一种绿豆子叶节再生培养方法与流程

本发明属于生物组培领域，涉及一种绿豆子叶节再生培养方法。

背景技术：

绿豆(vignaradiata(l)wilczek)是重要的谷类豆类作物和膳食蛋白质的良好来源，在东南亚，非洲，南美洲和澳大利亚广泛种植。绿豆种子含有比其他豆类更高水平的叶酸和铁而受到青睐。目前来说，豆类研究和应用比较多的大豆，其再生体系以子叶节再生体系为研究最多，但不同的物种再生体系差异较大，绿豆的再生体系在国际上也有1次报道，但重复效果不佳。本研究以绿豆子叶节为外植体，研究不同的植物生长调节剂和绿豆的不同基因型对绿豆子叶节愈伤组织和不定芽的诱导的影响，找出了最适基因型和植物生长调节剂浓度，为绿豆的再生以及以再生为基础的转基因研究开拓道路。

申请人前期申请了一项中国发明专利cn108419674a，公开了一种绿豆子叶节为外植体的丛生芽诱导方法，该方法首先对绿豆种子进行灭菌处理，然后接种到种子萌发培养基中培养4天，以两边子叶节为外植体接种到丛生芽诱导培养基。培养基组成成分包括大量元素、微量元素、植物生长调节剂及其他添加物等。该方法外植体操作方便，丛生芽诱导率快，培养条件不受外界天气变化和病虫害的影响。但是，cn108419674a仅考察了vc对丛生芽的诱导率的影响,且其中的培养基配方与本发明差异较大,该申请并没有考察从子叶节到植株的整个过程。

技术实现要素：

本发明的目的是：提供一种新的绿豆子叶节再生培养方法，使组织培养的绿豆再生能力高、不定芽数多、再生周期短。

为达到上述目的，采用的技术方案是：

一种绿豆子叶节再生培养方法，依次包括下列步骤：

(1)萌发培养绿豆种子消毒、浸泡后，种脐向下接种到萌发培养基上培养4～6天，萌发无菌苗；

(2)诱导出芽无菌苗去掉子叶、上胚轴和胚根，保留2～4cm下胚轴，并在两片子叶节合处制造微小伤口，然后转移到不定芽诱导培养基中诱导10～15天出芽；所述的不定芽诱导培养基b5培养基+1.0mg/l苄氨基腺嘌呤+1.0mg/l激动素+0.1mg/l吲哚丁酸。

(3)培养伸长将步骤(2)得到的外植体转入不定芽伸长培养基中培养20～25天，至不定芽伸长到3～4cm；

(4)生根移栽待芽苗伸长至3～4cm左右后，转入生根培养基10～15天，生根3条以上，每条长度3cm左右后，移栽得到再生植株；所述生根培养基为1/2ms培养基+1mg/liba。

步骤(1)所述的萌发培养基优选ms培养基+1.0～2.0mg/l噻苯隆+10g/l琼脂+3％蔗糖。

步骤(3)所述伸长培养基优选b5培养基+0.1～0.5mg/lba。

本发明的积极效果是：本发明选择完整的子叶节作为外植体,并针对苏绿2号的基因型配合筛选的不定芽诱导培养基、生根培养基,绿豆产生的不定芽数目多，芽伸长较快，再生周期短。与选用对半切开子叶节等外植体培养再生植株相比，本发明采用绿豆完整的子叶节分生组织再生法，避免了因为绿豆粒小而引起的切割和划伤超作难度，提高了绿豆产生的不定芽数目，加速了芽伸长速度，缩短了再生周期。本发明绿豆子叶节再生培养方法同时也适用于各绿豆品种的组织培养。

附图说明

图1绿豆子叶节外植体离体再生过程

图2不同培养基对子叶节外植体愈伤组织形成的影响

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例中所述萌发培养基、不定芽诱导培养基、不定芽伸长培养基和生根培养基中的ms或b5为ms无机盐培养基或b5维生素培养基。用1mol/lnaoh调节培养基溶液ph值至5.8～6.0。培养温度为25℃±1℃。

实施例1不定芽诱导培养基成分摸索

将8个品种在萌发培养基生长4天(图1-a)，无菌苗去掉子叶、上胚轴和胚根，保留2～4cm下胚轴，并在两片子叶节合处制造微小伤口(图1-b)接种在(1)b5+1.0mg/lba+1.0mg/lkt+0.1mg/liba，(2)b5+1.0mg/lba+0.1mg/liba和(3)b5+1.0mg/lba三种不同激素浓度的培养基上，第15天开始统计子叶节外植体愈伤组织的形成情况。由图2可见:1，2，3分别代表培养基b5+1.0mg/lba+1.0mg/lkt+0.1mg/liba，b5+1.0mg/lba+0.1mg/liba，b5+1.0mg/lba。不同基因型在不同三种培养基上愈伤组织形成率各不相同，但在1号培养基b5+1.0mg/lba+1.0mg/lkt+0.1mg/liba上子叶节外植体愈伤组织形成率最高。因此1号培养基适合愈伤组织的形成。

实施例2生根诱导培养基成分摸索

待芽苗伸长至3～4cm左右后，分别转接到1/2ms+0.1mg/liba，1/2ms+0.5mg/liba，1/2ms+1mg/liba培养基上，比较不同激素浓度对不定根诱导的影响；2周后统计芽苗的生根率。由表3可以看出：使用浓度为0.1mg·l^-1和0.5mg·l^-1的iba不促进绿豆无菌苗生根(图1-e)，而1mg·l^-1的iba的生根率为2.35(表1)。

表1不同质量浓度iba对绿豆无菌苗生根的影响

实施例3试验品种为苏绿2号，30粒。

选取饱满绿豆种子，用自来水冲洗干净，再用70％酒精消毒一分钟，用饱和次氯酸钠溶液消毒30分钟，接着无菌水冲洗3次。然后种脐向下接种到萌发培养基(ms培养基+1.0mg/l噻苯隆+10g/l琼脂+3％蔗糖)上培养6天。将萌发的绿豆，去掉种皮、子叶、上胚轴和胚根等，只保留下胚轴3cm，并在两片子叶节合处制造微小伤口，将外植体转移到不定芽诱导培养基(b5培养基+1.0mg/l苄氨基腺嘌呤+1.0mg/l激动素+0.1mg/l吲哚丁酸)中培养15天诱导出芽。诱导出芽后，切去底部部分死组织，将外植体转入不定芽伸长培养基(b5培养基+0.1mg/lba)中培养25天。不定芽伸长至4cm时，切下芽转入生根培养基(1/2ms培养基+1mg/liba)培养10天，不定芽生出3条以上，每条长度在3cm左右时，将瓶盖打开炼苗3天，取出小苗，温水洗净根部残留琼脂，然后种植在盛有灭菌土的营养钵中，温度控制在22℃左右，保湿，2周后移栽大棚或温室中。

苏绿2号获得再生植株178株，不定芽抽长10～15个/外植体，平均再生频率达12.4个/外植体。绿豆产生的不定芽数目较多。

本发明与已报到绿豆再生体系相比，可重复性强，产生的不定芽7～15个/株、再生频率达到9个/外植体左右，重复性好，再生植株生长旺盛。本方法适用于绿豆品种的组织培养和以此为基础的绿豆遗传转化研究。