一种假鬼伞属真菌在促进杜鹃兰种子萌发中的应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，涉及一种假鬼伞属真菌在促进杜鹃兰种子萌发中的应用。

背景技术：

兰科植物种类众多，全世界已报道的约有26000种，广泛分布于各种陆地生态系统中。由于多数兰科植物种子的胚未发育成熟，无胚乳，无法为种子萌发提供足够的营养物质，其种子萌发可通过非共生萌发培养和共生萌发培养两种方式。

杜鹃兰[cremastraappendiculata(d.don)makino]为兰科（orchidaceae）杜鹃兰属（cremastra）多年生珍稀药用草本植物，以干燥假鳞茎入药，因其假鳞茎具有清热解毒、活血化瘀、抗肿瘤等功效，而受到广泛关注。虽然在实验室条件下，杜鹃兰种子可以通过非共生萌发培养，但此方式获得的幼苗移植至土壤时抵抗病原微生物能力差，存活率较低，同时因其很难与环境中接触的真菌建立共生关系导致生长受阻。

基于自然条件下兰科种子萌发阶段需要依赖特定真菌的特点，研究促进兰科植物种子萌发的优良真菌菌株（俗称萌发菌）的工作就显得尤为重要。

综上，探寻促进兰科药用植物杜鹃兰种子萌发的真菌，缩短种子萌发时间及提高种子萌发率，将成为实现杜鹃兰种子保育及其资源可持续利用的有效途径。

发明目的

本发明的目的在于，提供一种假鬼伞属真菌在促进杜鹃兰种子萌发中的应用。本发明通过从野生杜鹃兰成年植株根中分离得到一株假鬼伞属真菌菌株，与杜鹃兰种子共培养过程中能有效促进杜鹃兰种子萌发。

本发明的技术方案

一种假鬼伞属真菌在促进杜鹃兰种子萌发中的应用。

前述的假鬼伞属真菌在促进杜鹃兰种子萌发中的应用中，所述假鬼伞属真菌为小脆柄菇菌。

一种假鬼伞属真菌促进杜鹃兰种子萌发的方法，包括如下步骤：

（1）活化小脆柄菇菌株作为共生萌发材料；

（2）配置共生萌发培养基；

（3）对杜鹃兰种子消毒灭菌；

（4）在共生萌发培养基中接种小脆柄菇菌株和杜鹃兰种子，进行共培养。

前述的假鬼伞属真菌促进杜鹃兰种子萌发的方法中，所述步骤（1）活化小脆柄菇菌株的方法是：将保存于3.5-4.5℃的小脆柄菇菌株取出，接种到pda培养基上，置于24-26℃的人工气候箱内培养6-8d取出，作为共生萌发材料。

前述的假鬼伞属真菌促进杜鹃兰种子萌发的方法中，所述步骤（1）的方法是：将保存于4℃的小脆柄菇菌株取出，接种到pda培养基上，置于人工气候箱内25℃条件下培养，培养7d取出，获得共生萌发活化菌株。

前述的假鬼伞属真菌促进杜鹃兰种子萌发的方法中，所述步骤（2）中共生萌发培养基为燕麦粉琼脂培养基（oma）；配置完成后在118-124℃下灭菌20min，得共生萌发培养基。

前述的假鬼伞属真菌促进杜鹃兰种子萌发的方法中，所述燕麦粉琼脂培养基的燕麦粉含量为4g/l，琼脂的含量为8g/l，ph自然。

前述的假鬼伞属真菌促进杜鹃兰种子萌发的方法中，所述步骤（3）的过程是将成熟杜鹃兰蒴果表面经75%乙醇消毒30s，无菌水冲洗3次，然后拨开果壳，取出种子用无菌滤纸包裹，经75%乙醇消毒30s，无菌水冲洗3次，再经1%次氯酸钠消毒3min，无菌水冲洗5次。

前述的假鬼伞属真菌促进杜鹃兰种子萌发的方法中，所述步骤（4）是将共生萌发培养基倒入无菌培养皿，待其凝固后，在表面铺上中央有孔的无菌滤纸，再用无菌棉签蘸取种子均匀涂布于滤纸上，再将共生萌发菌株的菌丝接种于滤纸中央孔中，用封口膜将培养皿封好，在22℃的培养箱中培养。

前述的假鬼伞属真菌促进杜鹃兰种子萌发的方法中，所述步骤（4）是将冷却至40-50℃的共生萌发培养基倒入直径9cm的无菌培养皿，每皿倒入18-22ml，待其凝固后，在表面铺上中央有孔的无菌滤纸，再用无菌棉签蘸取种子均匀涂布于滤纸上，再将共生萌发菌株的菌丝接种于滤纸中央孔中，用封口膜将培养皿封好，在22℃的培养箱中培养。

前述的假鬼伞属真菌促进杜鹃兰种子萌发的方法中，所述假鬼伞属真菌的分离方法：以野生杜鹃兰健康根为材料，经75%乙醇表面消毒30s后，再经1%次氯酸钠消毒3min，无菌水冲洗5次，再将无菌根置于预先灭菌的研钵中，加入1ml无菌水研磨后，吸取100μl研磨液涂布于查氏培养基，待菌丝长出后，挑取菌丝至pda培养基纯化即可。所述分离的假鬼伞属真菌的生物学特征在于：菌落在pda培养基上生长速率为4.70±0.10mm/d，所述菌落气生菌丝发达，菌丝密集较粗，初生菌丝为白色，7d左右菌落呈现浅黄色，菌落边缘整齐，厚薄均匀。老化的菌丝呈现褐色且稀薄，可生长到培养皿盖。光学显微镜下可清楚观察到菌丝隔膜结构，近分支处有一锁状凸起，分枝呈锐角，顶端具椭圆形或近球形孢子；生长10d左右的菌丝可见菌环结构。

对于本发明方案，发明人有如下研究过程：

1、一株促进杜鹃兰种子萌发真菌的分离纯化：以野生杜鹃兰健康根为材料，经75%乙醇表面消毒30s后，再经1%次氯酸钠消毒3min，无菌水冲洗5次。将无菌根置于预先灭菌的研钵中，加入1ml无菌水研磨后，吸取100μl研磨液涂布于查氏培养基，恒温培养箱内25℃条件下黑暗培养。待菌丝长出后，挑取菌丝至pda培养基纯化。纯化菌种接种于pda斜面培养基，4℃保存。

2、一株促进杜鹃兰种子萌发真菌的鉴定：将纯化菌株接种于pda培养基上纯培养，进行菌落及显微结构观察。显微形态观察特征采用透明胶带法，取一洁净载玻片，滴一滴乳酸石炭酸棉兰染液于载玻片上；剪下1cm左右透明胶带，用镊子夹住胶带一端使胶面轻轻触及菌落边缘表面。将黏在透明胶带上的菌体浸入载玻片上的乳酸石炭酸棉兰染液中，并将透明胶带两端固定在载玻片上，表面上盖一洁净盖玻片，用低倍镜和高倍镜镜检。菌落在pda培养基上生长速率为4.70±0.10mm/d，所述菌落气生菌丝发达，菌丝密集较粗，初生菌丝为白色，7d左右菌落呈现浅黄色，菌落边缘整齐，厚薄均匀。老化的菌丝呈现褐色且稀薄，可生长到培养皿盖。光学显微镜下可清楚观察到菌丝隔膜结构，近分支处有一锁状凸起，分枝呈锐角，顶端具椭圆形或近球形孢子；生长10d左右的菌丝可见菌环结构。

将纯化真菌菌丝送至上海生工生物工程有限公司进行分子鉴定，采用真菌基因组dna抽提试剂盒提取菌株dna，以its1/its4为引物进行pcr扩增。将测定的序列提交至美国国立生物技术信息中心数据库（ncbi,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/），并进行blast比对。

结合形态学特征及所测序列与数据库中真菌序列相似度达到99%的特征，将该菌株鉴定为假鬼伞属小脆柄菇菌。

3、促萌发真菌与杜鹃兰种子共培养：

将保存于4℃试管斜面的供试菌株取出，重新接种到pda培养基上，置于人工气候箱内25℃条件下培养，进行活化。培养7d左右取出作为共生萌发材料。

配置共生萌发培养基：所用培养基为燕麦粉琼脂培养基（oma，4g/l燕麦粉，8g/l琼脂，ph自然）。将配好的培养基121℃灭菌20min后备用。

杜鹃兰种子消毒灭菌：将成熟杜鹃兰蒴果表面经75%乙醇消毒30s，无菌水冲洗3次。拨开果壳，抖出种子用无菌滤纸包裹，经75%乙醇消毒30s，无菌水冲洗3次；再经1%次氯酸钠消毒3min，无菌水冲洗5次，备用。

播种与培养：将冷却至40-50℃的oma培养基倒入无菌培养皿（直径9cm），每皿约20ml，待其凝固后，在表面铺上中央有孔的无菌滤纸。用无菌棉签蘸取种子均匀涂布于滤纸上，再将纯化真菌菌丝接种于滤纸中央孔中，用封口膜将培养皿封好；以不接真菌菌丝为空白对照组。各10个重复，在人工气候培养箱内22℃条件下培养。

检测：播种后每周在体视显微镜下观察种子萌发情况，并记录不同萌发时期的萌发数量（以种胚膨大突破种皮作为种子萌发的标志）。

结果表明，不接菌空白对照组种子均没有吸水膨胀，无任何萌发迹象。而处理组种子10d左右可在体视显微镜下观察到部分种子吸水膨胀，20d左右突破种皮，形成原球茎，40d左右出现根毛或形成假根；置于光照条件下，随后转绿。说明该假鬼伞属真菌能够有效促进杜鹃兰种子萌发。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明通过从野生杜鹃兰成年植株根中分离得到一株假鬼伞属小脆柄菇菌株，该种菌与杜鹃兰种子共培养过程中能有效促进杜鹃兰种子萌发，本发明今后可在杜鹃兰种苗繁育中加以应用。

附图说明

图1为促萌发真菌菌落形态和菌丝显微结构图；

图2为杜鹃兰种子与促萌发真菌共生培养图。

附图标记：图1中a为菌落形态，b和c均为菌丝显微结构；图2中a为不接菌空白对照组，b为处理组种子突破种皮形成原球茎，c为处理组种子出现根毛或假根。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。

实施例1，假鬼伞属真菌的获取：以野生杜鹃兰健康根为材料，经75%乙醇表面消毒30s后，再经1%次氯酸钠消毒3min，无菌水冲洗5次。将无菌根置于预先灭菌的研钵中，加入1ml无菌水研磨后，吸取100μl研磨液涂布于查氏培养基。待菌丝长出后，挑取菌丝至pda培养基纯化。纯化的菌株进行菌落形态观察，并采用棉兰染色法观察菌丝显微形态结构。

该真菌生物学特征在于：菌落在pda培养基上生长速率为4.70±0.10mm/d，所述菌落气生菌丝发达，菌丝密集较粗，初生菌丝为白色，7d左右菌落呈现浅黄色，菌落边缘整齐，厚薄均匀。老化的菌丝呈现褐色且稀薄，可生长到培养皿盖。光学显微镜下可清楚观察到菌丝隔膜结构，近分支处有一锁状凸起，分枝呈锐角，顶端具椭圆形或近球形孢子；生长10d左右的菌丝可见菌环结构。根据菌落、显微形态特征及分子测序结果将其鉴定为假鬼伞属小脆柄菇。

下述实施例均以实施例1中的假鬼伞属小脆柄菇菌为共生萌发材料。

实施例2，一种假鬼伞属真菌促进杜鹃兰种子萌发的方法，具体步骤如下：

（1）用小脆柄菇菌株和杜鹃兰种子作为共生萌发材料；

（2）配置共生萌发培养基：所用培养基为燕麦粉琼脂培养基（oma，4g/l燕麦粉，8g/l琼脂，ph自然）。将配好的培养基121℃灭菌20min后备用；

（3）对杜鹃兰种子灭菌：将成熟杜鹃兰蒴果表面经75%乙醇消毒30s，无菌水冲洗3次后，拨开果壳，抖出种子用无菌滤纸包裹，再经75%乙醇消毒30s，无菌水冲洗3次，接着用1%次氯酸钠消毒3min，无菌水冲洗5次，备用；

（4）将冷却至45℃的oma培养基倒入直径为9cm无菌培养皿，每皿约20ml，待其凝固后，在表面铺上中央有孔的无菌滤纸，孔径为1cm。用无菌棉签蘸取种子均匀涂布于滤纸上，再将纯化真菌菌丝接种于滤纸中央孔中，用封口膜将培养皿封好，在22℃的培养箱中培养即可。

实施例3，一种假鬼伞属真菌促进杜鹃兰种子萌发的方法，具体步骤如下：

（1）用假鬼伞属小脆柄菇菌株和杜鹃兰种子作为共生萌发材料；

（2）配置共生萌发培养基：所用培养基为燕麦粉琼脂培养基（oma，4g/l燕麦粉，8g/l琼脂，ph自然）。将配好的培养基118℃灭菌20min后备用；

（3）对杜鹃兰种子灭菌：将成熟杜鹃兰蒴果表面经75%乙醇消毒30s，无菌水冲洗3次后，拨开果壳，抖出种子用无菌滤纸包裹，再经75%乙醇消毒30s，无菌水冲洗3次，接着用1%次氯酸钠消毒3min，无菌水冲洗5次，备用；

（4）将冷却至40℃的oma培养基倒入直径为9cm无菌培养皿，每皿18ml，待其凝固后，在表面铺上中央有孔的无菌滤纸，孔径为1cm。用无菌棉签蘸取种子均匀涂布于滤纸上，再将纯化真菌菌丝接种于滤纸中央孔中，用封口膜将培养皿封好，在22℃的培养箱中培养即可。

实施例4，一种假鬼伞属真菌促进杜鹃兰种子萌发的方法，具体步骤如下：

（1）用假鬼伞属小脆柄菇菌株和杜鹃兰种子作为共生萌发材料；

（2）配置共生萌发培养基：所用培养基为燕麦粉琼脂培养基（oma，4g/l燕麦粉，8g/l琼脂，ph自然）。将配好的培养基124℃灭菌20min后备用；

（3）对杜鹃兰种子灭菌：将成熟杜鹃兰蒴果表面经75%乙醇消毒30s，无菌水冲洗3次后，拨开果壳，抖出种子用无菌滤纸包裹，再经75%乙醇消毒30s，无菌水冲洗3次，接着用1%次氯酸钠消毒3min，无菌水冲洗5次，备用；

（4）将冷却至50℃的oma培养基倒入直径为9cm无菌培养皿，每皿22ml，待其凝固后，在表面铺上中央有孔的无菌滤纸孔径为1cm。用无菌棉签蘸取种子均匀涂布于滤纸上，再将纯化真菌菌丝接种于滤纸中央孔中，用封口膜将培养皿封好，在22℃的培养箱中培养即可。