方法，黄花蒿植株中青蒿素的平均含量在0.8％(干重)左右，本发明所述方法与常规方法相比青蒿素的含量提高了3倍多，本发明所述方法有利于大幅度提高青蒿素的产量。

进一步的，常规的方法是培养黄花蒿植株生长6个多月后收获原料，用于提取青蒿素；而本发明所述方法对生长18～24d的黄花蒿植株进行处理1～3d后，即可显著提高黄花蒿中青蒿素的含量，收获黄花蒿植株用于青蒿素的提取；青蒿素生产的整个周期在19～27d之间，生产周期明显缩短；可以实现一年以内多次收获。

附图说明

图1为不同β-罗勒烯处理浓度下黄花蒿植株内青蒿素的含量；

图2为不同β-罗勒烯处理时间下黄花蒿植株中青蒿素的含量。

具体实施方式

本发明提供了一种利用β-罗勒烯提高黄花蒿中青蒿素产量的方法，用β-罗勒烯处理黄花蒿植株1～3d。

在本发明中，所述黄花蒿植株优选从播种开始计算，生长21d以上的黄花蒿植株，更优选为从播种开始计算，生长21d的黄花蒿植株。在本发明中，所述黄花蒿植株的株龄综合考虑密闭空间的大小，产量以及收获周期。本发明优选选择生长21d的黄花蒿植株，生长时间短，有利于一年内多次收获。在本发明中，所述黄花蒿植株优选的通过将黄花蒿种子消毒后进行播种、培养获得。在本发明中，所述消毒用的消毒剂优选为体积分数为70％的乙醇水溶液；所述消毒的时间优选为8～12min，更优选为10min。本发明在所述消毒后优选为还包括用清水冲洗消毒后的黄花蒿种子，所述冲洗的次数优选为3～5次，更优选为4次。在本发明中，所述播种优选的为将所述消毒后的黄花蒿种子播种到带营养土的营养钵中。在本发明中，所述培养的温度优选为24～26℃，更优选为25℃；所述培养的光照时间优选为16h光照/8h黑暗；所述光照优选的由三雄极光的t5高效节能荧光灯提供，所述光照的强度优选为180μmol光量子m^-2s^-1。

在本发明中，所述用β-罗勒烯处理黄花蒿植株优选的为将所述黄花蒿植株置于挥发有β-罗勒烯的密闭空间。在本发明中，所述β-罗勒烯在密闭空间中的浓度优选的为1～30μmol/l，更优选的为5～20μmol/l，最优选为10μmol/l。本发明对所述密闭空间的大小和种类没有特殊要求，只要能够实现密闭即可；所述密闭空间包括但不限于小型密闭容器、温室大棚。当所述密闭空间优选为温室大棚时，所述黄花蒿植株优选为从播种开始计算，生长35d的黄花蒿植株。在本发明具体实施过程中，所述密闭空间优选的由透明、密闭的干燥器提供；所述干燥器的体积优选的为8～12l，更优选为10l。在本发明中，所述β-罗勒烯的挥发通过将所述β-罗勒烯滴加至35～45℃预热后的载玻片上实现，所述载玻片更优选为40℃预热后的载玻片。在本发明中，每一个干燥器中优选的移入一株黄花蒿植株；所述移入优选为将种植在营养钵中的黄花蒿植株带营养钵移入。在本发明具体实施过程中，在移入黄花蒿植株的同时，将预热后的载玻片置于干燥器中，并在所述载玻片上滴加β-罗勒烯；本发明在完成上述操作后优选的迅速密封干燥器。

在本发明中，所述β-罗勒烯处理黄花蒿植株的时间为1～3d，优选为1.5～2.5d。本发明在所述β-罗勒烯处理结束后，优选的将黄花蒿植株从干燥器中移出，取黄花蒿植株的地上部分，在45℃条件下，干燥2d，研磨成粉末，用于青蒿素的提取。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

β-罗勒烯购自sigma-aldrich公司，货号w353901。

黄花蒿种子用70％的乙醇(v/v)进行表面消毒10min后，用清水冲洗3～5次，消毒后的种子播种到带营养土的钵子中，在16h光照/8h黑暗，温度25±1℃的温室中生长3周。将生长3周的黄花蒿植株一营养钵一起转入到一个透明的可密闭的10l的干燥器中，每个容器中转入1株植株，同时放入一块40℃预热过的载玻片，将挥发性的分析纯β-罗勒烯加到载玻片上，迅速密封，以没有加β-罗勒烯的密闭容器中的黄花蒿植株为对照。

β-罗勒烯挥发后，使容器空气中β-罗勒烯的最终浓度分别为0、1、5、10、15、20μmol/l，各浓度的处理时间为24h，之后从密闭容器中将苗移出，取黄花蒿的地上部分，在45℃条件下，干燥2d，研磨成粉末，用于下一步的青蒿素的提取。

取干燥的粉末0.1g倒入离心管中，加入2ml甲醇混匀，在超声仪上超声30min，将抽提液转入5ml离心管中，再用甲醇重复抽提一次，将抽提液与之前的抽提液合并；在1669×g相对离心力条件下离心10min，去除抽提液中的悬浮颗粒，最后离心后上清液用0.22μm孔径的过滤器过滤，过滤液用于青蒿素含量的测定；干燥过滤液获得青蒿素产品。

青蒿素含量的测定

hplc-dad分离检测系统为agilentinfinity1260(dikma的diomosilc18柱,5μm,250mm,4.5mm)；流动相为甲醇/水6﹕4；流速1ml/min。上样量为10μl，保留时间为8.3±0.03min；吸收峰为230nm。采用青蒿素标样(购自sigma-aldrich公司)绘制标准曲线，浓度梯度为0.3125、0.625、1.25、2.5、5μg/10μl，根据对标样不同浓度吸光值检测结果，获得直线回归方程y＝0.0056x-3.0408，相关系数为r²＝0.9909计算；其中x为峰面积，y为每10μl检测样品中青蒿素的含量(μg)。采用相同的参数对各种样品中的青蒿素的吸光值进行测定，利用上述直线回归方程计算各样品中青蒿素含量。结果如图1所示和表1所示，随着β-罗勒烯浓度升高，被处理的3周植株中的青蒿素含量先升高，后下降，在β-罗勒烯浓度达到10μmol/l时，植株体内青蒿素的含量达到最高水平。

表1不同浓度β-罗勒烯处理后植株青蒿素的含量

实施例2

β-罗勒烯购自sigma-aldrich公司，货号w353901。

黄花蒿种子用70％的乙醇(v/v)进行表面消毒10min后，用清水冲洗3～5次，消毒后的种子播种到带营养土的钵子中，在16h光照/8h黑暗，温度25±1℃的温室中生长3周。将生长3周的黄花蒿植株一营养钵一起转入到一个透明的可密闭的10l的干燥器中，每个容器中转入1株植株，同时放入一块40℃预热过的载玻片，将挥发性的分析纯β-罗勒烯加到载玻片上，迅速密封，以没有加β-罗勒烯的密闭容器中的黄花蒿植株为对照。

β-罗勒烯挥发后，使容器空气中β-罗勒烯的最终浓度为10μmol/l，处理不同时间，之后从密闭容器中将苗移出，取黄花蒿的地上部分，在45℃条件下，干燥2d，研磨成粉末，用于下一步的青蒿素的提取。

取干燥的粉末0.1g倒入离心管中，加入2ml甲醇混匀，在超声仪上超声30min，将抽提液转入5ml离心管中，再用甲醇重复抽提一次，将抽提液与之前的抽提液合并；在1669×g相对离心力条件下离心10min，去除抽提液中的悬浮颗粒，最后离心后上清液用0.22μm孔径的过滤器过滤，过滤液用于青蒿素含量的测定；干燥过滤液获得青蒿素产品。

青蒿素含量的测定

hplc-dad分离检测系统为agilentinfinity1260(dikma的diomosilc18柱,5μm,250mm,4.5mm)；流动相为甲醇/水6﹕4；流速1ml/min。上样量为10μl，保留时间为8.3±0.03min；吸收峰为230nm。采用青蒿素标样(购自sigma-aldrich公司)绘制标准曲线，浓度梯度为0.3125、0.625、1.25、2.5、5μg/10μl，根据对标样不同浓度吸光值检测结果，获得直线回归方程y＝0.0056x-3.0408，相关系数为r²＝0.9909计算；其中x为峰面积，y为每10μl检测样品中青蒿素的含量(μg)。采用相同的参数对各种样品中的青蒿素的吸光值进行测定，利用上述直线回归方程计算各样品中青蒿素含量。

β-罗勒烯不同处理时间分别为0、6、12、24、和48h。结果如图2和表2所示，在β-罗勒烯浓度为10μmol/l，不同的处理时间，随着处理时间的增加，被处理的植株中青蒿素含量持续上升，与对照相比含量有及显著性增加。

表2β-罗勒烯不同时间处理后植株青蒿素的含量

由上述实施例可知，本发明提供的方法法操作简单，能够显著增加黄花蒿中青蒿素的含量，并且生产周期短，适于工业化应用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。