本发明涉及一种红豆草花药愈伤组织分化培养基，尤其涉及一种提高红豆草花药愈伤组织分化成苗率的分化培养基，属于牧草植物生物技术领域。
背景技术：
豆科牧草是指由豆科饲用植物组成的牧草类群，又称豆科草类。豆科牧草蛋白质含量高，适口性好，与根瘤菌共生，能固定大气中的氮为自身提供氮素营养，并提高土壤肥力，常兼用作绿肥和蜜源植物。豆科牧草种类丰富，主要有苜蓿、红豆草、三叶草、草木樨、紫云英、百脉根等，其中红豆草营养价值高，粗蛋白质含量丰富，有“牧草皇后”之称。红豆草是豆科红豆草属多年生草本植物，主根粗壮，直径2cm以上，入土深达3~4m，根系强大，侧根分枝多，为深根型牧草。研究表明，风干的红豆草含粗蛋白质约16.8%（但在红豆草的不同生育期含量变化很大，其中以营养期和结实期粗蛋白质含量最高）、粗脂肪4.9%、无氮浸出物49.6%，而纤维素仅有20.9%，维生素和矿物质含量也很高，尤其是叶子中含有多量维生素，同时还含有家畜生长育所需的各种必需氨基酸，所以红豆草是牲畜的好饲草。红豆草叶量丰富，茎秆中空，草质柔软，气味芳香，无论青草、干草或青贮，各类牲畜都喜食。由于红豆草在各个生育期含有较多的浓缩单宁，而单宁能沉淀可溶性蛋白质，能防止可溶性蛋白质在胃中产生持续性泡沫，因此，反刍牲畜在采食鲜草时，不会得膨胀病，这是红豆草优于其它豆科牧草的最大优点。红豆草适应性强，耐干旱、寒冷、早霜、贫瘠土壤，生长发育快，开花结实早，适于我国西北、华北等干旱、半干旱地区种植。红豆草叶色鲜绿、花色明亮美丽、花期较长，还可作为很好的景观资源和景区植被来美化环境。
牧草育种是发展草产业的基础性工作。优良的牧草品种不仅是畜牧业发展的保障，还为草地的改良和可持续发展提供了重要保证。然而中国牧草育种工作起步较晚，与先进国家相比差距很大，同时也落后于国内的农作物品种选育工作。目前，我国牧草育种多采用野生引种驯化、地方品种整理、国内外优良品种引进、选择育种及杂交育种等常规方法，育种工作存在着育成品种少、育种进程缓慢、育种原始材料较少、育种技术科技含量低等问题。以红豆草为例，自20世纪50年代普通红豆草引入我国以来，截止目前为止，我国审定登记的红豆草新品种仅有3个，分别为甘肃红豆草（onobrychisviciaefolia.scop.cv.gansu）、蒙农红豆草（onobrychisviciaefolia.scop.cv.mengnong）和奇台红豆草（onobrychisviciaefolia.scop.cv.qitai），审定登记的红豆草品种数量极少、老化且产量低、质量差，其研究的广度和深度与另一种豆科牧草苜蓿相比差距较大。随着草食畜牧业发展和对蛋白质饲草需求量的增加，对红豆草新品种的需求也将越来越大。因此，提出改进红豆草育种方法、培育特色品种、加强红豆草种质资源保护与利用是缩小我国与国外红豆草育种进程的有效途径。
红豆草属于严格意义上的异花授粉植物，自花不实，具有显著的杂种优势，因此适用于杂交育种方法进行新品种培育。然而，传统杂交育种方法由于后代分离、显隐性干扰等原因，存在周期长、效率低等突出问题。单倍体技术是生物技术与常规育种技术结合的一种育种新途径，具有极早稳定分离后代、缩短育种年限、简化选育程序等优点，而花药培养是获得单倍体的最简便有效途径。1963年yamada等从被子植物的花药培养中获得了单倍体愈伤组织。1964年，印度学者guha和maheshuari从毛叶曼陀罗花药培养中获得了胚状体及其再生植株，细胞全能性学说在生殖细胞水平上得到验证。由于单倍体植物加倍后即成为可育的纯合系，因此受到育种学家的极大重视。自从这一单倍体诱导技术建立以来，据不完全统计，目前，已经有200多种植物通过花药培育获得了单倍体植株。花药培养的优势在于：一是获得纯系育种材料和进行单倍体育种，以利用杂种优势，缩短育种年限和提高育种效率；二是用所获得的纯合二倍体材料进行遗传变异规律研究，使作物育种有坚实的遗传理论依据，减少育种的盲目性；三是克服远缘杂种的不育性，获得具有双亲优良特性的可育远缘杂种；四是有利于新抗源的不断发现，野生资源的充分利用。另外，在分子生物技术迅速发展和日趋成熟的今天，花药培养的应用领域不断扩大，其研究意义日益突出。
目前国内关于红豆草花药培养的研究开展的不多，虽然有获得单倍体植株的报道，但花药培养产生愈伤组织的诱导频率低、分化成苗率低等问题一直没有得到很好的解决，使得实际上通过花药培养获得单倍体植株仍然十分困难，无法将其应用于育种实践。培养基是花药培养的物质基础，直接关系到花药愈伤组织的形成与分化，培养基组分是影响花培效率的一个很重要的因素。培养基各组分的合适用量，以及它们之间一定的组合关系，可导致花培效率的大幅度提高。筛选和优化基本培养基，提高培养基选用的针对性，是提高花药培养力的有效措施；大量的研究发现一些附加物可以显著提高花药培养力，发现和优化组合花药培养附加物质，可进一步提高花药培养效率。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种红豆草花药愈伤组织分化培养基，以提高愈伤组织的绿苗分化率，从而进一步提高花药培养效率。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种红豆草花药愈伤组织分化培养基，其特征在于，该培养基的组分及浓度为：kno32750-2900mg/l，（nh4）2so4330-350mg，ca（no3）2204-212mg/l，mgso4·7h2o173-185mg，kh2po4202-210mg/l，k2hpo4165-173mg/l，ki0.79-0.83mg/l，h3bo34.3-4.9mg/l，mnso4·4h2o20-23mg/l，znso4·7h2o8.5-9.0mg/l，na2moo4·2h2o0.21-0.25mg/l，cuso4·5h2o2-3mg/l，cocl2·6h2o0.02-0.03mg/l，甘氨酸铁28.6-30.2mg/l，肌醇95-105mg/l，烟酸1.2-1.4mg/l，盐酸吡哆醇1.5-2.5mg/l，盐酸硫胺素6.6-7.0mg/l，缬氨酸4.1-4.5mg/l，牛磺酸0.06-0.08mg/l，谷氨酰胺485-515mg，茶多酚13-17mg/l，zt0.4-0.6mg/l，己酸二乙氨基乙醇酯0.9-1.1mg/l，柠檬酸钛1.8-2.2mg/l，硝酸镧1.0-1.4mg/l，聚乙烯吡咯烷酮2.8-3.2mg/l，硝普钠27-33μmol/l，秋水仙碱0.18-0.22mg/l，麦芽糖27-33g/l，植物凝胶4-6g/l，桑叶汁65-75ml/l。
所述培养基的最佳组分浓度为：kno32825mg/l，（nh4）2so4340mg，ca（no3）2208mg/l，mgso4·7h2o179mg，kh2po4206mg/l，k2hpo4169mg/l，ki0.81mg/l，h3bo34.6mg/l，mnso4·4h2o21.5mg/l，znso4·7h2o8.75mg/l，na2moo4·2h2o0.23mg/l，cuso4·5h2o2.5mg/l，cocl2·6h2o0.025mg/l，甘氨酸铁29.4mg/l，肌醇100mg/l，烟酸1.3mg/l，盐酸吡哆醇2.0mg/l，盐酸硫胺素6.8mg/l，缬氨酸4.3mg/l，牛磺酸0.07mg/l，谷氨酰胺500mg/l，茶多酚15mg/l，zt0.5mg/l，己酸二乙氨基乙醇酯1.0mg/l，柠檬酸钛2.0mg/l，硝酸镧1.2mg/l，聚乙烯吡咯烷酮3.0mg/l，硝普钠30μmol/l，秋水仙碱0.2mg/l，麦芽糖30g/l，植物凝胶5g/l，桑叶汁70ml/l。
所述培养基的ph值为5.8-6.2。
所述桑叶汁的制备方法为：选用新鲜的桑叶用自来水冲洗干净，切成小块后用组织捣碎机充分捣碎，再用80目筛网过滤，所得滤液即为桑叶汁。
本发明的优点在于：
本发明的红豆草花药愈伤组织分化培养基是经过大量试验得出的优化组合，调整了大量元素、微量元素的浓度，尤其提高了cu2+离子的浓度；添加了牛磺酸、谷氨酰胺、茶多酚、zt、己酸二乙氨基乙醇酯、柠檬酸钛、硝酸镧、聚乙烯吡咯烷酮、硝普钠、秋水仙碱、桑叶汁，以麦芽糖作为碳源，植物凝胶作为凝固剂，使得红豆草花药愈伤组织的分化成苗率比现有技术有了显著的提高，大大提高了红豆草花培再生植株的获得率，对于进一步推广和应用红豆草单倍体育种和理论研究无疑有较大的现实意义和实用价值。
具体实施方式
为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体试验例对本发明作进一步的说明。
实施例1
以普通红豆草和高加索红豆草的花药愈伤组织作为试验材料，当愈伤组织长到3-4mm大小时，转接至分化培养基上，置于温度24℃、光照强度2000lx、光照时间14h/d的条件下培养30d，统计绿苗分化率。绿苗分化率=（分化出不定芽或小苗的愈伤组织数/接种愈伤组织总数）×100%。
分化培养基的组分及浓度为：kno32825mg/l，（nh4）2so4340mg，ca（no3）2208mg/l，mgso4·7h2o179mg，kh2po4206mg/l，k2hpo4169mg/l，ki0.81mg/l，h3bo34.6mg/l，mnso4·4h2o21.5mg/l，znso4·7h2o8.75mg/l，na2moo4·2h2o0.23mg/l，cuso4·5h2o2.5mg/l，cocl2·6h2o0.025mg/l，甘氨酸铁29.4mg/l，肌醇100mg/l，烟酸1.3mg/l，盐酸吡哆醇2.0mg/l，盐酸硫胺素6.8mg/l，缬氨酸4.3mg/l，牛磺酸0.07mg/l，谷氨酰胺500mg/l，茶多酚15mg/l，zt0.5mg/l，己酸二乙氨基乙醇酯1.0mg/l，柠檬酸钛2.0mg/l，硝酸镧1.2mg/l，聚乙烯吡咯烷酮3.0mg/l，硝普钠30μmol/l，秋水仙碱0.2mg/l，麦芽糖30g/l，植物凝胶5g/l，桑叶汁70ml/l，ph值为6.0；其中桑叶汁的制备方法为：选用新鲜的桑叶用自来水冲洗干净，切成小块后用组织捣碎机充分捣碎，再用80目筛网过滤，所得滤液即为桑叶汁。
实施例2：柠檬酸钛对红豆草花药愈伤组织分化的影响
配制其它组分与实施例1中分化培养基相同，柠檬酸钛浓度分别为0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/l的7种分化培养基，按照实施例1中的方法将普通红豆草和高加索红豆草的花药愈伤组织分别转接到这些分化培养基上培养，统计绿苗分化率，结果见表1。
柠檬酸钛是一种植物生长调节剂，植物吸收后其体内叶绿素含量增加，光合作用增强，使过氧化氢酶含量增高，硝酸盐还原酶活性增强，还可加快植物根系生长，促进植物对土壤中的大量元素和微量元素的吸收。从表1可以看出，分化培养基中添加0.5-3.0mg/l的柠檬酸钛，绿苗分化率与对照（0mg/l）相比均有所提高，其中添加2.0mg/l的柠檬酸钛绿苗分化率最高，分别为普通红豆草52.35%，高加索红豆草45.87%，因此2.0mg/l是分化培养基中柠檬酸钛的最适浓度。
实施例3：硝普钠对红豆草花药愈伤组织分化的影响
配制其它组分与实施例1中分化培养基相同，硝普钠浓度分别为0、10、20、30、40、50μmol/l的6种分化培养基，按照实施例1中的方法将普通红豆草和高加索红豆草的花药愈伤组织分别转接到这些分化培养基上培养，统计绿苗分化率，结果见表2。
硝普钠是常用的一氧化氮供体，一氧化氮作为一个重要的信号分子参与植物组织细胞内多种生理过程的调节，对植物生长发育具有广泛的影响。从表2可以看出，分化培养基中添加10-40μmol/l的硝普钠，绿苗分化率与对照（0mg/l）相比均有所提高，其中添加30μmol/l的硝普钠绿苗分化率最高，分别为普通红豆草52.84%，高加索红豆草46.61%，当分化培养基中添加50μmol/l的硝普钠时，绿苗分化率与对照（0mg/l）相比有所降低，愈伤组织部分出现褐化死亡，可能是硝普钠浓度过高对愈伤组织产生了毒害作用，因此30μmol/l是分化培中硝普钠的最适浓度。
实施例4：硝酸镧对红豆草花药愈伤组织分化的影响
配制其它组分与实施例1中分化培养基相同，硝酸镧浓度分别为0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mg/l的6种分化培养基，按照实施例1中的方法将普通红豆草和高加索红豆草的花药愈伤组织分别转接到这些分化培养基上培养，统计绿苗分化率，结果见表3。
镧是一种稀土元素，有研究表明稀土在一定条件下能够促进植物生根、发芽，增加叶绿素含量，增强光合速率，提高磷的吸收和运输，还能影响一些酶的活性，稀土在组织培养过程中作为一种添加元素，对外植体的培养能够起到重要的作用。从表3可以看出，分化培养基中添加0.4-2.0mg/l的硝酸镧，绿苗分化率与对照（0mg/l）相比均有所提高，其中添加1.2mg/l的柠檬酸钛绿苗分化率最高，分别为普通红豆草53.04%，高加索红豆草46.77%，与对照（0mg/l）的绿苗分化率差异达到显著水平，因此1.2mg/l是分化培养基中硝酸镧的最适浓度。
实施例5：桑叶汁对红豆草花药愈伤组织分化的影响
配制其它组分与实施例1中分化培养基相同，桑叶汁浓度分别为0、10、30、50、70、90ml/l的7种分化培养基，按照实施例1中的方法将普通红豆草和高加索红豆草的花药愈伤组织分别转接到这些分化培养基上培养，统计绿苗分化率，结果见表4。
桑叶汁中含有丰富的蛋白质、氨基酸，较高含量的黄酮化合物和桑苷，以及多种微量元素和维生素，对红豆草花药愈伤组织的分化有促进作用。从表4可以看出，分化培养基中添加10-90ml/l的桑叶汁，绿苗分化率与对照（0mg/l）相比均有所提高，其中添加70ml/l的桑叶汁绿苗分化率最高，分别为普通红豆草52.60%，高加索红豆草46.25%，因此70ml/l是分化培养基中桑叶汁的最适浓度。
对比例1
以普通红豆草和高加索红豆草的花药愈伤组织作为试验材料，当愈伤组织长到3-4mm大小时，转接至分化培养基上，置于温度24℃、光照强度2000lx、光照时间14h/d的条件下培养30d，统计绿苗分化率。绿苗分化率=（分化出不定芽或小苗的愈伤组织数/接种愈伤组织总数）×100%。
分化培养基的组分为：n6+6-ba0.2mg/l+iaa2.0mg/l（来源于师尚礼《不同培养基对三种豆科牧草花药培养影响的研究》）。
对比例2
以普通红豆草和高加索红豆草的花药愈伤组织作为试验材料，当愈伤组织长到3-4mm大小时，转接至分化培养基上，置于温度24℃、光照强度2000lx、光照时间14h/d的条件下培养30d，统计绿苗分化率。绿苗分化率=（分化出不定芽或小苗的愈伤组织数/接种愈伤组织总数）×100%。
分化培养基的组分为：n6+kt1.0mg/l+iaa0.5mg/l（郭景文等《四种豆科牧草花药和组织培养的研究》）。
从表5可以看出，采用本发明的分化培养基，普通红豆草和高加索红豆草的平均绿苗分化率为49.49%，与对比例1的25.91%、对比例2的17.24%相比有了显著提高。本发明的红豆草花药愈伤组织分化培养基是经过大量试验得出的优化组合，调整了大量元素、微量元素的浓度，尤其提高了cu2+离子的浓度；添加了牛磺酸、谷氨酰胺、茶多酚、zt、己酸二乙氨基乙醇酯、柠檬酸钛、硝酸镧、聚乙烯吡咯烷酮、硝普钠、秋水仙碱、桑叶汁，以麦芽糖作为碳源，植物凝胶作为凝固剂，使得红豆草花药愈伤组织的绿苗分化率比前人的研究有了显著的提高，大大提高了红豆草花培再生植株的获得率。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。