一种颗粒物呼吸暴露神经毒性大鼠模型的建立方法与流程

本发明涉及一种颗粒物呼吸暴露神经毒性大鼠模型的建立方法。

背景技术：

帕金森病(parkinson’sdisease，pd)也称震颤麻痹，是中老年人常见的神经退行性疾病，表现为静止性震颤、肌肉僵直、运动迟缓、语言障碍、精神障碍等症状，严重影响人的运动功能，甚至不能自理。其主要病理学特征和生化改变是选择性黑质纹状体多巴胺能神经元进行性丧失及神经元内出现嗜酸性路易氏小体(lewydodies，lb)，导致黑质纹状体多巴胺及其代谢产物含量明显减少，多巴胺的合成酶即酪氨酸羟化酶(tyrosinehydroxylase，th)和多巴胺转运体(dopaminetransporter，dat)减少。至今尚无有效的药物能够阻止神经元的变性，使病情逆转，有效的帕金森病动物模型的建立和应用是解释其发病机制及新药研发的关键。目前，较为公认的建立pd模型的方法主要有3种：(1)6-羟多巴胺模型：应用6-羟多巴胺(6-ohda)注入黑质纹状体系统来损毁大鼠黑质-纹状体系统da能神经元所建立的模型[1]。此模型的产生机制主要是6-ohda在体内通过形成羟自由基和抑制线粒体氧化呼吸链复合物i和iv，干扰atp的合成，选择性的引起da能神经元死亡而产生与pd临床特征相近的症状，其不足之处在于操作复杂且模型动物选择上有一定的局限性，最适合大鼠。因6-ohda不能通过血脑屏障，因此造模时需麻醉、手术将其注入动物脑内，所以此模型不适合体积较小的动物(例如小鼠)。(2)mptp模型：运用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，mptp)制备猴等灵长类动物模型和c57b小鼠pd模型[2，3]。mptp具有高度脂溶性且易透过血脑屏障，所以此模型操作较简单，采用腹腔注射即可。其机制是mptp在脑内与单胺氧化酶b结合，变成活性物质甲基苯基吡啶离子(mpp+)。mpp+被da神经元转运体主动摄取到其线粒体内，从而抑制线粒体复合物i的活性，导致da能神经元变性、凋亡。mptp模型是目前最理想的pd动物模型之一，已被广泛的应用于pd的实验研究中。(3)鱼藤酮(rotenone)模型：鱼藤酮是一种从豆科植物中提取的脂溶性的杀虫剂，可以透过血脑屏障进而造成黑质多巴胺能神经元选择性的死亡[4]。近年来已有多项研究证实鱼藤酮给药后，可以成功制作包括大小鼠在内的不同的pd动物模型[5-6]。由于鱼藤酮毒性较大，所以此模型存在制作复杂，死亡率高的缺点，可通过低剂量长时间皮下注射鱼藤酮，来成功建立pd模型，能较好地模拟pd的慢性进行性病程和发病特点。上述诱导物虽然能较好的模拟pd模型，但是这3种物质并不存在于现实环境中，不属于环境污染物，建模给药途径和人群实际接触方式也存在差异，不能很好的模拟pd的真实发病过程。此外，不同物质引发pd的作用机制不同，至今没有颗粒物pd动物模型的实例。

研究发现，生活在重度污染城市内的犬和居民脑组织内出现神经元、脑血管内皮细胞和胶质细胞损伤，嗅球和海马区域发生了dna损伤，同时观察到血脑屏障发生损伤[7，8]；重度空气污染区内的犬嗅球、皮层和海马区域的炎症因子显著增高，各脑区出现了明显的dna损伤和皮层萎缩等类似阿尔茨海默病(alzheimer’sdisease，ad)的病理表现[9]。2009年在neurotoxicology发表的一篇关于大气污染与脑认知功能流行病学的研究报告中，首次证实了空气污染与成人神经行为改变之间的关系[10]。由此推测，大气颗粒物污染极有可能是促进pd、ad等神经退行性病变发生的关键环境因素之一。随着大气颗粒物污染水平的日益加剧和灰霾、雾霾天气的普遍发生，人群接触颗粒物的机会和程度越来越多，且缺乏有效的防控措施避免吸入环境大气。通常大气颗粒物主要来源于土壤扬尘、地面扬尘、建筑扬尘、煤烟尘、钢铁尘、机动车排放尾气等，si、al、fe、ti、mn、ca、cu、zn、ni、mg等的氧化物是大气环境颗粒物中pm2.5-10的主要组成成分，尤其是影响交通干线大气污染水平的首要因素。现实环境中复杂纳米颗粒的污染早已存在，只是由于缺乏适当的采集和观测手段，限制了对其毒性效应的研究。随着纳米科学与纳米技术的迅猛发展，人们暴露于各种纳米颗粒的机会和程度也日益增加，对于纳米颗粒的认识不断深入。据文献报道，生产过程中的纳米颗粒释放到空气中的浓度可达到0.15gg/m³[11]。可见，纳米颗粒与大气颗粒物污染密切相关。

在颗粒物吸入暴露的神经毒性研究中，吸入给药方法主要采用染毒装置自主吸入、非暴露式气管滴注和鼻腔滴注。自主吸入染毒装置虽然最接近人群的实际暴露情况，但是消耗的染毒物量大，染毒剂量亦具有波动性，难以控制。非暴露式气管滴注具有消耗的染毒物量少，染毒剂量容易控制的优点，但是染毒物主要吸入肺部，需要通过肺-血屏障、血-脑屏障才能转运至脑组织；或者通过肺组织损伤释放自由基、趋化因子等入血，进入循环系统，从而引发中枢神经系统毒性，染毒物不能直接作用于靶点。现有的鼻腔滴注方法，消耗的染毒物量小，染毒剂量容易控制，且染毒物可被鼻腔粘膜摄入，经嗅神经通路转运至脑组织，直接作用于靶点。但是，染毒过程中，染毒物容易吸入气管引发窒息死亡，且仍然有一部分染毒物会吸入到下呼吸道进入肺部，而使得嗅粘膜暴露的剂量少于实际给药量，因个体差异，难以掌控鼻粘膜接触的染毒物量。

[1]cencima，kalénp，mandelrj，wictorink，a.dopaminergictransplantsnormalizeamphetamine-andapomorphine-inducedfosexpressioninthe6-hydroxydopamine-lesionedstriatum[j].neuroscience，1992，46(4)：943-957.

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[3]arain，misugik，goshimay，etal.evaluationofa1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine(mptp)-treatedc57blackmousemodelforparkinsonism[j].brainresearch，1990，515(1/2)：57-63.

[4]nandipatis，litvani.environmentalexposuresandparkinson′sdisease[j].internationaljournalofenvironmentalresearchandpublichealth，2016，13(9)：1123-1130.

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[8]calderón-l，soltac，henríquez-roldánc，torres-jardónr，nuseb，herrittl，villarreal-calderónr，osnayan，stonei，garciar，brooksdm，gonzález-maciela，reynoso-roblesr，delgado-chávezr，reedw.long-termairpollutionexposureisas-sociatedwithneuroinflammation，analteredinnateimmuneresponse，disruptionoftheblood-brainbarrier，ultrafineparticulatedeposition，andaccumulationofamyloidbeta-42andalpha-synucleininchildrenandyoungadults.toxicolpathol，2008，36(2)：289-310.

[9]calderón-l，maronpotrr，torres-jardonr，henríquez-roldánc，schoonhovenr，-ayalah，villarreal-calderóna，nakamuraj，fernandor，reedw，azzarellib，swenbergja.dnadamageinnasalandbraintissuesofcaninesexposedtoairpollutantsisassociatedwithevidenceofchronicbraininflammationandneurodegeneration.toxicolpathol，2003，31(5)：524-538.

[10]chenjc，schwartzj.neurobehavioraleffectsofambientairpollutiononcognitiveperformanceinusadults.neurotoxicology，2009，30(2)：231-239.

[11]balbusjm，maynardad，colvinvl，castranovav，dastongp，denisonra，dreherkl，goeringpl，goldbergam，kulinowskikm，monteiro-rivierena，g，omenngs，pinkertonke，ramosks，restkm，sassjb，silbergeldek，wongba.meetingreport：hazardassessmentfornanoparticles-reportfromaninterdisciplinaryworkshop.environhealthperspet，2007，115(11)：1654-1659。

技术实现要素：

根据上述现有技术，本发明的目的在于提供一种颗粒物呼吸暴露神经毒性大鼠模型的建立方法。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案如下：

一种颗粒物呼吸暴露神经毒性大鼠模型的建立方法，包括：

对大鼠进行气管插管处理的步骤；

然后向大鼠的鼻腔滴注颗粒物混悬液的步骤；

去除气管插管的步骤。

在另一技术方案中，所述的颗粒物为纳米氧化铜。

在另一技术方案中，所述的纳米氧化铜的滴注剂量：10～20μg/g体重，每天1次，共15～60天。

在另一技术方案中，所述的颗粒物混悬液是通过将颗粒物分散于生理盐水中得到，优选地，颗粒物混悬液的浓度为10～100mg/ml，如10、20、30、40、50、60、70、80、100mg/ml。

建立所述颗粒物呼吸暴露神经毒性大鼠模型的具体操作过程如下：

(1)对大鼠行浅麻醉；

(2)待大鼠麻醉后，取仰卧位，固定头部和四肢；

(3)打开大鼠的嘴巴，将塑料管插入大鼠的气管内；

(4)用移液器吸取颗粒物混悬液，将颗粒物混悬液滴注入大鼠一侧鼻腔，待该鼻腔内的颗粒物混悬液完全吸收，呼吸顺畅均匀后，滴注大鼠的另一侧鼻腔；

(5)鼻腔滴注后，大鼠保持仰卧位，待大鼠自然苏醒后，拔除插在气管内的塑料管。

在另一技术方案中，采用腹膜腔注射戊巴比妥钠的方式对大鼠进行浅麻醉处理。优选地，戊巴比妥钠的剂量为30μg/g体重。

依上述方法建立的颗粒物呼吸暴露神经毒性大鼠模型在筛选治疗由颗粒物呼吸暴露所导致的神经损伤的药物中的应用。

依上述方法建立的颗粒物呼吸暴露神经毒性大鼠模型在筛选治疗神经退行性疾病药物中的应用，如帕金森病或阿尔茨海默病。

本发明采用鼻腔滴注模拟人群对大气颗粒物的实际接触方式，建立了颗粒物呼吸暴露神经毒性大鼠模型，可模拟pd模型，为进一步探寻pd等神经退行性病变的潜在环境促进因素、发病机制及预防、控制、干预神经疾患的发生及筛选治疗相关疾病的药物提供新的科学依据、技术方法和研究思路。

本发明在传统鼻腔滴注方法的基础上加以改进，即保留了传统鼻腔滴注方法的优点，又避免了动物因吸入染毒物窒息死亡，并确保染毒物最大限度的保留于鼻腔中，被鼻腔粘膜摄入，经嗅神经转运至脑组织，直接作用于靶点。

附图说明

图1.纳米氧化铜鼻腔滴注15d各脑区透射电镜观察结果。

图2.转棒实验中大鼠在转棒上的停留时间(n＝12)。

图3.悬挂实验中大鼠在金属丝上的悬挂时间(n＝12)。

图4.nano-cuo鼻腔滴注大鼠水迷宫实验结果(n＝12)。

图5.nano-cuo鼻腔滴注大鼠矿场实验结果(n＝12)。

图6.nano-cuo鼻腔滴注致大鼠皮质、海马、黑质、纹状体病理学损伤。

图7.nano-cuo鼻腔滴注致大鼠海马、黑质、纹状体、皮质组织神经元凋亡染色结果。

图8.nano-cuo鼻腔滴注致大鼠海马、黑质、纹状体组织星形胶质细胞活化免疫组化染色结果。

图9.nano-cuo鼻腔滴注致大鼠海马、黑质、纹状体组织小胶质细胞活化免疫组化染色结果。

图10.nano-cuo鼻腔滴注致大鼠黑质多巴胺能神经元变性死亡及多巴胺转运体免疫组化染色结果。

其中，*：与对照组相比，p＜0.05；**：与对照组相比，p＜0.01；^：与生理盐水组相比，p＜0.05；^^：与生理盐水组相比，p＜0.01。

具体实施方式

以下结合优选实施例及附图对本发明的技术方案做进一步详细说明。

实施例1

(一)鼻腔滴注方法

1.大鼠(体重200g左右)腹腔部位剃除皮毛，75％酒精棉球擦拭消毒后，腹膜腔注射无菌生理盐水配制的0.3％的戊巴比妥钠(1ml/100g体重)，行浅麻醉。

2.经5～10分钟，待大鼠麻醉后，取仰卧位，放于小手术台上，固定头部和四肢，头部向上将手术台倾斜45度。

3.将手术灯照射在脖颈处，打开大鼠的嘴巴，用套着橡胶管的镊子(避免将大鼠舌头夹伤)轻轻将大鼠的舌头掀起，在手术灯的照射下，可清晰的看到大鼠气管，将14g的塑料管插入大鼠气管内，这样采用气管插管呼吸的方式可确保鼻腔注入的物质不会吸入到肺部，而是作用于鼻粘膜，并且可防止物质进入气管造成大鼠窒息死亡。

4.将手术台平放，用20μl微量移液器吸取需滴注的液体物质，缓缓注入大鼠一侧鼻腔。

5.稍等片刻，待注入鼻腔内的液体完全吸收，呼吸顺畅均匀后，缓缓滴注大鼠另一侧鼻腔。

6.鼻腔滴注后，大鼠保持仰卧位，以免滴入的物质倒流，直至大鼠自然苏醒。一旦恢复意识，立即拔除塑料管。

(二)鼻腔滴注方法评价

1.配制浓度为50mg/ml的纳米氧化铜(nano-cuo)混悬液：将纳米氧化铜(粒径20～40nm)加入生理盐水中，使用漩涡振荡器初步混悬，置于超声清洗仪中，在4℃以下对纳米氧化铜进行超声使其分散均匀，振动频率为60hz，每超声10分钟，用漩涡振荡器混悬一次，共超声4小时，置于4℃冰箱中保存备用。每次鼻腔滴注前，先用漩涡振荡器混悬，再行超声10分钟，并用漩涡振荡器混悬后，微量移液器吸取，滴入鼻腔。

2.spf级雄性wistar大鼠10只，分为生理盐水对照组和纳米氧化铜暴露组(20μg/g体重)，采用上述(一)的鼻腔滴注方式进行染毒，每天1次，共15天，利用电感耦合等离子体质谱法(inductivelycoupledplasmamassspectrometry，icp-ms)检测大鼠嗅球、海马、纹状体、前额皮质、小脑中cu元素的含量；利用透射电镜观察纳米颗粒在大鼠嗅球、海马、纹状体、前额皮质内的定位，结果见表1和图1。

表1.纳米氧化铜鼻腔滴注染毒15d后各脑区cu元素含量(ng/mgtissue)(n＝3)

*：与对照组相比，p＜0.05；**：与对照组相比，p＜0.01。

可以发现，采用上述鼻腔滴注方法，纳米颗粒可被嗅粘膜摄入，经嗅觉神经转运至中枢神经系统，大鼠嗅球、海马、纹状体、前额皮质内cu元素含量均显著升高(表1)，且主要存在于神经纤维断面和细胞质中；同时造成相应脑区出现线粒体和高尔基体肿胀、粗面内质网减少、溶酶体增多、突触结构不清及间隙变窄等超微结构改变(图1)。

实施例2多巴胺能神经元损伤模型建立

spf级雄性wistar大鼠(72只)按体重匹配随机分为3组，每组24只。分为空白对照组(只抓取，不给予任何处理)、生理盐水组和nano-cuo暴露组(10μg/g体重)，依实施例1(一)所述的鼻腔滴注方式进行染毒，每天1次，其60天。

1.行为学评价：nano-cuo鼻腔滴注可致大鼠发生类似帕金森病样的行为学改变

通过悬挂实验和转棒实验，发现nano-cuo可引发大鼠的肌力和运动协调能力下降等类似帕金森病的症状(图2-3)。

通过morris水迷宫实验，发现nano-cuo鼻腔滴注可使大鼠的空间学习记忆能力下降(图4)。

通过矿场实验发现大鼠的空间探索能力和自主行为能力受损及在新环境中的紧张度增加(图5)。

2.nano-cuo鼻腔滴注致皮质、海马、纹状体及黑质病理学损伤：组织病理学检测发现，纹状体神经细胞水肿，细胞核固缩，纤维束排列疏松，炎细胞浸润；海马组织可见变性，细胞缺失、浸润；黑质和皮质可见变性、坏死(图6)。

3.nano-cuo鼻腔滴注致大鼠海马、黑质、纹状体神经细胞凋亡、小胶质细胞和星形胶质细胞活化；黑质多巴胺能神经元死亡及多巴胺转运体减少

nano-cuo暴露可致黑质、纹状体、海马、皮质神经细胞凋亡(图7)；海马、纹状体和黑质星形胶质细胞和小胶质细胞大量活化(图8，图9)；黑质区多巴胺能神经元死亡及多巴胺转运体减少(图10)，说明多巴胺能神经元合成和转运多巴胺的功能受损。

本发明试验结果提示，nano-cuo可通过激活小胶质细胞和星形胶质细胞介导多巴胺能神经元变性死亡，导致多巴胺转运体减少，影响多巴胺的合成功能。pd是由于中脑黑质致密区多巴胺能神经元进行性退变所引起的中枢神经系统类疾病，表现为静止性震颤、肌肉僵直、运动迟缓、语言障碍、精神障碍等症状，严重影响人的运动功能，甚至不能自理，本发明试验结果提示，nano-cuo可增加pd的致病风险。